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1、10申请公布号CN101962663A43申请公布日20110202CN101962663ACN101962663A21申请号201010527464X22申请日20101102C12P13/0620060171申请人天津科技大学地址300222天津市泰达开发区13大街29号72发明人陈宁白亚磊徐庆阳谢希贤刘淑云54发明名称一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法57摘要一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法。解决现有生产工艺产酸量较低且糖酸转化率低等问题。本发明包括利用本实验室产异亮氨酸的菌株，以一些营养组分按一定比例配制成营养丰富且均衡的培养基作为发酵培养基，发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶。
2、氧控制在适当的水平上，通过流加液氨控制PH，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，发酵至60H停止。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，缩短了整个发酵周期，并大幅提高了L异亮氨酸的产量28G/L以上和转化率18以上，整个工艺过程操作简便，生产成本较低，十分适合于工业化生产。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页CN101962664A1/1页21一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法，包括种子培养和进行好氧发酵，其特征是发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，使整个发酵过程既不产生较多乳酸，也不导致由于。
3、TCA循环流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制PH，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，使整个发酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60H停止。2根据权利要求1所述的方法，采用的温度为2832。3根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的发酵液的溶氧浓度为分阶段控制023H为1030，2360H为520。4根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵液中各组分占总量的百分比为接种量1020，葡萄糖812，NH42SO0408，玉米浆115，豆饼水解液335，MGSO47H2O0102，FESO47H2O00020003，M。
4、NSO400020003，KH2PO40102，VB100001000002，VH000001000002。权利要求书CN101962663ACN101962664A1/3页3一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法0001【技术领域】本发明涉及一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。0002【背景技术】L异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种分支链氨基酸之一，能治疗神经障碍、食欲减退和贫血，在人类生命代谢中占有特别重要的地位。但由于目前L异亮氨酸价格昂贵，因此主要用于配制复合氨基酸制剂，特别应用于高支链氨基酸输液如3H输液等及口服液肝安干糖浆等。故而，异亮氨酸在医药。
5、、食品方面都有着广泛的应用。目前国际上日本在生产L异亮氨酸方面占垄断地位，合计年产量400500吨。鉴于L异亮氨酸生产的高难度，L异亮氨酸一直是高价氨基酸，国际市场医药级价格高达6080美元/KG。国内由于菌种产酸性能差、工艺落后，L异亮氨酸产量低，绝大部分依靠进口，尤其是医药级异亮氨酸，每年消耗大量外汇。与日本相比较，我国的L异亮氨酸生产水平还很低下，而且异亮氨酸的生产能力与我国巨大的市场需求也很不相称。异亮氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，L异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的只有发酵法。由于化学合成法生产的L异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而未能实现工业。
6、化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。目前，异亮氨酸发酵的生产技术还不成熟。人们都在为提高异亮氨酸产量和转化率方面做努力，主要集中在基因工程手段定向选育异亮氨酸高产菌株、发酵过程控制与优化等方面。0003在异亮氨酸发酵过程中，发酵条件如生物素、碳源、氮源、无机盐、PH、温度及溶氧等对异亮氨酸的合成都具有重要影响。其中，底物如葡萄糖浓度是控制菌体代谢过程的一个重要参数，主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以。
7、葡萄糖为碳源的异亮氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如乳酸的积累，从而影响糖酸转化率。此外，溶氧也是一个至关重要的因素，杂酸的产生和碳架的浪费与溶解氧浓度密切相关。因此在发酵过程中必须控制合适溶氧，以改变代谢流分布，增大L异亮氨酸产率，减少杂酸的生成。0004目前，我国异亮氨酸发酵行业主要采用补料分批发酵模式。在这种生产模式中，维持一定的底物如葡萄糖浓度对于异亮氨酸的发酵非常重要。为达到经济技术的要求，要提高单批次发酵过程中的谷氨酸产量就要提高初始培养基中的底物如葡萄糖浓度，但底物如葡萄糖浓度过高引起渗透压过大，影响菌体的正常代谢及异亮氨酸的产量。反之，初始葡萄糖浓度较低有利于。
8、菌体的生长，但后期发酵液中的残糖迅速耗尽，其生产能力不能得到最大限度的发挥。与此同时，在目前的生产模式中，溶氧浓度往往不能得到很好的控制，不是供氧不足就是供氧过量，而且溶氧水平浮动很大，不能长时间稳定的维持在一个恰当的水平上。在溶氧过低的条件下，TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累；而溶氧过高时，TCA循环流量加大，生成大量CO2，造成碳源损失，两种情况均不利于异亮氨酸生成。此外，现有的很多L异亮氨酸发酵培养基配方都不能很好的最大限度去满足其相应生产菌株的生长说明书CN101962663ACN101962664A2/3。
9、页4代谢和产酸要求。0005【发明内容】本发明的目的在于克服现有的异亮氨酸生产方法发酵产酸量较低、糖酸转化率低等缺陷，提供一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法。在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L异亮氨酸产量和转化率的提高。0006本发明的目的是通过如下技术方案实现的0007本发明提供的一种高效发酵生产L异亮氨酸的方法，包括种子培养和进行好氧发酵，其特征是发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，使整个发酵过程既不产生较多乳酸，也不导致由于TCA循环流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制PH，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加一。
10、定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在一定水平，使整个发酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60H停止。0008该方法的具体步骤如下00091培养种子配制种子培养基葡萄糖3、酵母粉05、硫酸铵05豆饼水解液25、玉米浆3、KH2PO43H2O02、MGSO47H2O008，121灭菌15MIN；将菌种接入种子培养基中，接种量一般为5；在适宜的温度、PH和溶氧条件下于5L自动控制发酵罐中培养至对数期。00102好氧发酵将步骤1制得的种液以1020接种量接种发酵，分段控制发酵液温度045H为31，4660H为28；通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧020H为25，2。
11、060H为15；通过自动流加液氨控制PH在7072；通过流加适量泡敌消泡；并通过流加浓度为500800G/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0820，发酵至60H停止。0011本发明的优点和积极效果0012与现有工艺相比，本发明的方法具有以下特点00131、本发明通过适当流加较高浓度的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在恰当水平，使整个发酵过程中既不因葡萄糖浓度过高而引起渗透压过大且产生“葡萄糖效应”阻遏分解代谢物，也不因葡萄糖浓度过低而构成底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度的发挥；00142、本发明通过适当调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧浓度控制在恰当的水平上，使整个发酵过程中。
12、既不因溶氧浓度过低导致TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累，也不因溶氧浓度过高导致TCA循环流量加大生成大量CO2而造成碳源的大量流失；00153、本发明在与现有生产工艺相比不增加任何额外设备和人力投入的情况下，缩短了整个发酵周期，发酵周期培养缩短至5660H，并大幅提高了L异亮氨酸的产量28G/L以上和转化率18以上，整个工艺过程操作简便，生产成本较低，经济效益显著，十分适合于工业化生产。【具体实施方式】0016实施例10017使用的微生物菌种为现有异亮氨酸生产菌。将菌种接入种子培养基葡萄糖说明书CN10196266。
13、3ACN101962664A3/3页53、酵母粉05、硫酸铵05、豆饼水解液25、玉米浆3、KH2PO43H2O02、MGSO47H2O008。用NAOH和盐酸调PH至7072，121灭菌15MIN中，接种量为5；在31、PH为70和溶氧为20条件下于5L自动控制发酵罐中培养15H至对数生长中后期，按10的接种量接入含有发酵培养基葡萄糖8、硫酸铵04、玉米浆1、豆饼水解液3、MGSO47H2O01、FESO47H2O0002、MNSO4H2O0002、KH2PO401、VB1000001、VH000001。用NAOH和盐酸调PH至7072，115灭菌15MIN的5L自动控制发酵罐中，分段控制发。
14、酵液温度045H为31，4660H为28，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧020H为25，2060H为15，通过自动流加液氨控制PH在7072，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为500G/L的葡萄糖溶液将残糖控制在08，发酵至60H停止。L异亮氨酸的产量为289G/L，糖酸转化率为183。0018实施例20019使用的微生物菌种为现有异亮氨酸生产菌。将菌种接入种子培养基同实施例1中，接种量为5；在31、PH为70和溶氧为20条件下于5L自动控制发酵罐中培养15H至对数生长中后期，按15的接种量接入含有发酵培养基葡萄糖10、硫酸铵06、玉米浆12、豆饼水解液33、M。
15、GSO47H2O015、FESO47H2O00025、MNSO4H2O00025、KH2PO4015、VB10000015、VH0000015。用NAOH和盐酸调PH至7072，115灭菌15MIN的5L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度31，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧020H为25，2060H为15，通过自动流加液氨控制PH在7072，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800G/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0820，发酵至60H停止。L异亮氨酸的产量为296G/L，糖酸转化率为194。0020实施例30021使用的微生物菌种为现有异亮氨酸生产菌。将菌种接入种子。
16、培养基同实施例1中，接种量为5；在31、PH为70和溶氧为20条件下于5L自动控制发酵罐中培养15H至对数生长中后期，按20的接种量接入含有发酵培养基葡萄糖12、硫酸铵08、玉米浆15、豆饼水解液35、MGSO47H2O02、FESO47H2O0003、MNSO4H2O0003、KH2PO402、VB1000002、VH000002。用NAOH和盐酸调PH至7072，115灭菌15MIN的5L自动控制发酵罐中，分段控制发酵温度045H为31，4660H为28，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧020H为25，2060H为15，通过自动流加液氨控制PH在7072，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800G/L的葡萄糖溶液将残糖控制在20，发酵至60H停止。L异亮氨酸的产量为318G/L，糖酸转化率为205。说明书CN101962663A。