一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法.pdf

本发明公开了一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，以尿苷或乳清酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过阶段性改变反应温度和溶氧量为手段，促使反应体系定向生物催化合成尿苷磷酰化合物。本发明可以根据需求生产三种物质的任意之一种，反应体系简单，无毒，生产成本低廉，控制手段简单易行，极大方便了工业化中的生产控制。以尿苷做底物时UMP、UTP和UDPG的得率分别可达到77％、67％、61％；以乳清酸做底物时UMP、UTP和UDPG的得率分别可达到70％，61％和53％。

1、  一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于以尿苷或乳清酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过阶段性改变反应温度和溶氧量为手段，促使反应体系定向生物催化合成尿苷磷酰化合物。

2、  根据权利要求1所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的尿苷磷酰化合物为尿苷酸(UMP)、尿苷三磷酸(UTP)或尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，其结构式如下：


3、  根据权利要求2所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于以尿苷为底物，在pH5～10的水溶液中进行如下三种反应之一，定向合成尿苷磷酰化合物：
(a)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应8～10小时，主要产物为UMP；
(b)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应8～10小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％，反应4～6小时，主要产物为UTP；
(c)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应8～10小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％，反应4～6小时；再调整温度至20～30℃，调整溶氧量为0～30％，反应4～8小时，主要产物为UDPG.。

4、  根据权利要求2所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于以乳清酸为底物，在pH5～10的水溶液中进行如下三种反应之一，定向合成尿苷磷酰化合物：
(a)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应16～20小时，主要产物为UMP；
(b)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应16～20小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％，反应8～10小时，主要产物为UTP；
(c)在25～35℃下，溶氧量60～120％，反应16～20小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％，反应8～10小时；再调整温度至20～30℃，调整溶氧量为0～30％，反应6～8小时，主要产物为UDPG.。

5、  根据权利要求1～4中任意一项所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于底物尿苷或乳清酸的加入量为5～200mM，磷酸盐的加入量为0.1～2M，葡萄糖的加入量为0.1～1M，微生物细胞的加入量为按湿菌体100～800g/L。

6、  根据权利要求1～4中任意一项所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的反应体系还加入氨离子、镁离子和钾离子中的任意一种或几种的组合物；Mg²⁺起始反应浓度为1～200mM；K⁺起始反应浓度为1～200mM；NH₄⁺起始反应浓度为1～200mM。

7、  根据权利要求1～4中任意一项所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的微生物细胞为能够利用尿苷或乳清酸合成尿苷酸并继续磷酰化的微生物，包括气杆菌属、埃希氏菌属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。

8、  根据权利要求7所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的微生物细胞为产氨短杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或白球拟酵母。

9、  根据权利要求1所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用如下方法进行处理而得：表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法，超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌法。

10、  根据权利要求1所述的定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用表面活性剂法或有机溶剂法处理而得；所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或阴离子表面活性剂，使用浓度为0.1～50g/L；所述的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1～50mL/L。

一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及利用调控技术分别定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法。
背景技术
尿苷酸(UMP)作为尿嘧啶的衍生物，是一重要的生化试剂，同时也是用量很大的医药中间体、婴儿食品添加剂和饲料添加剂，也是诸如尿苷三磷酸(UTP)、尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞苷三磷酸(CTP)、胞二磷胆碱(CDPC)等尿苷和胞苷磷酰化合物的合成前体，大量的药理学和临床学研究表明该类化合物在心脑血管、肝炎、糖尿病、抗病毒(SARS)及神经退化(帕金森症、阿滋海默症)等疑难疾病的治疗和辅助治疗等方面有着良好的临床效果，同时是合成寡糖以及其他生理活性物质的基础原料。
尿苷三磷酸(UTP)是三分子的磷酸结合在尿苷核糖5′-OH基上的核苷酸，分布广泛，是RNA合成的直接前体。与糖类代谢也有密切关系，由UTP与1-磷酸葡糖经酶催化可以生成UDP-葡萄糖与焦磷酸。UTP可以防治肺炎，治疗窦炎、纤毛运动障碍、中耳炎及支气管炎等疾病。另外，和腺苷三磷酸(ATP)一样，还可以作为细胞外信息分子(第一信使)激活细胞表面的P2受体，并通过细胞内第二信使系统调节多种生理反应，尤其是对心血管系统的生理及病理生理活动具有重要意义。
尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是体内最重要的糖基供体，可以促进肝脏解毒作用，治疗中毒性及传染性肝炎，具有重要的药物开发价值。UDPG第一次是以辅酶形式于1950年，由Leloir和他的同事在研究半乳糖向葡萄糖转化过程中发现的。UDPG不但可作为葡萄糖基供体，参与生物体内多种寡糖及多糖的合成，如海藻糖、蔗糖、淀粉、维生素的生物合成，而且还是合成其它核苷二磷酸单糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖酸、尿苷二磷酸木糖等的前体。
尿苷磷酰化合物即是对上述UMP、UTP、UDPG的总称。
UMP的生产有化学法合成、酶解法合成、发酵法合成和生物催化法合成。生物催化法合成核苷酸，就是利用微生物作为酶源，催化核苷酸的前体物质转化为核苷酸。日本协和发酵公司通过对菌种进行改良，利用尿苷酸前体物质乳清酸转化UMP，目前UMP的累积量高达28g/L(Fujio T，MaruyamaA..Biosci Biotech Biochem，1997，61(6)：956-959)国内只有上海师范大学和山东大学有该类化合物合成的报道，上海师范大学(钱秀萍，中国医药工业杂志，2006，37(12))采用了链霉素抗性、卡那霉素抗性和产物结构类似物抗性等作为筛选手段，对产氨短杆菌进行离子束和紫外诱变，选育出一株UMP生成能力较强的菌株，UMP的转化能力达到了2g/L，但与国际先进水平相差甚远。山东大学(Appl Microbiol Biotechnol 2007，76(2)321-328)通过对产氨短杆菌转化条件的优化使得UMP累积浓度达到了10g/L。
UTP目前主要利用微生物生物催化合成。Takeda I等(Takeda I.，Watarabe S.Stabilizing Nucleotides Derivatives.Japan.7,237,036，Sep 18.1972.)用酵母生物催化UMP合成UTP。UDPG的合成目前主要是化学法合成和酶法合成。
在酵母细胞中，尿苷可以在尿苷激酶的催化下合成UMP；乳清酸可以和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)在乳清酸磷酸核糖转移酶的作用下生成乳清苷酸(OMP)，然后OMP经乳清苷酸脱羧酶的催化生成UMP。然后UMP和ATP通过尿苷酸激酶转移一个磷酸基，转化为UDP和ADP；UDP则通过核苷二磷酸激酶，消耗ATP，继续磷酸化为UTP。UTP与1-磷酸葡糖经酶催化可以生成UDPG与焦磷酸。所以说酵母细胞中有分别催化尿苷和乳清酸合成UMP、UTP和UDPG的完整酶系。但是目前国内还没有生物催化尿苷或乳清酸合成UTP和UDPG的相关报道，也未见利用同一反应体系通过微调反应条件定向催化合成上述三种尿苷磷酰化合物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微生物细胞定向催化合成上述三种尿苷磷酰化合物的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的思路是：
以尿苷或乳清酸为底物，微生物细胞酶系为酶源，在一定反应体系下合成尿苷磷酰化合物。一般情况下，经过一段时间的反应，体系中可能会同时存在UMP、UTP和UDPG三种反应产物，但可以通过调控手段使反应向某一产物方向主导，从而获得浓度相对较高的某一产物，以降低分离负荷、减少成本。这便是本发明的关键所在。通过长期实验，我们发现上述的调控手段主要包括阶段性调整反应温度和溶氧量。
本发明的关键在于：
1.本发明采用了全细胞催化技术，直接利用了细胞的自有酶系催化尿苷或乳清酸合成三种尿苷磷酰化合物，可以根据需求生产三种物质的任意之一种，反应体系简单，无毒，生产成本低廉。
2.本发明通过阶段性控制反应温度和通氧量作为手段，影响尿苷化合物磷酰化过程中相关酶的活性。在不同的控制条件下，会使有利于合成一种物质的酶活性得到加强，同时有利于生成其他物质的酶活性则削弱，这种酶的活性的选择性决定了
反应不同的最终产物。控制手段简单易行，极大方便了工业化中的生产控制。
本发明采用的具体技术方案如下：
一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法，以尿苷或乳清酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过阶段性改变反应温度和溶氧量为手段，促使反应体系定向生物催化合成尿苷磷酰化合物。
其中，所述的尿苷磷酰化合物为尿苷酸(UMP)、尿苷三磷酸(UTP)或尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，其结构式如下：

其中，尿苷，即UR，结构式如下：

尿苷
其中，乳清酸，即OA，结构式如下：

乳清酸
若以尿苷为底物，在pH5～10的水溶液中(优选pH6～8)进行如下三种反应之一，可定向合成尿苷磷酰化合物：
(a)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至8～10小时，主要产物为UMP；
(b)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至8～10小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％(优选20～30％)，反应至4～6小时，主要产物为UTP；
(c)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至8～10小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％(优选20～30％)，反应至4～6小时；再调整温度至20～30℃，调整溶氧量为0～30％(优选5～20％)，反应至4～8小时，主要产物为UDPG。
若以乳清酸为底物，在pH5～10(优选pH6～8)的水溶液中进行如下三种反应之一，可定向合成尿苷磷酰化合物：
(a)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至16～20小时，主要产物为UMP；
(b)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至16～20小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％(优选20～30％)，反应至8～10小时，主要产物为UTP；
(c)在25～35℃下，溶氧量60～120％(优选70～100％)，反应至16～20小时；再调整温度至35～45℃，调整溶氧量为15～50％(优选20～30％)，反应至8～10小时；再调整温度至20～30℃，调整溶氧量为0～30％(优选5～20％)，反应至6～8小时，主要产物为UDPG.。
上述反应中，底物尿苷或乳清酸的加入量为5～200mM，优选50～100mM；磷酸盐的加入量为0.1～2M，优选0.2～0.8M；葡萄糖的加入量为0.1～1M，优选0.5～1M；微生物细胞的加入量为按湿菌体100～800g/L。
所述的反应体系还加入氨离子、镁离子和钾离子中的任意一种或几种的组合物；Mg²⁺可选自硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机盐，其起始反应浓度为1～200mM，优选5～50mM；K⁺起始反应浓度为1～200mM，优选10～40mM；NH₄⁺起始反应浓度为1～200mM，优选2～40mM。
所述的微生物细胞为能够利用尿苷或乳清酸合成尿苷酸并继续磷酰化的微生物，包括气杆菌属、埃希氏菌属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。所述的微生物细胞优选具有较强ATP再生活性的菌株，包括产氨短杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和白球拟酵母。
其中，所述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用如下方法进行菌体破壁处理而得，从而改变细胞膜的通透性具体包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法，超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌法。优选表面活性剂法或有机溶剂法；所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂(如聚环氧乙烷胺、曲拉通X-100)、阳离子型表面活性剂(如十六烷基三甲胺·溴化物)或阴离子表面活性剂(月桂酰·肌氨酸盐)，使用浓度为0.1～50g/L，优选1～20g/L的浓度使用，即表面活性剂法处理微生物细胞时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50g，优选加入1～20g；所述的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1～50mL/L，优选1～20mL/L的浓度使用，即有机溶剂法处理微生物细胞时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50mL，优选加入1～20mL。其它处理细胞透性的方法，如冻融法、超声波处理法、风干法等，采用先将菌株细胞处理后，再将处理好的菌株加入反应液的方式。
其中，上述生产菌株的利用形式是生产菌株细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干菌株或废酵母泥。
其中，磷酸离子可举出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等无机磷酸盐。
其中，溶氧量通过调节搅拌速率、通气量等方法调节，根据溶氧测量仪的检测数据进行调节。以饱和空气溶氧量为100％。
本发明的有益效果为：
本发明者研究了以尿苷或乳清酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过阶段性调整反应温度和溶氧量为手段定向地生物催化合成特定的三种尿苷磷酰化合物。可以根据需求生产三种物质的任意之一种，反应体系简单，无毒，生产成本低廉。且控制手段简单易行，极大方便了工业化中的生产控制。
通过阶段性调节反应条件可以定向生产UMP，UTP和UDPG，UR做底物时三种产物的得率分别可达到77％、67％、61％；OA做底物时三种产物的得率分别可达到70％，61％和53％。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：利用尿苷定向生产UMP。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷600mMol、葡萄糖5Mol、硫酸镁50mMol、产氨短杆菌2400克，氯化铵20mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠2.0Mol，甲苯50毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在70％，温度为30℃，反应8小时后结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UMP，其含量为457mMol(208g)，得率为76.1％，此时UTP含量为68.3mMol(33.1g)，UDPG含量为24.6mMol(15g)。
实施例2：利用尿苷定向生产UTP。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷600mMol、葡萄糖5Mol、硫酸镁50mMol、产氨短杆菌2400克，氯化铵20mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠2.0Mol，甲苯50毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在70％，温度为30℃，反应8小时后，溶氧调整为25％，温度调整为37℃，继续反应6小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UTP，其含量为398mMol(193g)，得率为66.3％，此时UMP含量为57.3mMol(18.6g)，UDPG含量为80.2mMol(48.9g)。
实施例3：利用尿苷定向生产UDPG。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷600mMol、葡萄糖5Mol、硫酸镁50mMol、产氨短杆菌2400克，氯化铵20mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠2.0Mol，甲苯50毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在70％，温度为30℃，反应8小时后，溶氧调整为25％，温度调整为37℃，继续反应6小时后，溶氧调整为5％，温度调整为25℃，继续反应4小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UDPG，其含量为361mMol(220g)，得率为60.2％，此时UMP含量为17.9mMol(6.16g)，UTP的含量为81.2mMol(38.7g)。
实施例4：利用尿苷定向生产UMP。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷900mMol、葡萄糖8Mol、氯化镁125mMol、毕赤酵母3200克，氯化铵35mMol，硝酸钾400mMol，磷酸氢二钠2.5Mol，二甲苯75毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在80％，温度为32℃，反应9小时后结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UMP，其含量为634mMol(208g)，得率为70.4％，此时UTP含量为98.3mMol(47.2g)，UDPG含量为44.6mMol(27.2g)。
实施例5：利用尿苷定向生产UTP。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷900mMol、葡萄糖8Mol、氯化镁85mMol、毕赤酵母3200克，氯化铵35mMol，硝酸钾400mMol，磷酸氢二钠2.5Mol，二甲苯75毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在80％，温度为32℃，反应9小时后，溶氧调整为25％，温度调整为38℃，继续反应6小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UTP，其含量为574mMol(276g)，得率为63.8％，此时UMP含量为77.3mMol(25.1g)，UDPG含量为104mMol(63.4g)。
实施例6：利用尿苷定向生产UDPG。
在容量15L的反应槽中调制由尿苷900mMol、葡萄糖8Mol、氯化镁85mMol、毕赤酵母3200克，氯化铵35mMol，硝酸钾400mMol，磷酸氢二钠2.5Mol，二甲苯75毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，溶氧控制在80％，温度为32℃，反应9小时后，溶氧调整为25％，温度调整为38℃，继续反应6小时后，溶氧调整为10％，温度调整为27℃，继续反应5小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为UDPG，其含量为521mMol(317g)，得率为57.9％，此时UMP含量为26.9mMol(8.72g)，UTP的含量为121mMol(58.6g)。
实施例7：利用乳清酸定向生产UMP。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸600mMol、葡萄糖7.5Mol、硫酸镁300mMol、酿酒酵母3000克，氯化铵24mMol，硫酸钾210mMol，磷酸二氢钠4Mol，曲拉通X-10050克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在80％，温度为30℃，反应18小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UMP，其含量为411mMol(133g)，得率为68.5％，此时UTP的浓度为58.1mMol(28.1g)，UDPG的浓度为32.8mMol(20.0g)。
实施例8：利用乳清酸定向生产UTP。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸600mMol、葡萄糖7.5Mol、硫酸镁300mMol、酿酒酵母3000克，氯化铵24mMol，硫酸钾210mMol，磷酸二氢钠4Mol，曲拉通X-10050克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在80％，温度为30℃，反应18小时后，溶氧调整为30％，温度调整为37℃，继续反应10小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UTP，其含量为358.2mMol(173g)，得率为59.7％，此时UMP的含量为84.2mMol(27.3g)，UDPG的含量为66.5mMol(40.6g)。
实施例9：利用乳清酸定向生产UDPG。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸600mMol、葡萄糖7.5Mol、硫酸镁300mMol、酿酒酵母3000克，氯化铵24mMol，硫酸钾210mMol，磷酸二氢钠4Mol，曲拉通X-10050克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在80％，温度为30℃，反应18小时后，溶氧调整为30％，温度调整为37℃，继续反应10小时后，溶氧调整为10％，温度调整为27℃，反应8小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UDPG，其含量为303mMol(185g)，得率为50.5％，此时UMP的含量为49.0mMol(15.9g)，UTP的含量为62.3mMol(30.2g)。
实施例10：利用乳清酸定向生产UMP。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸800mMol、葡萄糖9Mol、硝酸镁500mMol、枯草芽孢杆菌4000克(经风干)，碳酸铵30mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠5Mol和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在90％，温度为28℃，反应至20小时，反应结束，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UMP，其含量为532mMol(172g)，得率为66.5％，此时UTP的浓度为59.2mMol(28.7g)，UDPG的浓度为34.8mMol(21.2g)。
实施例11：利用乳清酸定向生产UTP。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸800mMol、葡萄糖9Mol、硝酸镁500mMol、枯草芽孢杆菌4000克(经风干)，碳酸铵30mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠5Mol和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在90％，温度为28℃，反应20小时后，溶氧调整为40％，温度调整为35℃，继续反应至10小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UTP，其含量为454mMol(220g)，得率为56.7％，此时UMP的含量为87.2mMol(28.3g)，UDPG的含量为86.5mMol(52.8g)。
实施例12：利用乳清酸定向生产UDPG。
在容量15L的反应槽中调制由乳清酸800mMol、葡萄糖9Mol、硝酸镁500mMol、枯草芽孢杆菌4000克(经风干)，碳酸铵30mMol，氯化钾300mMol，磷酸二氢钠5Mol和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为8.0，溶氧控制在90％，温度为28℃，反应20小时后，溶氧调整为40％，温度调整为35℃，继续反应至10小时，溶氧调整为10％，温度调整为25℃，反应至6小时，结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对反应产物进行定量分析，转化液中主要产物为UDPG，其含量为388mMol(237g)，得率为48.5％，此时UMP的含量为59.2mMol(19.2g)，UTP的含量为72.3mMol(35.1g)。