一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用.pdf

1、10申请公布号CN101942021A43申请公布日20110112CN101942021ACN101942021A21申请号201010226871722申请日20100715C07K19/00200601G01N33/576200601G01N33/56920060171申请人中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所地址100850北京市海淀区太平路27号三所72发明人修冰水张贺秋王国华宋晓国陈堃冯晓燕何竞凌世淦杨锡琴54发明名称一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用57摘要本发明公开了一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用。具体公开了一对含有丙型肝炎病毒HCV膜区的

2、型别特异性嵌合抗原序列，还公开了利用该抗原进行丙型肝炎病毒血清中分型检测的方法。本发明主要采用免疫酶联检测技术，无需病毒基因的提取，可操作性强。含膜区嵌合抗原的使用较以往单抗原能提高HCV血清的分型率，本发明的检测结果与基因检测具有较好的一致性。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表4页附图2页CN101942026A1/1页21一种丙型肝炎病毒HCV的1B、2A型别特异性的多表位嵌合抗原，其特征在于，所述1B型别抗原E1区段包含氨基酸序列1、3、5，同时所述2A型别抗原E1区段包含氨基酸序列2、4、6，即，1YEVRNVSGVYHVTND

3、CSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH所述1B型别抗原NS4区段包含氨基酸序列7，同时所述2A型别抗原NS4区段包含序列8，即，7VVAPDKEVLYEAFDEM8AIIPDREVLYQEFDEM所述1B型别抗原C区段包含氨基酸序列9，同时所述2A型别抗原序列10，即，9KARRPEGRTWAQPGY10KDRRSTGKSWGKPGY。2一种利用如权利要求1所述抗原进行丙型肝炎病毒HVC血清分型检测的应用。

4、权利要求书CN101942021ACN101942026A1/6页3一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用技术领域0001本发明涉及一种丙型肝炎病毒血清型检测技术，具体地说涉及一种丙型肝炎特异性抗原以及采用酶联免疫技术检测丙型肝炎病毒血清型特异性抗体的方法。背景技术0002丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV是引起输血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原，主要通过输血、静脉吸毒传播，也可通过密切接触和母婴传播。目前全世界约有17亿HCV感染者。一般地，1520左右的HCV感染者为自限性感染，超过8085的感染者发展为慢性丙型肝炎，其中又有20的可发展为肝纤维化，最终有45的

5、肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。0003HCV基因组全长9400NT，共编码C、E1、E2、NS3、NS4、NS5等蛋白。目前，慢性丙型肝炎主要治疗方案是干扰素加利巴韦林联合治疗。治疗前应进行HCVRNA基因分型1型和非1型和血中HCVRNA定量，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量。因此，HCV基因型的检测在慢性丙型肝炎的治疗中具有重要作用。0004由于HCV基因组具有极高的变异性，根据选择的区段的不同，不同学者采用不同的HCV分型方法，命名也不尽相同。一般说，国际上通常采用的分型方法有两种，一种是SIMMONDS基因分型法，主要是采用测序法分析NS5区222BP的变异情况，将

6、HCV基因型分为1A、1B、1C、2A、2B、2C、3A、3B、4A、5A、6A等6个主要的基因型和11个亚型，伴随大量新HCV基因的克隆测序工作的进行，目前，HCV已经发现有30多个亚型；另一种是OKAMOTO基因分型法，主要采用型特异性引物扩增C区基因，根据扩增片断的长度，将HCV分为IIV四个主要的基因型。不同分型方法之间有一定的关联性，象SIMMONDS确定的1B亚型相当于OKAMOTO分型的II型；而2A亚型相当于III型。除此以外，对E1区的测序分析可以正确的区分I/1A、II/1B、III/2A、IV/2B、2CV、3A、4A、4B、4C、4D、5A、6A共12种不同的基因型或亚

7、型。临床研究显示1B型HCV感染者IFN疗效较差，而2A型感染者IFN敏感性较好。来自流行病学的研究显示，在我国，1B、2A两种亚型感染率接近97，因此，如何区分1B、2A感染在我国临床HCV治疗中具有独特的重要作用。0005目前，对HCV基因分型的方法除了序列分析法外，还增加了型特异性引物PCR扩增法、型特异性探针杂交法、限制酶切多态性分析等方法，尽管后续方法降低了测序费用及缩短了检测时间，但仍需要HCV基因提取等过程，一般实验室难以开展。另外，当HCVRNA阴性或由于保存不当及处理过程中HCVRNA遭到破坏时，则不能进行基因分型。0006鉴于上述情况，有些学者提出了血清学分型，即筛选HCV

8、各基因型特异性抗原表位，合成相应多肽，采用间接酶联免疫技术，根据患者体内型特异性抗体的存在情况，进行HCV的血清学分型。目前，日本学者根据不同HCV基因型中C区氨基酸序列的差异，人工合成2条多肽，血清1型多肽代表OKAMOTO分型的I和II型SIMMONDS分型的1A、1B，血清2号多肽代表OKAMOTO分型的III和IV型SIMMONDS分型的2A、2B，基于C区的血清分型与基因分型具有较高的符合率，但分型率只有45，但具有很高的特异性；基于NS4血清分说明书CN101942021ACN101942026A2/6页4型试剂可以检测16型，分型率为83；与基因分型的符合率为87，目前，MURE

9、X已经推出NS4血清分型的商品化试剂，但价格昂贵，且结果判断复杂。0007造成血清分型率低的原因主要在于单独使用C区、NS4抗原进行血清学分型，其抗体检出率偏低。事实上，HCV感染者体内针对HCV病毒产生的抗体情况十分复杂，存在针对多个不同区的抗体，因此，HCV诊断通常通过采用多抗体联合诊断的手段提高HCV抗体的检出率。而近些年对膜区E1、E2抗原的研究进展，超过90以上的HCV慢性感染者体内都存在针对膜区的抗体，但由于E1、E2抗原难以大量纯化，直接影响膜区抗体在HCV检测中的应用，也影响其在HCV血清分型中的进一步应用。0008C区型别特异性抗原表位的位置主要位于6581AA区间，但不同研

10、究中选择的序列并不相同，缺少进一步核实；NS4型别特异性抗原表位的位置并不固定，其大体范围位于16901711范围类，有1521个氨基酸组成，尚需要对其型别特异性表位进行精确分析。而关于膜区型别特性抗原的鉴定至今未见报道。0009为了提高HCV血清分型的分型率，本研究在对C、NS4、E1型别特异性抗原表位进行分析鉴定的基础上，利用基因序列拼接技术，克隆表达含有C、NS4、E1三个区段的融合型别特异性抗原，并再此基础上采用双孔测试酶联法对HCV血清进行分型。发明内容0010为了解决HCV基因分型技术难以用于临床的目的，本发明提供一种建立在免疫酶联检测技术基础之上的HCV血清分型技术。为了提高HC

11、V血清分型的分型率，本发明公开了一种基于嵌合多区段型别特异性抗原进行多表位HCV血清分型的方法，克服了原有技术中单独使用C区、NS4抗原造成的检出率偏低的问题。本发明除了对现有HCV血清分型通常采用的C、NS4型别特异性抗原表位进行分析鉴定外，还增加了对E1型别特异性抗原表位筛选，利用基因序列拼接技术，克隆表达含有C、NS4、E1三个区段的嵌合型别特异性抗原，并在此基础上建立多表位HCV血清分型技术，提高HCV血清分型的分型率。0011本发明提供一种丙型肝炎病毒HCV的1B、2A型别特异性的多表位嵌合抗原，其特征在于，所述1B型别抗原E1区段包含氨基酸序列1、3、5，同时所述2A型别抗原E1区

12、段包含氨基酸序列2、4、6，即，00121YEVRNVSGVYHVTNDCSNS00132VEVRNISSSYYATNDCSNN00143PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA00154QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT00165IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT00176TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH0018所述1B型别抗原NS4区段包含氨基酸序列7，同时所述2A型别抗原NS4区段包含序列8，即，00197VVAPDKEVLYEAFDEM00208AIIPDREVLYQEFDEM0021所述1B型别抗原C区段包含氨基酸序列9，同时所述2A型别抗原序列10，

13、即，00229KARRPEGRTWAQPGY说明书CN101942021ACN101942026A3/6页5002310KDRRSTGKSWGKPGY。0024本发明还提供一种一种利用如上所述抗原进行丙型肝炎病毒HVC血清分型检测的方法，利用所述1B型别抗原和2A型别抗原分别形成抗原包被酶联板，并进一步分别形成HCV1B孔板条和2A孔板条，将待测HCV血清分别加入两孔内，利用间接ELISA法检测HCV血清于上述两种抗原的反应性，根据每份血清与HCV1B和2A抗原孔反应的OD比值判断HCV的血清型，当OD1B/OD2A之间的比值大于等于1肝炎病毒血清型为1B型，否则为2A型。0025本发明是建立

14、在对HCV膜区抗原表位和分子进化分析的基础上0026目前，HCV血清分型试剂中主要采用的是C区和NS4区型别特异性抗原，在至今未见对HCVE1区型别特异性抗原的报道。本发明在对HCV膜区抗原表位进行生物信息学分析的基础上，筛选主要的抗原表位区间；进一步采用分子进化的方法对上述抗原序列进行同源比较，筛选其中的主序列，并通过血清学检测验证筛选表位的抗原性。0027同时，本发明发明是建立在含有HCV联合多区段型别特异性嵌合抗原基础之上。0028目前国际上广泛采用的HCV分型检测试剂均是建立在单抗原检测的基础上，其试剂盒包被抗原只有C区或NS4区中的一种，由于感染者对HCV不同区段的抗体的产生情况并不

15、相同，因此，采用单一抗原对HCV型别特异性抗体进行检测存在检出率低的问题。故本发明采用基因融合的方法，将C、NS4、E1区进行多表位嵌合表达，在此基础上建立HCV血清分型技术，获得较单一抗原检测更高的血清分型率。0029本发明首先利用生物信息学软件分析丙型肝炎病毒E1、NS4区型别特异性抗原表位，并利用多序列比较分析其中的共同序列，作为型别特异性抗原表位；由于C区型别特异性表位明确，可直接采用多序列比较分析获得其型别特异性抗原即可。HCVC、NS4、E1三个区段的1B、2A型别特异性抗原其氨基酸序列如序列1序列10所示。0030采用合成肽技术合成上述E1抗原表位，分别包被酶联板，采用30分阳性

16、血清对其抗原表位的抗原性进行分析，选择其中高抗原活性的E1多肽。0031将1B及2A型别特异性抗原按C、E1、NS4区的顺序进行串联后，采用大肠杆菌优势密码子获得嵌合1B、2A型别特异性抗原基因序列，采用退火延伸PCR法获得嵌合1B、2A型别特异性抗原基因，插入PGEX4T2载体。测序法鉴定阳性克隆，并保存菌种。大量培养后，IPTG诱导后，采用亲和层析法和葡聚糖凝胶法纯化相应的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序列分别如序列表中序列11、12所示，即003211AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY003312VVAPDKEVLYEAFDE

17、MVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY0034以上述嵌合抗原包被酶联板，检测每份HCV血清与1B及2A型别特异性抗原，根据OD1B与OD2A的双孔测试的比值判断HCV的血清型。0035实验结果证明，本发明所提供的HCV的血清分型检测试剂能正确检测34份1B血清中29份，16份2A血清中的9份，仅有2份1B血清和3份2A血清未进行分型，总体分型率达到90，正确率为85，均高于活接近国外报道。显示HCV的血清分型检测试剂具有较高的正确率和分型率，在我国HCV临床治疗评价具有一定的应用价值。说明书CN101942021ACN101942026A4/6页6附图说明003

18、6图1是HCVE1区序列的抗原表位的生物信息学分析0037图2HCVNS4区序列的抗原表位的生物信息学分析0038图3HCV纯化重组表位抗原SDSPAGE鉴定结果具体实施方式0039以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。0040本发明是通过以下技术方案得以实现的0041用生物信息学软件对HCV抗原E1、NS4区表位进行预测，确定E1、NS4区主要的抗原表位的氨基酸位置；采用分子进化软件对比抗原序列，获得相应的1B、2A型别特异性序列；由于C区抗原表位明确，直接采用分子进化软件分析其型别特异性抗原即可。利用合成多肽和30份HCV内质控血清对上述多肽的抗原性进行鉴定，选择其中高抗原活性的E1多

19、肽，并按C、E1、NS4区的顺序串联1B、2A型别特异性嵌合抗原。0042本发明为了有利于1B、2A型别特异性嵌合抗原基因在ECOLI中获得高效的表达，选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成嵌合抗原基因；为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入BAMHI和ECORI两个酶切位点，以适合表达载体PGEX4T2参见中国专利ZL001006959表达载体PBVIL1及其构建方法和用途。双酶切后插入载体PGEX4T2中，构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。0043HCV1B、2A型别特异性嵌合抗原表达质粒，转化ECOLIHB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDSPAGE鉴定

20、，证明各表达质粒均已获得了高效的表达，再经采用亲和层析及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的HCV1B、2A型别特异性嵌合抗原纯品。用ELISA检测HCV感染者血清与上述2种抗原与之间的反应性，并根据每份血清与HCV1B、2A型别特异性抗原之间双孔测试的比值判断HCV的血清型。0044步骤1、HCV型别特异性抗原表位的选择0045我们通过生物信息学软件对HCVE1区序列的抗原表位进行预测，结果如图1所示，含有192207AA、292312AA和310331AA共3个主要的抗原区段，采用CLUSTALW18MULTIPLESEQUENCEALIGNMENT对比获得其型别特异性序列分别如如下序列1序列6

21、所示。0046通过生物信息学软件对HCVNS4区序列的抗原表位进行预测，结果如图2所示，其抗原表位主要位于16931708AA，采用CLUSTALW18MULTIPLESEQUENCEALIGNMENT对比获得其型别特异性序列分别如序列7和序列8所示；C区抗原表位主明确位于6581AA，直接采用CLUSTALW分析其型别特异性抗原序列如序列9和序列10所示。0047序列110如下所示00481YEVRNVSGVYHVTNDCSNS00492VEVRNISSSYYATNDCSNN00503PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA00514QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT00525

22、IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT00536TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH说明书CN101942021ACN101942026A5/6页700547VVAPDKEVLYEAFDFM00558AIIPDREVLYQEFDEM00569KARRPEGRTWAQPGY005710KDRRSTGKSWGKPGY0058采用合成肽技术合成上述HCVE1区6条型别特异性多肽，包被酶联板，0059步骤2、HCV1B、2A型别特异性嵌合多表位抗原的克隆与表达00601HCV1B、2A型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建006111HCV1B、2A型别特异性嵌合多表位抗原基因的合成0062

23、根据上述HCV1B、2A型别特异性嵌合多表位抗原的氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。006312HCV1B、2A型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建0064121PCR产物及表达载体PGEX4T2双酶切0065取以上合成基因产物及PGEX4T2表达载体各30L分别放于EEPPENDORF离心管中，各加入10BUFFERH4L、BAMHI10U/L和ECORI12U/L各1L，加灭菌蒸馏水至40L，置37水浴酶切过夜。0066酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收PCR产物及载体PBVIL1经双酶切后，用12琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按分子克隆

24、科学出版社，第二版的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于EEPPENDORF离心管中，各加入S1液，置55水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。0067122连接于灭菌EEPPENDORF离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1L、10T4DNALIGASEBUFFER1L、T4DNALIGASE12U/UL1L，加灭菌蒸馏水至10L，置16过夜。0068123转化在超净工作台中，用无菌吸头取100L感受态细胞感受态细胞按分子克隆科学出版社

25、，第二版的方法进行悬液于EPPENDORF中，加入上述连接物5L，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42水浴中放置2分钟，每管加入05MLLB培养基不加抗生素，30水浴摇床培养60分钟后，各取02ML分别涂于LB琼脂培养基平皿上含抗生素，室温晾干后，置37恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中5ML/管，培养过夜，次日各取01ML转移到LB中2ML/管，32培养3小时，42水浴摇床中诱导培养4H，收菌，用SDSPAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。00692抗原的表达与纯化007021表达菌株的培养取70保存的表达菌株20L接种于LB培养基中100MLLB/500

26、ML三角瓶，30空气摇床培养过夜，次日按5的比例转种于LB培养基同上，30空气摇床培养约3小时，当OD600值达到07时，立即将培养瓶转到42水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000RPM离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。007122提取包涵体将沉淀称湿重，用10倍体积的20MMOL/LPH80TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶1MG/ML悬液，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次说明书CN101942021ACN101942026A6/6页8超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8，1,2000RPM，离心20分钟，弃上清，沉淀用1MOL/LNACL用TE配制洗一次，

27、再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲用PH80TE配制溶解，加1巯基乙醇。再于20，1,2000RPM，离心10分钟，去沉淀取上清。007223纯化将上述溶解的包涵体溶液过QSEPHAROSEFF阴离子交换柱，用平衡液PH80，20MMOL/LTE含6MOL/L脲，01巯基乙醇清洗后，用不同浓度的NACL用平衡液配制洗脱，收集各洗脱峰，经SDSPAGE鉴定，收集005MOL/LNACL洗脱峰。再过SEPHARDEXG50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDSPAGE鉴定，结果如附图3。0073步骤3嵌合HCV1B、2A多表位抗原在血清分型检测中的应用0074分别采用嵌合H

28、CV1B、2A多表位抗原包被酶联板，形成HCV1B孔板条和2A孔板条，将待测HCV血清分别加入两孔内，利用间接ELISA法检测HCV血清于上述两种抗原的反应性，根据每份血清与HCV1B和2A抗原孔反应的OD比值判断HCV的血清型。当OD1B/OD2A之间的比值大于等于1为1B型，否则为2A型。0075采用上述方法对34份HCV1B和9份2A血清进行血清分型，结果如表1所示HCV的血清分型检测试剂能正确检测中29份HCV1B血清和9份HCV2A血清，仅有2份1B血清和3份2A血清未进行分型，总体分型率达到9045/50，正确率为8538/45，均高于或接近国外报道，提示本发明提出的HCV的血清分

29、型检测试剂具有较高的正确率和分型率，在我国HCV临床治疗评价具有一定的应用价值。0076表1HCV抗体分型检测0077说明书CN101942021ACN101942026A1/4页9序列表0001中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所0002一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用000312000410005190006PRT0007人类0008000910010TYRGLUVALARGASNVALSERGLYVALTYRHISVALTHRASNASPCYS00111510150012SERASNSER0013001420015190016PRT0017人类00180019200

30、20VALGLUVALARGASNILESERSERSERTYRTYRALATHRASNASPCYX00211510150022SERASNASN002330024220025PRT0026人类0027002830029PROGLYHISVALSERGLYHISARGMETALATRPASPMETMETMETASN00301510150031TRPSERPROTHRTHRALA0032200033003440035220036PRT0037人类序列表CN101942021ACN101942026A2/4页100038003940040GLNGLYHISILETHRGLYHISARGMETALA

31、TRPASPMETMETLEUASN00411510150042TRPSERPROTHRLEUTHR0043200044004550046210047PRT0048人类0049005050051ILEVALSERPROGLNHISHISTRPPHEVALGLNGLUCYSASNCYSSER00521510150053ILETYRPROGLYTHR0054200055005660057210058PRT0059人类0060006160062THRPHESERPROARGARGHISGLUTHRVALGLNASPCYSASNCYSSER00631510150064ILETYRPROGLYHIS00

32、65200066006770068160069PRT0070人类0071007270073VALVALALAPROASPLYSGLUVALLEUTYRGLUALAPHEASPGLUMET0074151015007500768序列表CN101942021ACN101942026A3/4页110077160078PRT0079人类008080081ALAILEILEPROASPARGGLUVALLEUTYRGLNGLUPHEASPGLUMET00821510150083008490085150086PRT0087人类0088008990090LYSALAARGARGPROGLUGLYARGTHRT

33、RPALAGLNPROGLYTYR009115101500920093100094150095PRT0096人类00970098100099LYSASPARGARGSERTHRGLYLYSSERTRPGLYLYSPROGLYTYR010015101501010102110103500104PRT0105人类01060107110108ALAILEILEPROASPARGGLUVALLEUTYRGLNGLUPHEASPGLUMET01091510150110TYRGLUVALARGASNVALSERGLYVALTYRHISVALTHRASNASPCYS01112025300112SERASNSE

34、RLYSALAARGARGPROGLUGLYARGTHRTRPALAGLNPRO01133540450114GLYTYR011550序列表CN101942021ACN101942026A4/4页1201160117120118500119PRT0120人类01210122120123VALVALALAPROASPLYSGLUVALLEUTYRGLUALAPHEASPGLUMET01241510150125VALGLUVALARGASNILESERSERSERTYRTYRALATHRASNASPCYS01262025300127SERASNASNLYSASPARGARGSERTHRGLYLYSSERTRPGLYLYSPRO01283540450129GLYTYR013050序列表CN101942021ACN101942026A1/2页13图1图2说明书附图CN101942021ACN101942026A2/2页14图3说明书附图CN101942021A