针对微生物生长调节生物量.pdf

本发明涉及改善使用木质素纤维素生物量作为营养来源的微生物过程产率的方法。该方法包括用包含酚氧化酶的酶组合物调节包含木质素纤维素生物量的组合物。经调节的组合物可支持过程中微生物的更高生长速率。在一个实施方案中，使用漆酶组合物调节衍生自非木本植物如玉米和甘蔗的木质素纤维素生物质。本发明还包括培养对木质素纤维素生物量中抑制化合物敏感的微生物的方法。本发明还提供了通过在经调节的木质素纤维素生物量中培养生产微生物来制备产物的方法。

1.  用于制备包含木质素纤维素生物量的组合物的方法，所述木质素纤维素生物量针对微生物生长被调节，所述方法包括提供包含木质素纤维素生物量的组合物、将所述组合物与包含酚氧化酶的酶组合物接触一段时间，所述时间足以调节所述组合物，其中相对于包含未与所述酶组合物接触的木质素纤维素生物量的组合物而言，在所述经调节组合物中培养的微生物的生长速率提高。

2.  培养微生物的方法，所述方法包括将包含木质素纤维素生物量的组合物与包含酚氧化酶的酶组合物接触一段时间，所述时间足以针对微生物生长调节所述组合物，并在所述经调节的组合物中培养所述微生物，其中相对于包含未与所述酶组合物接触的木质素纤维素生物量的组合物而言，在所述经调节组合物中培养的所述微生物的生长速率提高。

3.  用于制备产物的方法，所述方法包括：在包含针对微生物生长被调节的木质素纤维素生物量的组合物中培养产生产物的微生物，并从所述微生物和/或所述被调节的组合物中回收所述产物，其中所述被调节的组合物已与包含酚氧化酶的酶组合物接触一段时间，所述时间足以调节所述组合物，并且其中相对于包含未与所述酶组合物接触的木质素纤维素生物量的组合物而言，在所述经调节组合物中培养的所述微生物的生长速率提高。

4.  权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述木质素纤维素生物量包含未进行化学预处理的木质素纤维素生物量。

5.  权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述木质素纤维素生物量包含木质素纤维素生物量的水解产物。

6.  权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述木质素纤维素生物量包含非木本的木质素纤维素生物量。

7.  权利要求6的方法，其中所述非木本木质素纤维素生物量为玉米秸秆或甘蔗渣。

8.  权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述酚氧化酶为漆酶。

9.  权利要求8的方法，其中所述漆酶是葡萄穗霉属物种的漆酶或木霉属物种的漆酶。

10.  权利要求2或3的方法，其中所述微生物是木霉属物种。

11.  权利要求3的方法，其中所述产物是酶。

12.  权利要求11的方法，其中所述酶是纤维素酶。

13.  权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述木质素纤维素生物量是未经化学预处理的玉米秸秆，所述酶组合物包含由第一木霉属物种或葡萄穗霉属物种产生的漆酶，且在所述组合物中培养的所述微生物是第二木霉属物种。

14.  权利要求13的方法，其中所述第一木霉属物种是Trichodermapiluliferum，所述第二木霉属物种是里氏木霉，所述产物是纤维素酶。

针对微生物生长调节生物量
1.与相关申请交叉参考
本申请要求于2007年1月3日提交的题为“针对微生物生长调节生物量(Conditioning Biomass for Microbial Growth)”的美国临时申请序列号No.60/878,616的权益和优先权，所述美国临时申请完整引入本文作为参考。
2.政府支持
本工作的部分根据与美国能源部(U.S.Department of Energy)的主合同号No.DE-AC36-99GO 10337下的副合同号No.ZCO-30017-01，由国家可再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory)提供资金。因此，美国政府对本发明具有某些权利。
3.引言
本发明涉及改善使用木质素纤维素生物量作为营养来源的微生物过程的产率的方法。
4.发明背景
近几年中，在将生物量转化为作为燃料的乙醇方面取得了长足的发展。迄今为止，由生物量产生的大部分乙醇在美国以玉米葡萄糖的发酵为基础，在巴西以甘蔗蔗糖的发酵为基础。主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的生物量作为重要的可再生能源来源吸引了越来越多的注意力。林业和农业残余物是丰富和相对廉价的。如果该材料或至少其可观的部分能够被转化为液体染料，则这会构成显著的贡献，从而解决再循环和保护资源的问题。
乙醇可由诸如木材和农作物残余物的木质素纤维素材料产生。木质素纤维素的纤维素和半纤维素组分可以被水解释放单糖，所述单糖随后被转化为乙醇。然而，难以开发出将纤维素材料转化为可发酵糖的经济学可行的方法。使用木质素纤维素生物量制造乙醇和其他产物的研究被广泛评述，见例如Lin and Tanaka(2006Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642)和Saha(2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30：279-291)。
木质素纤维素是比淀粉和糖复杂得多的底物。限速并困难的任务之一是去除木质素。另外，植物组织在尺寸和构成上差异显著。一些植物细胞种类具有厚细胞壁和高度木质化的胞间层，将细胞彼此隔开。这些细胞壁必须通过次生壁从腔内表面(luminal surface)被攻击(attack)(与纯纤维素颗粒相反，所述纯纤维素颗粒从外向内被降解)。除了由纤维素自身结构形成的限制外，其他限制由纤维素水解剂到攻击位点的扩散和转运引起。因此，在水解纤维素之前，对大部分木本材料进行预处理，使得结构内的纤维素纤维更适合和容易水解。
已经观察到，抑制性物质如呋喃、有机酸和多种酚类化合物的存在使得自木材的水解产物到乙醇的发酵变得困难。这类抑制化合物在木材中木质素降解和复杂多糖的水解期间形成或释放。木质素纤维素水解产物中有毒化合物的种类及其浓度取决于用于水解的原材料和操作条件。这类有毒化合物可显著降低糖的有效利用和乙醇的产生。
已经用云杉生物量的水解产物测试了大量生物、物理和化学解毒方法(Larsson等，1999，Appl.Biochem.Biotechnol.77-79，91-103)。U.S.7,067,303公开了真菌Coniochaeta ligniaria减少水解产物中呋喃的用途。一种称为“超施石灰(overliming)”的常用方法涉及最初用碱(例如氢氧化钙或氨水(ammonia))将pH调节至10-11，然后用酸(例如硫酸或磷酸)将pH调节至5.0-6.0。必须小心控制用碱解毒的条件，以优化积极效果并最小化可发酵糖的降解。碱解毒效应背后的机制和阳离子选择与条件选择的影响尚未被充分理解(Nilvebrant等，2003，Appl Biochem Biotechnol.105-108：615-28；Persson等，2002，J Agric Food Chem.50(19)：5318-25)。尽管超施石灰非常有效，但是其导致了不溶的沉淀物，所述沉淀物保留在随后的步骤中并且必须被去除和处理，引起废料和提高的成本。
解毒方法的有效性是可变的，因为每种水解产物具有不同程度的毒性，且每种微生物物种或甚至微生物的菌株具有对抑制剂的不同程度的耐受。因此，使用来自不同来源和不同微生物的水解产物时，不同的解毒方法不能被严格地比较。(Mussatto和oberto，2004，Bioresour Technol.93(1)：1-10；Palmqvist和Hahn-Hagerdal，2000，Bioresour Technol.74：25-33；Palmqvist和Hahn-Hagerdal，2000，Bioresour Technol.74：17-24)。
尽管许多研究的关注点指向将木材水解产物解毒用于乙醇发酵，但是木质素纤维素生物量作为原料用于其他生物技术过程的用途是相对未经探索的。例如，由于多种工业中对纤维素酶的提高的需求，所以清楚地存在对下述新方法的需要，所述方法提高真菌例如里氏木霉(Trichodermareesei)的纤维素酶产生，使得能够更加经济地获得纤维素酶。
即便是在乙醇产生的背景中也存在下述迫切需要：改善将木质素纤维素转化为糖再转化为乙醇的多种不同途径的经济性和效率。
5.发明概述
本发明涉及改善使用木质素纤维素生物量作为营养来源的微生物过程产率的方法。具体地，本发明提供了制备下述组合物的方法，所述组合物包含针对微生物生长被调节的木质素纤维素生物量。这样的组合物可以被用作微生物过程原料中的组分。该方法包括将包含木质素纤维素生物量的组合物与包含酚氧化酶的酶组合物接触一段时间，所述时间足以中和组合物中存在的抑制化合物。被调节的组合物可以支持生产微生物物种的生长速率，所述生长速率高于用未与酶组合物接触的木质素纤维素生物量组合物获得的生长速率。在一个实施方案中，酶组合物包含漆酶。在一个实施方案中，木质素纤维素生物量衍生自非木本植物，如玉米和/或甘蔗。在一个实施方案中，酶组合物包含漆酶，且木质素纤维素生物量选自玉米秸秆(corn stover)和甘蔗渣。
本发明还包括培养下述微生物的方法，所述微生物对木质素纤维素生物量中存在的某些抑制化合物敏感。在一个实施方案中，包含木质素纤维素生物量的组合物与包含酚氧化酶的酶组合物接触一段时间，所述时间足以针对微生物生长调节组合物。然后使用被调节的组合物作为培养微生物的原料的组分。或者将酶组合物直接添加至下述过程中，其中在包含木质素纤维素生物量的培养基中培养微生物。在任一情况下，相对于包含未与所述酶组合物接触的木质素纤维素生物量的组合物而言，被调节的组合物中微生物的生长速率和/或微生物生物量产率被提高。
本发明还包括在使用木质素纤维素生物量作为营养来源的微生物中制备产物的方法。该方法通常涉及在包含木质素纤维素生物量的组合物中培养产生产物的微生物，所述木质素纤维素生物量针对微生物生长被调节。可从微生物和/或被调节的组合物中回收产物。如上所述，通过用酚氧化酶处理来调节组合物，使得相对于未经调节的组合物而言，可从被调节组合物获得的微生物的生长速率提高。在某些实施方案中，被培养的微生物是木霉属物种，产物是纤维素酶。
6.附图概述
图1.经漆酶处理的培养物的生长。图表显示在初始包含2％玉米秸秆和10g葡萄糖/升的培养基中，三天周期间生长的里氏木霉培养物对葡萄糖的消耗。不同线条和图例符号显示了所示天数(1、2、3天)中多种培养物的葡萄糖浓度，所述培养物是使用用指定浓度(0U/ml，0.125U/ml，0.25U/ml，0.5U/ml)的Trichoderma piluliferum漆酶处理的培养基。对照培养物未用漆酶处理(0U/ml)。
7.发明详述
本发明着眼于木质素纤维素生物量中抑制性物质的问题，所述抑制性物质可不利地影响使用木质素纤维素生物量作为营养来源的微生物培养物的性能。本发明涉及在许多种种类过程中改善作为微生物生长营养来源的木质素纤维素生物量利用的方法。
本发明涉及用包含一种或多种酚氧化酶的酶组合物处理或调节下文定义的木质素纤维素生物量。不旨在受任何理论或机制的束缚，一些抑制剂是在木质素分解期间被释放的酚类化合物，并且相信本发明的酚氧化酶催化这类酚类化合物的氧化偶合，形成不溶的聚合物。本发明中酚氧化酶的用途区别于使用酚氧化酶作为解毒剂，以帮助其他酶降解生物量。本发明提供的益处是改进的微生物生长。
与本发明的酶组合物接触后，针对微生物生长被调节的木质素纤维素可直接用于微生物过程或进行进一步加工。用本发明的酶组合物处理可减轻使用木质素纤维素生物量作为原料组分时的下述问题：降低的生存力和/或缓慢的生产微生物生长以及低产率。与超施石灰相比，使用本发明方法时产生很少或不产生废料。
本发明认为酶组合物可被用于调节未经预处理的木质素纤维素以及预处理的木质素纤维素。如章节7.1中所详述，本发明中可使用大量未经处理的木质素纤维素。本发明的酶组合物可有利地被用于降低预处理步骤的长度，或甚至略过预处理步骤。术语木质素纤维素生物量包括未经处理和经预处理的含木质素纤维素的材料。经预处理的木质素纤维素也可用于本发明中。具体地，本发明提供了酚氧化酶调节非木本的木质素纤维素生物量(如玉米秸秆和甘蔗渣)或相应水解产物的用途，使得被调节的生物量更适合支持微生物的生长。在本发明的某些方面，排除从白腐真菌(白腐菌(Trametes versicolor))分离的经纯化的漆酶和经纯化的木质素过氧化物酶处理木材水解产物用于乙醇发酵的用途。
用酶组合物对木质素纤维素生物量的处理进行一段时间，所述时间足以降低木质素纤维素生物量中抑制性酚类化合物的浓度。该处理可与随后的加工步骤分开进行。在一个实施方案中，用酶组合物对木质素纤维素生物量的处理可以与生产微生物的生长同时进行。在本发明的另一实施方案中，在引入生产微生物之前进行处理。在其他实施方案中，可在预处理木质素纤维素之后进行所述处理。经调节的木质素纤维素生物量和包含它的组合物可被储藏以便将来使用。因此，本发明提供了制备用于培养微生物的原料的方法，其中针对微生物生长用本发明的酶组合物调节的木质素纤维素生物量被用作原料的组分。
在另一实施方案中，可在生产微生物的培养期间直接添加酶组合物。可在过程期间一次添加酶组合物，例如在过程开始时，在抑制性化合物被释放的阶段，在向培养物中添加生产微生物的阶段，或在生产微生物的生长将要最大化的阶段添加。在其他实施方案中，可通过一种或多种生产微生物菌株制备酶组合物，所述生产微生物菌株天然或重组地制造酶并将其分泌进培养物中。
酶组合物包含至少一种酚氧化酶。如章节7.2中所详述，酚氧化酶可以是由真菌产生，优选由丝状真菌产生，最优选由子囊菌纲(ascomycete)真菌产生的漆酶。酚氧化酶可以是多种形式，例如但不限于结晶形式、固定化的形式、真菌培养物滤液和真菌细胞提取物。
与除了使用未经调节的木质素纤维素以外的相同的过程相比，酶组合物的使用改善了过程的一个或多个方面。例如，可改善生物反应器中微生物生长的动力学或过程具体阶段单位时间中微生物生物量的获得。在多个实施方案中，所关注的过程被用于制备产物如染料、日用化学品、精细化学品、酶、药物中间产物等。因此，本发明还包括制备期望的产物的方法，所述方法涉及在经调节的木质素纤维素生物量中培养产生期望的产物的微生物，并从该过程中回收期望的产物。本发明可应用的过程种类的详述在章节7.3中提供。
为了公开的清晰性，并且不以限制的方式，将本发明的详述分为下文的小节。
6.1.木质素纤维素生物量
本发明中可使用多种植物生物量。最丰富的植物生物量是木本和非木本植物叶和茎中的木质素纤维素。木质素纤维素由包埋在木质素中具有不同结晶度的异质缠绕(heterogeneous intertwined)的纤维素链、半纤维素和果胶组成。通常，纤维素含量在约35％到50％植物干重的范围内，且半纤维素和木质素分别包含20％到35％，以及5％到30％的植物干重。
本文使用术语“木本的木质素纤维素”是指包含木本的植物中存在的木质素纤维素，木本是形成木本植物茎和根主体的次生木质部组织。次生木质部由维管形成层形成，并存在于(i)松柏类(Coniferae)和(ii)除单子叶植物外的被子植物(Angiospermae)中。许多松柏类植物是高大的树，这类树的次生木质部已知为针叶材(softwood)。许多非单子叶被子植物是树，并且这些树的次生木质部已知为阔叶材(hardwood)。次生木质部也存在于裸子植物麻藤门(Gnetophyta)和银杏门(Ginkgophyta)成员中，并以更少的程度存在于苏铁门(Cycadophyta)的成员中。
来自木本植物的木质素纤维素应当包括果树修枝、丛林(chaparral)、粉碎机废料(mill waste)(如树皮、木片、刨花、锯屑等等)、城市木材废料(如丢弃的家具、木托盘、板条箱、树和刷子装饰物(brush trimming)等)、城市废料(例如报纸和丢弃的杂货产品)、伐木业废料和森林间苗(树冠、树枝和剔除材料(cull material))、短期轮作木本作物如白杨和棉白杨，和工业废料(如木浆渣、来自木浆(pulp)的亚硫酸盐废液)。
术语“非木本木质素纤维素”是指衍生自单子叶植物，特别是属于禾本科的草本物种的植物生物量。主要感兴趣的是禾本科农业残余物；即带谷物植物在收获种子后剩余的部分。非木本木质素纤维素生物量包括但不限于小麦秆、燕麦秆、稻秆、大麦秆、黑麦秆、亚麻秆、甘蔗渣、玉米秸秆、玉米叶柄(stalks)、玉米芯、玉米秕等等。还包括在该定义内的是常规不针对农业目的培养的草，如草原草(prairie grasses)(例如大蓝茎草(bigbluestem)、小蓝茎草(little bluestem)、印度草(Indian grass))、柳枝稷(switchgrass)、鸭茅状磨擦禾(gamagrass)和狐尾草。
被认为是植物生物量并含有木质素纤维素的其他农业副产品包括来自作物材料商业加工的废料流组分(如甜菜浆、柑橘水果浆、种子壳等等)、有纤维素的动物废料、草坪修剪废物(lawn clippings)和海藻。
含木质素纤维素的植物材料可以被物理修饰，例如通过切丝、压碎、研磨、磨粉或浸泡修饰。含木质素纤维素的植物材料也可以被浸渍在水中，浸渍在热水(即高于室温，例如约40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃、99℃，在正常大气压下或高于大气压)中，暴露于蒸汽或过热水，或进行蒸汽爆破(steam explosion)。在一个实施方案中，含木质素纤维素的植物材料未用酸和/或碱化学预处理。
术语“预处理”或“化学预处理”可互换使用，表示将木质素纤维素从其天然形式(其中其通常对纤维素酶作用有抗性(recalcitrant))转化为酶水解有效和/或有效率的形式。术语“水解产物”或其变通形式在本文中用于表示已经过预处理的任何前述木质素纤维素，从而使材料中至少部分木聚糖和纤维素溶解并释放糖单体。预处理的非限制性实例包括，在存在或不存在稀硫酸时进行蒸汽爆破，或消和石灰处理(即用水消化(slake)氧化钙，形成氢氧化钙)。
本文中使用术语“木质素纤维素”是指未经化学预处理的任何前述含木质素纤维素的植物材料。术语“木质素纤维素生物量”是指任何前述含木质素纤维素的植物材料，其为天然形式、经物理修饰的形式(例如通过切丝或磨粉)、水处理或蒸汽处理的形式、或是化学预处理后的形式，所述形式会使其适合用作培养微生物的原料。木本木质素纤维素生物量和非木本木质素纤维素生物量分别来自木本植物和非木本植物。通常，木质素纤维素生物量作为若干营养组分之一存在于组合物如原料中。
在可获得的农业副产品中，玉米秸秆是美国最丰富的非木本木质素纤维素。玉米秸秆包括谷物收获后剩余的茎、芯、外皮和叶。可通过关闭玉米联合收割机上的撑板(spreader)和/或切碎机(chopper)并通过常规干草打包设备拣起剩余物，容易地完成秸秆的收集。玉米秸秆中约40％的干物质是纤维素。蒸汽预处理从固体材料中去除大部分半纤维素，并使得纤维素对酶消化更敏感。蒸汽预处理期间可使用反应温度、时间和pH的不同组合，例如200℃、5分钟、2％H₂SO₄。蒸汽爆破后的液体可用于使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵。在一个实施方案中，以干燥的原始形式使用玉米秸秆。在其他实施方案中，也可使用经酸洗和/或水洗的玉米秸秆。
另一丰富的非木本木质素纤维素是甘蔗残余物例如甘蔗渣，其为将甘蔗茎压碎提取其汁液后的纤维性残余物。在巴西，由甘蔗制备乙醇燃料，甘蔗是比玉米更有效的可发酵糖类来源。甘蔗渣已被用作燃料用于进行发酵过程。本发明认为甘蔗渣和/或其水解产物在通过本发明的方法调节后也可以被用作培养微生物的营养来源。在一个实施方案中，甘蔗渣是未经预处理的干燥的原始形式。在其他实施方案中，使用经酸洗和/或水洗形式的甘蔗渣。
任何上述木质素纤维素生物量都可以直接用于微生物过程中，或被用于制造包含木质素纤维素生物量的组合物，如原料。在某些实施方案中，未经化学预处理的木质素纤维素生物量是优选的，因为酸或碱预处理产生抑制微生物过程的化合物。
7.2酶组合物
本发明提供了下述酶组合物用于调节木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物的用途，所述酶组合物包含至少一种酚氧化酶。本文使用术语“酚氧化酶”是指通过催化氧化还原反应发挥作用的酶，即将来自电子供体(通常为酚类化合物)的电子转移至分子氧(其发挥电子受体的作用)，所述分子氧被还原为水。这类酶的实例为漆酶(EC 1.10.3.2)、胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)、酚氧化酶(EC 1.14.18.1)、儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)。本发明的酚氧化酶能够使用多种不同的酚类化合物作为电子供体，同时对作为电子受体的分子氧或过氧化氢非常特异。
许多酚氧化酶在酸性pH范围内显示最适pH，但是在中性或碱性pH下是失活的。可优选使用其最适pH落入木质素纤维素生物量pH范围内的酚氧化酶。酚氧化酶已知由多种真菌产生，所述真菌包括曲霉属(Aspergillus)、脉孢霉属(Neurospora)、柄孢壳属(Podospora)、灰霉属(Botytis)、侧耳属(Pleurotus)、木霉属(Trichoderma)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、层孔菌属(Fomes)、射脉菌属(Phlebia)、栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)和香菇属(Lentinus)的物种。
在一个实施方案中，由木霉属物种或肉座菌属(Hypocrea)物种产生的酚氧化酶可用于本发明的方法中。木霉属物种、菌株和天然隔离群，和这类物种、菌株和隔离群的衍生物，包括Trichoderma piluliferum、里氏木霉、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。Trichoderma piluliferum物种的菌株可从土壤样品中分离，并由J.Webster和Rifai，M.A.1969，Myco.Pap.116：16描述；也见美国专利号No.6,475,566(也已知为Hypocreapilulifera)。在一个实施方案中，酚氧化酶由在木材底物上生长的任何真菌产生。在一个实施方案中，使用可制备酚氧化酶的任何子囊菌纲(Ascomycetes)真菌。
本发明漆酶基因的来源可以是植物、微生物、昆虫或哺乳动物漆酶。在一个实施方案中，漆酶是真菌漆酶。例如，漆酶可以是丝状真菌漆酶，如来自如下生物的漆酶：枝顶孢霉属(Acremonium)、蘑菇属(Agaricus)、壳单孢属(Amerosporium)、Antrodiella、蜜环菌属(Armillaria)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、双极霉(Bipolaris)、烟管菌属(Bjerkandera)、下皮黑孔属(Cerrena)、毛壳菌属(Chaetomium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Cryphonectria、弯孢霉属(Curvularia)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、迷孔菌属(Daedalea)、Filibasidium、层孔菌属、镰孢菌属(Fusarium)、地霉属(Geotrichum)、粘帚霉属(Giocladium)、球托霉属(Gongronella)、Halosarpheia、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属、乳菇属(Lactarius)、香菇属、Magnaporthe、丛梗孢属(Monilia)、Monocillium、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、革耳属(Panus)、青霉属(Penicillium)、Phanerochaete、木层孔菌属(Phellinus)、射脉菌属、Pholiota Piromyces、侧耳属、柄孢壳属(Podospora)、密孔菌属(Pycnoporus)、Pyricularia、硬孔菌属(Rigidoporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、裂褶菌属(Schizophyllum)、小核菌属(Sclerotium)、Scytalidium、粪壳属(Sordaria)、侧孢霉属(Sporotrichum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、栓菌属(Trametes)(多孔菌属(Polyporus))、Vereticiluum、Zalerion、鲜壳孢属(Zythia)、木霉属物种；或来自假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia物种的酵母漆酶。更特别地，漆酶可以是灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、Myceliophthora thermophila、长绒毛栓菌(Trametes villosa)(薄盖大孔云芝(Polyporus pinsitus))、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的漆酶或嗜热色串菌(Scytalidium thermophilum)漆酶。
在另一个实施方案中，漆酶是植物漆酶。例如，漆酶可以是漆树、芒果、绿豆、桃子、松树、洋李(prune)、或悬铃木(sycamore)漆酶。还在另一实施方案中，漆酶是昆虫漆酶。例如，漆酶可以是家蚕(Bombyx)、丽蝇(Calliphora)、Diploptera、果蝇(Drosophila)、Lucilia、Manduca、家蝇(Musca)、Oryctes、Papilio、黑花蝇(Phorma)、红猎蝽属(Rhodnius)、麻蝇属(Sarcophaga)、蝗虫(Schistocerca)或Tenebrio漆酶。
在另一实施方案中，漆酶优选为细菌漆酶。例如，漆酶可以是Acer、醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线菌属(Actinomyces)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、盐杆菌属(Halobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属(Streptomyces)、大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沃镰菌属(Wolinella)或甲基营养菌的漆酶。更特别地，漆酶是生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)漆酶。
在另一个实施方案中，由葡萄穗霉属物种产生的酚氧化酶可用于本发明的方法中。葡萄穗霉属物种、菌株和天然隔离群，以及这些物种、菌株和隔离群的衍生物包括：物种Stachybotrys parvispora的菌株，尤其包括Stachybotrys parvispora var.hughes MUCL 38996；物种纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的菌株，尤其包括纸葡萄穗霉MUCL 38898；S.parvispora MUCL 9485；纸葡萄穗霉MUCL 30782；坎帕拉葡萄穗霉(S.kampalensis)MUCL 39090；S.theobromae MUCL 39293；和物种S.bisbyi、柱孢葡萄穗霉(S.cylindrospora)、S.dichroa、S.oenanthes和S.nilagerica的菌株。
漆酶(苯二酚：氧氧化还原酶；E.C.1.10.3.2)是催化酚类氧化的含铜的酶。漆酶介导的氧化从酚类底物产生芳氧基中间产物，这导致二聚体到多聚体反应产物的形成。在一个实施方案中，本发明的酶组合物包含如美国专利6,426,410(也参见美国专利号No.6,168,936和6,905,853)中公开的葡萄穗霉属物种的漆酶。在另一实施方案中，本发明的酶组合物包含Trichoderma piluliferum的漆酶。
可通过本领域已知的任何方法测定漆酶活性，如在530nm处监测丁香醛连氮的氧化，在528nm处光度计监测10-(2-羟乙基)-吩噁嗪(HEPO)的氧化，或2，2′-连氮双-(3-乙基苄噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的氧化。例如，将60μl丁香醛连氮储存溶液(50％乙醇中0.28mM)和20μl漆酶样品与0.8ml预处理的Britton-Robinson缓冲溶液混合，并在20℃下孵育。在5分钟期间于530nm下监测氧化，并将活性表述为每分钟被氧化的微摩尔丁香醛连氮″SOU″(″SOU″)。参见Childs等(1975，Biochemical Journal145：93-103)和Bauer等(1971，Analytical Chemistry 43：421-425)。
在一个实施方案中，如果已知酶的氨基酸序列，则可以通过本领域公知的合成技术容易地制备一种或多种本发明的酚氧化酶。
在另一实施方案中，可以通过培养产生酚氧化酶的生物(包括真菌、细菌和植物)制备本发明的酚氧化酶。优选地，在培养期间，产生酚氧化酶的生物细胞外分泌酚氧化酶。这允许通过例如将细胞物质与培养液分离(例如通过过滤或离心)来回收、分离和纯化酚氧化酶。得到的无细胞培养液可直接使用，或如果需要的话可首先将其浓缩(例如通过蒸发或超滤)。如果需要的话，可随后将酚氧化酶与无细胞发酵液分离，并通过常规方法分离至期望的纯度，例如通过柱层析，或甚至将其结晶。
在一个特定的实施方案中，产生酚氧化酶的生物是包含异源遗传材料的重组生物，所述异源遗传材料便于表达编码酚氧化酶的基因和/或产生酚氧化酶。异源遗传材料包括下述多核苷酸，所述多核苷酸编码显示苯酚氧化活性的氨基酸序列。关于核酸部分使用术语“异源的”时是指核酸包含两个或多个亚序列，所述亚序列通常不以与天然彼此关系相同的方式存在。
在本文中使用术语“功能性等价物”时，是指与章节8中例证的来自Trichoderma piluliferum的漆酶或美国专利6,426,410(也参见美国专利号No.6,168,936和6,905,853)中所述来自葡萄穗霉属物种的漆酶相比，能够显示基本相似的苯酚氧化活性或至少一种化学特征的多肽。本文使用术语“化学特征”是指酶作用的和/或酶进行的催化反应针对的底物或化学官能度。
除了本文教导的例证的漆酶DNA和蛋白质以外，本发明还考虑到同源或基本相同的酚氧化酶的使用。在两条多肽或核酸序列的背景中，术语“相同的”是指如使用以下“序列比较算法”之一所测量的，针对最大对应进行比对时两条序列中相同的残基。用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482
(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.MoI.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(GAP，BESTFIT，FASTA，和威斯康辛遗传学软件包中的TFASTA，Genetics Computer Group，575Science，Madison，Wis.博士)或通过目检来进行。两种酚氧化酶基本相似的另一个指征是第一种酶可与第二种酶免疫交叉反应。通常，差异在于保守氨基酸取代的酶是可免疫交叉反应的。因此，例如当两种酶差异仅在于保守取代时，酚氧化酶与第二酚氧化酶基本相似。
另外，本发明的方法还包括下述蛋白质和多肽，其为天然存在的酚氧化酶的功能性等价物。这类等价物酚氧化酶在已知酚氧化酶的氨基酸序列中可含有例如氨基酸残基的缺失、添加或取代。可基于涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质产生氨基酸取代。例如，非极性(即疏水)氨基酸残基可包括丙氨酸(Ala或A)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、缬氨酸(Val或V)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)和甲硫氨酸(Met或M)；极性中性氨基酸残基可包括甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)；带正电(即碱性)的氨基酸残基可包括精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)和组氨酸(His或H)；带负电(即酸性)的氨基酸残基可包括天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。
本领域技术人员应当明白，这类取代可在对分子功能关键性的区域之外发生，并仍然得到有活性的多肽。可以根据本领域已知的步骤，如位点定向诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定对本发明的分离的核酸序列编码的多肽活性是关键性的、并且因此优选地不进行取代的氨基酸残基(参见例如Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)。
对应于酶基因产物一个或多个结构域(例如信号序列、活性位点或底物结合结构域)、截短或缺失的酶(例如多肽，其中酶的一个或多个结构域被缺失)和融合酶(例如蛋白质，其中全长或截短或缺失的酶，或对应于一个或多个酶结构域的肽或多肽与不相关的蛋白质融合)的一个或多个结构域的功能等价多肽也在本发明的范围内。这类功能性等价物肽和多肽(也称作嵌合蛋白质或多肽)可由本领域技术人员以酶基因核苷酸和氨基酸序列为基础容易地设计。示范性的融合蛋白可包括，但不限于表位标签融合蛋白，其便于使用结合表位的试剂通过亲和层析分离酶基因产物。其他示范性融合蛋白包括与任何氨基酸序列的融合物，所述氨基酸序列例如允许融合蛋白被固定在固相上，从而允许酶在反应后被保留并再次使用。因此，本发明提供了下述融合蛋白，其包含与第二多肽融合的酚氧化酶片段。可产生上述其他酚氧化酶修饰，以产生例如更适合放大规模、更适合具体木质素纤维素生物量的pH环境等等的功能等价多肽。因此，本发明包括下述多肽的用途，所述多肽是酚氧化酶的功能等价物。
本发明包括酶组合物，其包含催化有效量的至少一种酚氧化酶，所述酚氧化酶被分离、纯化或富集到不同的程度，例如酚氧化酶之一可组成组合物中总蛋白质的约0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2％、5％、10％、20％、40％、50％、75％、80％、90％、95％、99％。例如测定漆酶活性的步骤是本领域中已知的，并包括例如氧化底物2，2′-连氮双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(″ABTS″)(参见Childs等，1975，Biochemical Journal145：93-103)或丁香醛连氮(参见Bauer等，1971，Analytical Chemistry 43：421-425)或使用2，6二甲氧基苯酚(参见Haars等，1981，EuropeanJournal of Forest Pathology，11(1-2)，67-76)或愈创木酚(参见Setti等，1999，Enzyme and Microbial Technology，25(3-5)，285-289)。
组合物中的酶可以是适合用于预期的木质素纤维素生物量的形式，并可含有额外的酶、稳定剂、防腐剂、蛋白酶抑制剂、洗涤剂、消泡剂等等。通常只有当酶可以重复使用许多次时，这些过程才是成本有效的。为了酶的重复使用，需要将酶与过程的主体分离。当酶与运载体或固相结合时这是可以实现的，所述运载体或固相可通过例如排水、过滤或离心被分离。如果底物流过固相表面，在所述固相表面上与酶接触时也可以实现酶与过程主体的分离。因此，本发明包括酚氧化酶的用途，所述酚氧化酶不仅以自由流动的可溶形式存在，而且也以固定化或固体形式存在。
在另一实施方案中，本发明的酚氧化酶以如上所述被纯化至不同程度的蛋白质的形式被固定。可使用以酶与固相的化学和物理结合为基础的任何已知的酶固定方法，所述固相例如为多糖、玻璃、合成的聚合物、磁性颗粒，其通常被能够共价偶联酶表面上氨基酸侧链的官能团(例如胺、羧基、环氧、苯基或烷)修饰。固相可以是多孔的，孔径在30到300nm范围内。对多孔支持物的离子和非离子吸附可以是一种简单并有效的固定方法。酶也可以被捕获或包封在聚合物凝胶、膜或经表面活性剂稳定的水性微滴中的微团中。针对指定酶的合适固定方法的选择取决于酶特征、过程需要、支持物特征和安全性问题，并可由本领域技术人员决定。酶的固定方法可参见例如Methods of Enzymology，第44卷，135、136和137，Academic Press，New York。因此，本发明包括使用包含一种或多种固相的酶组合物，其中具有催化活性的一种或多种酚氧化酶存在于所述固相上。
本发明还包括使用固体形式的酚氧化酶。制备固体形式酶的方法是本领域公知的，例如但不限于喷射造粒(prilling)(在蜡质材料中喷雾冷却)、挤压、团聚或制粒(用惰性材料和粘合剂稀释)。本发明考虑包含固体形式酚氧化酶的固体酶组合物，其为混合粉末、片剂等形式。
7.3生产微生物
根据本发明，被酚氧化酶调节的木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物可以被用作多种生物技术过程的营养来源。木质素纤维素生物量的调节促进生产微生物的生长速率，加速植物生物量到微生物生物量的转化。除了积累微生物生物量以外，在其他实施方案中，在木质素纤维素生物量中培养微生物的目的是获得由微生物产生的一种或多种产物。作为使用本发明酶组合物的结果，在某些实施方案中，不仅改善了该过程的动力学，而且提高了期望产物的产率。本文使用术语“生产微生物”是指下述微生物种类，其在微生物过程中产生期望的产物，或其自身是微生物过程的期望产物。该术语还包括在该过程中生长的微生物的任何后代。
使用木质素纤维素生物量作为营养来源的许多微生物过程可受益于本发明的方法，所述过程包括但不限于制备工业有用的酶的微生物过程，所述酶例如但不限于水解酶、氧化还原酶、异构酶、连接酶、裂合酶或转移酶。更优选地，所述酶为纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶)、鞣酸酶、氧化酶例如葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、植酸酶、β-半乳糖苷酶、蔗糖酶或转化酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶、漆酶、多聚半乳糖醛酸酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、漆酶、甘露糖苷酶、果胶分解酶、过氧化物酶、木糖异构酶和木聚糖酶。由微生物培养物产生的其他有用产物包括有机酸，例如但不限于柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、延胡索酸、苹果酸、乳酸和酒石酸；氨基酸，例如但不限于色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸；多糖，例如但不限于普鲁分支葡聚糖；脂质、核苷酸和维生素。由微生物培养物产生的其他有用产物包括醇，例如但不限于乙醇。由微生物培养物产生的其他有用产物包括葡萄糖，其随后可被另一微生物用于制备乙醇，或用作发酵底物来制备任何种类的基于微生物的产物。
生产微生物包括但不限于细菌和真菌，包括酵母。许多子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)因其纤维素分解酶和/或木材降解能力而被已知，并可使用木质素纤维素生物量作为营养来源。这类真菌包括但不限于属于胶鼓菌属(Bulgaria)、毛壳菌属(Chaetomium)和柔膜菌属(Helotium)(子囊菌纲)；革盖菌属(Coriolus)、Phanerochaete、卧孔属(Poria)、裂褶菌属和Serpula(担子菌纲)；和曲霉属、枝孢属(Cladosporium)、镰孢菌属、地霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、拟青霉属、青霉属和木霉属(Trichoderma)(半知菌纲)的物种。可使用木质素纤维素作为营养物的示范性物种包括但不限于木霉属或肉座菌属物种。在一个实施方案中，木霉属物种是里氏木霉。
若干不同的细菌组可在木质素纤维素生物量上生长：(i)发酵厌氧菌，通常为革兰氏阳性的(梭状芽孢杆菌(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和热解纤维素果汁杆菌属(Caldicellulosiruptor))，但是含有少量革兰氏阴性物种(丁酸弧菌(Butyrivibrio)和醋弧菌(Acetivibrio)、纤维杆菌(Fibrobacter))；(ii)需氧革兰氏阳性细菌(纤维单胞菌(Cellulomonas)和Thermobifida)；和(iii)需氧滑行细菌(噬纤维菌(Cytophaga)和生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga))。可使用木质素纤维素作为营养物的示范性细菌包括但不限于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)、食纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)和梭状芽孢杆菌(Clostridium josui)。
用于纤维素转化的微生物的开发根据两种策略进行。天然纤维素分解策略涉及天然存在的纤维素分解微生物，其改善产物的相关特性如产率和耐受。这类微生物可以是本发明的生产微生物，并且包括但不限于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绿色木霉(Trichoderma viride)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)的物种、曲霉属物种和拟青霉属物种。重组纤维素分解途径涉及改造显示高产率和耐受的非纤维素分解的微生物，使得它们由于异源纤维素酶系统而变得能够利用纤维素。这类微生物也可以是本发明的生产微生物，并且包括但不限于酿酒酵母、大肠杆菌和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。因此，本发明的方法可被用于改善微生物培养物的生长动力学和/或产率，所述微生物天然地表达纤维素酶或被遗传改造为表达异源纤维素酶，所述纤维素酶使得它们能够使用纤维素作为营养来源。
7.4本发明的方法
本发明提供了下述方法：用包含酚氧化酶的酶组合物处理木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物(例如包含其他营养物的原料)，使得相对于未用酶组合物处理的木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物而言，生产微生物在所述木质素纤维素生物量或所述组合物上的生长速率被提高。过程中生产微生物生长速率的提高可通过大量参数评价，例如但不限于营养物消耗、分解代谢物积累、pH、细胞量、细胞数等等。在本发明的多个实施方案中，用酶组合物处理提高培养物中微生物的初始生长速率，所述培养物中包含木质素纤维素生物量的组合物被用作营养来源。
在一个实施方案中，本发明提供了调节木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物的方法。该方法涉及将包含酚氧化酶的酶组合物与木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物接触。术语“接触”在本文中可与以下交换使用：引入、组合、添加、混合、经过、孵育、注射进、流过等等。本发明考虑到可使用如上所述的不同形式的酚氧化酶。调节或处理过程可在一段时间内发生，范围从1小时、2、5、10、15、24、36、48、60、72小时到4、5、6、7天，或直至木质素纤维素生物量的抑制活性被降低至可接受的水平，例如少于原始水平的1％、2％、5％、10％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。也可以通过测量由经调节的组合物支持的微生物生长速率的提高来确定接触的时间段，例如至少为原始速率的110％、120％、125％、130％、140％、150％、175％、200％、300、400％、500％或1000％。
优选地，接触步骤在酶显示大量或最优活性范围内的温度下进行。优选地，接触步骤在酶显示大量或最优活性的pH范围内进行。因此，本发明包括包含木质素纤维素生物量的组合物，其已被包含酚氧化酶的酶组合物处理或调节，以支持微生物生长。这类组合物可被用作原料或用作制造原料的组分。经调节的木质素纤维素生物量可被用作多种微生物过程的原料。在某些实施方案中，木质素纤维素生物量是组合物中唯一的营养来源或唯一碳源。在一个实施方案中，本发明提供了制造原料的方法，其包括用包含酚氧化酶的酶组合物与木质素纤维素生物量或包含木质素纤维素生物量的组合物接触，并向及经调节的木质素纤维素生物量中添加其他营养物和/或原料组分。在一些实施方案中，在微生物过程中使用组合物之前，从包含木质素纤维素生物量的组合物中去除酶组合物。在多种实施方案中，可使用一定范围的酶浓度调节原料，所述酶浓度例如从约0.0001g/1到约100g/1，例如但不限于0.001g/1、0.1g/1、1g/1、10g/1。在多种实施方案中，可使用一定范围的处理或调节持续时间，例如约15秒到约200小时，例如但不限于1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、36小时、72小时或96小时。在多种实施方案中，可在一定温度范围内进行处理或调节，例如在约15℃到约100℃下，例如但不限于10℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或处理或调节场所的室温。在多个实施方案中，处理或调节可以在一定pH范围内进行，例如在约pH 2到约pH 10中，例如但不限于约pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8或pH9。在一个实施方案中，该方法在pH 4.5到6.5的范围内进行。在另一实施方案中，pH为约4.5到5.5。
本发明还提供了在包含木质素纤维素生物量的培养基中培养生产微生物的方法，其中该方法包括将培养基与包含酚氧化酶的酶组合物接触。在另一个实施方案中，本发明提供了经调节的木质素纤维素生物量培养微生物的用途。本发明还提供了制备产物的方法，其中产物由生产微生物制备，所述生产微生物在包含经调节的木质素纤维素生物量的培养基中培养。这类方法包括在用包含酚氧化酶的酶组合物处理的培养基中培养生产微生物，并从培养基和/或微生物中回收产物。
本发明考虑到用于产生期望产物的微生物过程，其包括固体培养或浸没培养，包括分批、补料分批和连续流通的过程。培养在下述培养基中完成，所述培养基包含水性矿物盐培养基、有机生长因子、碳源材料、能源材料或其组合，以及要使用的一种或多种生产微生物物种的初始接种物。
考虑到本发明可应用于许多不同类型的过程以及复杂过程的不同阶段。复杂过程的一个实例是将木质素纤维素转化为糖然后转化为乙醇，该过程的不同阶段可涉及不同的微生物。
在将木质素纤维素转化为燃料和化学品的背景中，涉及以下的过程：(i)纤维素酶产生，(ii)纤维素和(如果存在的话)其他不溶多糖的水解(糖化作用)，(iii)可溶纤维素水解产物的发酵，和(iv)可溶半纤维素水解产物的发酵。在存在木质素纤维素生物量时通过培养微生物完成这些过程的情况下，本发明的酶组合物或经调节的木质素纤维素生物量可在一个或多个这些各个步骤中使用，以改善每步骤的微生物的生长动力学和/或产率。
这四个步骤可以独立地完成或以不同的组合结合。同时糖化和发酵(SSF)将水解和纤维素水解产物的发酵组合成一个过程步骤，纤维素酶产生和半纤维素水解产物的发酵则在两个额外的分离的过程步骤中发生。同时糖化和共发酵(SSCF)涉及两个过程步骤：纤维素酶产生和第二步骤，所述第二步骤中发生纤维素水解和纤维素与半纤维素水解产物二者的发酵。在组合的生物加工(CBP)中，组合了纤维素酶产生、水解和纤维素与半纤维素产物的发酵。根据本发明，酶组合物也可以用于这些组合过程中的一个或多个步骤中，以改善每一步骤的微生物生长动力学和/或产率。或者，经调节(先前用本发明的酶组合物处理)的木质素纤维素生物量可被用于这些组合过程中的一个或多个步骤中。
因此，在本发明的一个实施方案中，在制备纤维素酶的过程中可使用包含一种或多种酚氧化酶的酶组合物。可将所述酶组合物添加至产生纤维素酶的生产微生物的培养物中，所述培养物包含木质素纤维素生物量作为营养来源。本发明还可包括从培养物中回收纤维素酶。
在另一个实施方案中，在包含木质素纤维素生物量的培养物中培养微生物的过程中，可使用包含一种或多种酚氧化酶的酶组合物，其中所述微生物水解纤维素和其他不溶多糖，形成二糖和单糖。该过程可任选地包括回收二糖和单糖。
在另一个实施方案中，在包含木质素纤维素生物量的培养基中培养微生物的过程中可使用包含一种或多种酚氧化酶的酶组合物，其中所述微生物能够将糖(如二糖和单糖)转化为乙醇或其他低分子量化学品，如乙酸或乳酸。在另一个实施方案中，在培养下述微生物的过程中可使用包含一种或多种酚氧化酶的酶组合物，所述微生物能够将半纤维素转化为乙醇或其他低分子量化学品，如乙酸或乳酸。
在上述每个实施方案中，可以使用酶组合物处理包含木质素纤维素生物量的组合物，然后使用所述木质素纤维素生物量用于培养生产微生物，而不是在过程中直接使用酶组合物。
在多种实施方案中，在任何上述过程中使用的木质素纤维素生物量是衍生自木本植物的木质素纤维素、衍生自非木本植物的木质素纤维素、木质素纤维素的水解产物或木质素纤维素及其水解产物的混合物。
在本发明的某些实施方案中，用于制备乙醇的发酵过程中使用的木质素纤维素生物量不是木本的木质素纤维素生物量，如木材水解产物。在本发明的其他实施方案中，所述过程中使用的木质素纤维素生物量不是半纤维素水解产物。在某些实施方案中，能够在木本木质素纤维素生物量上生长并产生乙醇的生产微生物不是酿酒酵母菌株。在某些实施方案中，过程中使用的酶组合物不包含衍生自担子菌纲的漆酶，如衍生自白腐菌的漆酶。
在本发明的一个实施方案中，在同时糖化和发酵的过程中使用酶组合物。在另一个实施方案中，在同时糖化和共同发酵的过程中使用酶组合物。在另一个实施方案中，在组合的(consolidated)生物加工中使用酶组合物。在一个实施方案中，用于处理木质素纤维素生物量的酶浓度范围从约0.001g/1到100g/1。在一个相关的实施方案中，用于处理木质素纤维素生物量的酶浓度不少于约60g/1、约30g/1、约1g/1、约0.6g/1、约0.3g/1、约0.01g/1、约0.006g/1或约0.003g/1。
8.实施例
通过参考以下的非限制性实施例可更好地理解本发明，所述实施例仅作为本发明的范例提供。提供以下的实施例以更全面地阐述本发明的实施方案。然而，实施例不应被理解为限制本发明的更宽范围。
使用Trichoderma piluliferum漆酶，作为木质素纤维素生物量的未加工的玉米秸秆，和作为生产微生物的里氏木霉进行实验。
8.1材料和方法
里氏木霉酶的产生
如下制备里氏木霉RL-P37(见Sheir-Neiss等，在Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)，第46-53页中)的接种物：将摇瓶盛入(NH₄)₂SO₄(4g)、KH₂PO₄(4.5g)、MgSO₄-7H₂O(1g)、CaCl₂-2H₂O(1g)、NaCl(0.01g)、Mazu DF 2045滴/L(0.2ml)、pH 5.5，适量至897.5毫升。灭菌后添加100ml 50％葡萄糖和2.5ml里氏木霉微量元素溶液。每升里氏木霉微量元素溶液含有：柠檬酸(无水)175g、FeSO₄-7H₂O(200g)、ZnSO₄-7H₂O(16g)、CuSO₄-5H₂O(3.2g)、MnSO₄-H₂O(1.4g)、H₃BO₃(硼酸)(0.8g)。葡萄糖是浓度为10g/L的唯一碳源。在250ml烧瓶中以每50ml约一百万个RLP-37孢子接种培养物。将烧瓶在26-28℃下以150转/分钟培养3-5天，直到获得良好的生长。可通过用标准技术随时间测量pH和葡萄糖浓度来监测培养物的生长。在耗尽葡萄糖之前，可将真菌细胞采入接种瓶中，用于实验。
在该实验中，建立两组烧瓶，每个烧瓶含有如上文的相同培养基和2％原始玉米秸秆。含木质素纤维素的玉米材料已被粉碎，用水洗涤去除土壤和其他农业碎屑，然后晾干。外观是干草碎屑(dry grass clippings)的外观。将其以这种干燥形式添加进培养瓶中，并将烧瓶高压灭菌，从而在引入培养物之前将内容物灭菌。向一组烧瓶中添加来自Trichoderma piluliferum培养物的含漆酶的滤液的等分试样。使用三种不同的漆酶浓度，即0.125U/ml、0.25U/ml和0.5U/ml。
使用以下的实验步骤，以氧对ABTS(2，2′-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐))的氧化为基础，测量上清中酚氧化酶活性的存在。在小杯中混合ABTS(SIGMA，0.2ml，4.5mM H₂O)和NaOAc(1.5ml，在H₂O中120mM，pH 5.0)。通过添加适量的待测量制剂(在该实施例中是上清液稀释液)形成1.8ml终溶液，起始反应。然后使用分光光度计，每两秒钟通过记录420nm处的吸光度(OD)测量由ABTS氧化产生的颜色，总计测量14秒。该实施例中一个ABTS单位(一个酶单位或EACU)被定义为每分钟在420nm处测量的OD改变(不对样品进行稀释)。
对照组烧瓶缺乏漆酶。将烧瓶在30℃下孵育一天、两天或三天，之后用如上所述接种已培养了24小时的约一百万个RLP-37细胞。将含RLP-37细胞的两组烧瓶以100-250转/分钟在20-28℃下摇动培养多达72小时。通过测量培养基中的葡萄糖浓度监测两组培养物中里氏木霉的生长，所述葡萄糖浓度随着生长的真菌消耗葡萄糖而逐渐降低。
8.2结果
本实验的结果显示于图1中。降低的葡萄糖浓度指出真菌细胞的良好生长。在含下述培养基的烧瓶中获得最好的生长速率，所述培养基包含已被0.5U/ml漆酶调节至少两天的木质素纤维素生物量(2％玉米秸秆)。在两个烧瓶(用0.5U/ml调节2天和三天)中，在里氏木霉培养的第三天，烧瓶中所有的葡萄糖被耗尽。更低的漆酶剂量或更短的调节周期产生具有更慢生长的培养物。用0.25U/ml或0.125U/ml漆酶处理的烧瓶中的真菌消耗少于50％的葡萄糖，与调节的周期无关。未用漆酶处理的对照烧瓶显示最慢的生长。
9.等价物
本发明的范围不受所述特定实施方案限制，所述特定实施方案旨在单独阐述本发明的各个方面，功能上相当的方法和组分属于本发明的范围内。事实上，除本文所示和所述的以外，根据先前的说明书和附图，使用不超出常规的实验，本发明的多种变更对于本领域技术人员是显而易见的。这些变更和等价物旨在落入附带的权利要求书的范围内。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此引入说明书作为参考，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和分别引入本文作为参考一样。
本文对参考文献的引用和讨论不应被认为是承认其为本发明的现有技术。