小鼠裸卵体外成熟技术.pdf

本发明涉及一种小鼠裸卵体外成熟技术，属于生物技术领域。本发明为卵丘细胞利用胱氨酸和半胱胺提高了小鼠裸卵GSH合成和发育能力，进而建立了卵丘细胞共培养结合添加半胱胺和胱氨酸使小鼠裸卵完全恢复发育能力的体外成熟系统。小鼠裸卵在添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸的TCM-199成熟培养液中与小鼠或山羊卵丘细胞共培养，其囊胚率达到添加相同巯基化合物培养成熟COC水平。将共培养成熟的裸卵和COC产生的2-细胞胚胎移植后，妊娠率和产仔数差异不显著。这是在国际上首次建立使小鼠裸卵完全恢复发育能力的体外成熟系统，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义。

1、  一种小鼠裸卵体外成熟技术，其特征在于把小鼠裸卵与小鼠或山羊卵丘颗粒细胞置于添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸的TCM-199成熟培养液中共培养。

小鼠裸卵体外成熟技术
(一)技术领域
本发明涉及一种小鼠裸卵体外培养成熟的技术，属于生物技术领域。
(二)背景技术
许多研究证明，体外成熟(IVM)之前脱去卵丘细胞会严重影响卵母细胞的胚胎发育能力(Schroeder AC，Eppig JJ.，The developmental capacity ofmouse oocytes that matured spontaneously in vitro is normal.Dev Biol1984；102：493-497)和谷胱甘肽(GSH)合成能力(de Matos DG，Furnus CC，Moses DF.，Glutathione synthesis during in vitro maturation of bovineoocytes：role of cumulus cells.Biol Reprod 1997；57：1420-1425)。尽管有些动物的裸卵(DO)在体外能够完成核成熟，但体外受精后发育能力大大下降(Ge L，Han D，Lan GC et al.Factors affecting the in vitro action ofcumulus cells on the maturing mouse oocytes.Mol Reprod Dev 2008；75：136-142)。然而，对于生发泡(GV)移植，体细胞单倍体化、利用GV期胞质进行体细胞克隆以及GV期卵母细胞冷冻保存等胚胎工程技术，卵母细胞都必须在体外成熟前脱去卵丘细胞。因此，建立有效的DO体外成熟系统势在必行。然而，目前为止，全世界还都没有建立起任何一种哺乳动物的DO体外成熟系统。另外，小鼠是进行上述胚胎工程技术研究的主要模式动物，因此，建立小鼠裸卵体外成熟系统的意义尤为重大。
近年来，许多研究者尝试与卵丘细胞共培养来改善DO的体外成熟质量，但研究结果证明，除非保留放射冠，与卵丘细胞或卵丘-卵母细胞复合体(COC)共培养都只能部分恢复体外成熟DO的发育能力(Ge L，Han D，Lan GC et al.Factors affecting the in vitro action of cumulus cells on the maturingmouse oocytes.Mol Reprod Dev 2008；75：136-142)。有研究表明，向成熟培养液中添加半胱胺可提高卵母细胞的谷胱甘肽(GSH)水平，从而提高卵母细胞发育能力(de Matos DG，Furnus CC，Moses DF et al.Effect ofcysteamine on glutathione level and developmental capacity of bovineoocyte matured in vitro.Mol Reprod Dev 1995)。体外成熟DO的GSH含量远远低于COC(de Matos DG，Furnus CC，Moses DF.Glutathione synthesisduring in vitro maturation of bovine oocytes：role of cumulus cells.BiolReprod 1997；57：1420-1425)。另外，我们先前的研究证明，向成熟培养液中联合添加半胱胺和胱氨酸比单独添加二者之一提高山羊卵母细胞发育能力效果更佳(Zhou P，Wu YG，Li Q et al.The interactions between cysteamine，cystine and cumulus cells increase the intracellular glutathione leveland developmental capacity of goat cumulus-denuded oocytes.Reproduction2008；135：605-611)。因此，我们设想，可以通过共培养结合添加半胱胺和胱氨酸使小鼠裸卵完全恢复发育能力。
(三)发明内容
本发明为卵丘细胞利用胱氨酸和半胱胺提高了小鼠裸卵的GSH合成和发育能力，进而建立了卵丘细胞共培养结合添加半胱胺和胱氨酸使小鼠裸卵完全恢复发育能力的体外成熟系统。本发明通过以下技术方案实现：即把小鼠裸卵与小鼠或山羊卵丘颗粒细胞置于添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸的TCM-199成熟培养液中共培养，培养成熟的小鼠COC和共培养成熟的裸卵产生的2-细胞胚胎移植到假孕受体。
用原来不含有半胱胺或胱氨酸的M16培养基作为成熟培养液发现，尽管山羊卵丘细胞只需要半胱胺或者胱氨酸就能促进小鼠DO的GSH合成，但小鼠卵丘细胞则需要半胱胺和胱氨酸同时存在才能促进DO的GSH合成。用TCM-199培养基进行成熟培养证明，不加半胱胺或者添加100-200μmol/l半胱胺和83μmol/l胱氨酸不能提高小鼠卵母细胞的囊胚形成率，但添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸再结合与小鼠或山羊卵丘细胞共培养则使小鼠DO的囊胚率提高到添加相同巯基化合物培养成熟的COC的水平。把由添加适当浓度半胱胺和胱氨酸培养成熟的小鼠COC和共培养成熟的DO产生的2-细胞胚胎移植到假孕受体后，COC和DO的妊娠率和产仔数差异不显著，说明所建立的小鼠裸卵体外成熟体系是成功的，能够使小鼠裸卵完全恢复发育能力，所述的适当浓度为100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸。
本技术的关键是把小鼠裸卵用添加适当浓度半胱胺和胱氨酸的TCM-199培养液与小鼠或山羊卵丘细胞共培养成熟，体外受精后囊胚发育率和胚胎移植产仔率都达到与同等条件下成熟的COC相同水平。这是在国际上首次建立能够使小鼠裸卵完全恢复发育能力的体外成熟系统，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义。
(四)附图说明
图1：小鼠裸卵体外成熟培养的程序示意图
1是成熟培养液的配制
2是小鼠DO的制备
3是小鼠或山羊颗粒细胞单层制备
4是小鼠DO的成熟培养
5是体外受精和胚胎培养
6是胚胎移植
(五)具体实施方式
1、成熟培养液配制
TCM-199培养液(Gibco，Grand Island，NY，USA)添加1μg/ml 17β-E₂，24.2mg/l丙酮酸钠，0.05IU/ml FSH，0.05IU/ml LH和10ng/ml EGF配成成熟培养液。将半胱胺和胱氨酸分别配制成20mmol/l和100mmol/l的浓储液，-20℃保存，用前以成熟培养液稀释到所需浓度(半胱胺：100μmol/l；胱氨酸：200μmol/l)。由于商品TCM-199培养液本身含有83μmol/l胱氨酸，因此胱氨酸最终使用浓度为283μmol/l。
2、小鼠DO制备
自超排处理的小鼠获取卵巢，刺破大卵泡获得COC。用直径略大于卵母细胞的细玻璃管反复吹打，脱去卵丘细胞获得DO。
3、小鼠或山羊颗粒细胞单层制备
小鼠或山羊COC于成熟培养液滴中脱下卵丘细胞。取出卵母细胞后，收集卵丘细胞，以3×10⁵个/ml接种于培养板孔中。卵丘细胞在37℃(小鼠)或38.5℃(山羊)，5％CO₂，100％湿度条件下培养。
4、小鼠DO的成熟培养
卵丘细胞＞80％贴满时，将原来的培养液吸出，加入添加半胱胺和胱氨酸的成熟培养液，置于培养箱平衡3h后将DO移入，成熟培养14-16h。培养条件为：DO 25-30枚/100μl成熟培养液，覆盖石蜡油，37.5℃，5％CO₂，100％湿度。
5、体外受精和胚胎培养
雄鼠附睾尾精子置1ml含10mg/ml BSA的T6液滴内，于37℃、5％CO₂及饱和湿度的CO₂培养箱内中获能1.5h。用piezo驱动显微注射系统在DO透明带上穿一个20μm的孔，然后移入受精液(添加20mg/ml BSA的T6液)滴中(DO30-35枚/100μl)，加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×10⁶个/ml。授精6h后，取含两原核和第二极体的受精卵置于无糖CZB中(胚胎30-35个/100μl)进行胚胎培养。当胚胎发育到3-或4-细胞时，向CZB中添加5.5mmol/l葡萄糖。胚胎培养4d，观察囊胚发育情况。
6、胚胎移植
进行胚胎移植的前一天将8-10周龄的雌鼠与结扎的雄鼠合笼，合笼后第2d早上检查雌鼠的阴道栓。见栓的雌鼠作为假孕母鼠在当天下午进行胚胎移植。将8-10个2细胞阶段的胚胎用细玻璃管经输卵管伞吹入假孕受体母鼠的输卵管壶腹部。胚胎移植完毕的受体母鼠单独饲养直到出生后代。