化合物2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA）在抗坏血酸（维生素C）的合成中是一种重要的中间体。已知许多种微生物，例如醋酸杆菌属（Acetobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）的微生物，可由山梨醇或L-山梨糖产生2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA）（日本专利公告40，154/1976）。已有许多种化合物被提出作为从L-山梨糖生产2-KGA的中间体（Okazaki et al.，Agr.Biol.Chem.33，207-211〔1969〕），本专利的实例涉及通过中间体L-山梨糖酮的途径，并包括到达和起始于L-艾杜糖酸的分支途径;但是，本发明所涉及的原理适用于从L-山梨糖到2-KGA的任何途径（Macover et al.，Biotechnol.and Bioeng.17，1485-1514〔1975〕）。 用微生物学方法将L-山梨糖转变为L-山梨糖酮，是利用由所用的微生物产生的L-山梨糖脱氢酶而进行的。在生产2-KGA的微生物学方法中，L-山梨糖酮转化为2-KGA是利用微生物所产生的L-山梨糖酮脱氢酶来进行的（美国专利3，907，639）。许多产生L-山梨糖酮脱氢酶的微生物并不产生L-山梨糖脱氢酶（反过来不适用）。
在某些微生物中，2-KGA的产量可因2-KGA还原酶的活性而降低，这是一种将2-KGA还原成L-艾杜糖酸的酶。还存在一些其它地利用不同的酶的L-山梨糖代谢途径。这些途径降低2-KGA的产量。需要通过消除或尽量减少竞争性酶的产生来消除或减少这些途径，以增加2-KGA的产量。由于2-KGA对细菌生长不是必需的，所以不可能直接选择高效生产2-KGA的微生物。目前已知的生产2-KGA的微生物，已通过筛选非常大量的天然分离菌而得到了〔Guanglin et al.，Acta Microbiologica Sinica 20，246-251（1980）〕。因此，需要提供改善2-KGA生产的简单方法。
根据本发明，利用了转座子致突变以提供一种用微生物学方法生产2-KGA以及提高能从L-山梨糖产生2-酮-L-古洛糖酸的微生物的生产的方法。
根据本发明，利用转座子致突变，与常规突变型的筛选相比，转座子突变型的筛选大大地简化了。而且，转座子的插入提供了一种完全根据其功能分离和克隆重要基因的方法。可对这样一种基因进行操作以影响另一种生物体生产2-KGA。因此，有可能比常规方法更容易地改善2-KGA的生产。
根据本发明，提供了一种改进的致突变方法和筛选能产生2-KGA的生物体的方法。因此，通过本发明，提供了一种新的、改进的用微生物学方法将L-山梨糖转化为2-KGA的方法。
根据本发明，公开了一种鉴定从L-山梨糖生产2-KGA时所涉及的基因的方法。
根据本发明，公开了一种利用广宿主范围的载体RSF 1010构建重组质粒的方法。还公开了一种将这些质粒导入氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）或其它细菌中的方法，例如在1987年5月13日发表的欧洲专利公报No221707中所述的方法。
这些方法用于鉴定和克隆为L-山梨糖脱氢酶产生中所涉及的产物编码的DNA。当含有与L-山梨糖脱氢酶相关的DNA的重组质粒被转移到不产生2-KGA的氧化葡糖酸杆菌中时，这些微生物就获得了产生2-KGA的能力，这种能力与提供与L-山梨糖脱氢酶相关的DNA的微生物处于相同的水平。这样，本发明提供了一种生产2-KGA的改进方法。
概括地说，本发明涉及：
一种将L-山梨糖转化为2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA）的方法，包括在含有L-山梨糖的培养基中培养能使山梨糖转化为2-KGA的重组细菌细胞。
一种将L-山梨糖转化为2-KGA的方法，包括在含有L-山梨糖的培养基中培养一种微生物，该微生物是天然微生物的一种突变型，能够将L-山梨糖转化为2-KGA，该突变型在能实现2-酮古洛糖酸还原酶的表达的DNA中插入了一个转座子，使该还原酶的表达失活。
一种能够将山梨糖转化为2-KGA的微生物突变型，其中，能够实现一种酶（该酶产生非2-KGA的糖类）的表达的DNA中插入了一个转座子，使该酶的表达失活。
一种含有具有重组载体的细胞的重组细菌，该细菌含有能够实现L-山梨糖脱氢酶表达的DNA顺序。
一种重组载体，含有一个能够实现L-山梨糖脱氢酶表达的DNA顺序。
一种生产L-山梨糖脱氢酶的方法，包括培养一种含有重组载体的宿主细胞，该载体能够实现L-山梨糖脱氢酶的表达。
一种检测编码L-山梨糖脱氢酶的DNA顺序的探针，包括一种载体，它含有一个能够实现L-山梨糖脱氢酶表达的放射标记的DNA顺序，其中该DNA顺序被一个转座子的插入所打断，防止该DNA进行L-山梨糖脱氢酶的表达。
图1是Tn5的限制性核酸内切酶位点图谱，根据D.Berg and C.Berg，Biotechnology1，417-435（1983）。
图2说明关于Tn5的转座子致突变。
图3说明能表达L-山梨糖脱氢酶的基因的探针和含有该基因的质粒的构建体的结构。
图4是RSF 1010的限制性核酸内切酶位点图谱。
图5是I组L-山梨糖脱氢酶（山梨糖氧化酶）基因区的限制性核酸内切酶位点图谱。
图6是2组L-山梨糖脱氢酶（山梨糖氧化酶）基因区的限制性核酸内切酶位点图谱。
定义
核苷酸-DNA的单体单位，由一个糖基（戊糖）、一个磷酸及一个嘌呤或嘧啶碱基（含氮杂环）组成。碱基通过糖苷上的碳（戊糖的1′位上的碳）连在糖基上。碱基和糖的结合称为核苷。每个核苷都以其碱基为特征。四种DNA碱基为：腺嘌呤（“A”）、鸟嘌呤（“G”）、胞嘧啶（“C”）和胸腺嘧啶（“T”）。
DNA顺序-各核苷酸通过在相邻戊糖的3′位和5′位的碳之间，以磷酸二酯键彼此相连而形成的核苷酸的线性排列。
基因组-一个细胞或一个病毒的全部DNA。它特别包括编码多肽物质的结构基因，以及操纵子、启动子和核糖体结合及相互作用顺序，包括象Shine-Dalgarno顺序这样一些顺序。
结构基因-通过其模板或信使RNA（“mRNA”），编码特定多肽的独特氨基酸顺序的DNA顺序。
转录-从结构基因产生mRNA的过程。
翻译-从mRNA产生多肽的过程。
表达-由结构基因产生多肽的过程。它是转录和翻译的结合。
质粒-一种环状双链DNA分子，它不是生物体主要染色体的一部分，它含有传递对特定抗生素产生抗性的基因。当质粒被放入单细胞生物中时，该生物的特征可被改变或转化，这是质粒DNA起作用的结果。例如，一个携有四环素抗性基因（TetR）的质粒，可将原来对四环素敏感的细胞转化成一个抗四环素的细胞。用质粒转化的细胞称为“转化体”。
克隆载体-一种质粒、噬菌体DNA或其它DNA顺序，它能够在宿主细胞中复制，其特征在于有一个或几个核酸内切酶识别位点，在这些位点上，这种DNA顺序可以一种确定的方式被切掉，而不造成DNA基本生物学功能〔例如复制、产生（病毒）外壳蛋白〕的丧失或启动子或结合位点的丧失。该位点还含有一个适用于鉴别转化细胞的标记，例如四环素抗性或氨苄青霉素抗性。克隆载体常称为载体。
克隆-通过无性繁殖，从一个生物体或DNA顺序获得一群这样的生物体或DNA顺序的过程。
重组DNA分子或杂交DNA-一个由来自不同基因组的DNA片段组成的分子，这些DNA片段在活细胞外以末端相连，并具有感染某种宿主细胞并保留在其中的能力。
转座子是一类可移动的遗传单元，它们不能独立复制，而必须将其插入一个宿主DNA中才能繁殖（N.Kleckner，Roth;and D.Botstein，J.Mol.Biol.216，125-159〔1977〕）。该宿主DNA的插入可发生在许多位点之一（Shan，K.and Berg，C.，Genetics 92，741-747〔1979〕）。在许多细菌DNA中，转座子Tn5插入位点的分布似乎比所研究的任何其它转座子插入位点的分布更具有随机性。其它可转座的DNA单元如Tn10或噬菌体Mu可用于此目的，Tn5是优选的（图1）。
如图2所示，将Tn5插入一个功能性基因中时，该基因的活性将丧失，并产生一个转座子突变型。
转座子Tn5为调节其自身转座作用的活性编码（D.Berg and C.Berg，Biotechnology 1，417-435〔1983〕）。此外，Tn5含有针对卡那霉素和链霉素的抗生素抗性标记。因此，转座子操作中可使用具有选择性的方法。
转座子致突变很适于提高象2-KGA这样的非必需微生物产物的生产。转座子在细胞中的转座作用是自限的，因此，一个细胞很少有一个以上的特定转座子的拷贝。因此，转座子致突变细胞的筛选就简化了。可利用转座子携带的抗生素抗性标记来保证只筛选出致突变细胞。转座子插入的自限特点确保了只筛选出单一突变型。转座子突变还在“不可选择的基因”上作了一个非常有用的标记。这样标记后，就可分离出突变基因以便能克隆其野生型复本。
根据本发明，可利用在大肠杆菌中编码卡那霉素抗性（Krm）、但也在许多革兰氏阴性土壤细菌中决定（表达）链霉素抗性（Srm）的5.7Kb Tn5（图1），来构建一个L-山梨糖脱氢酶相关DNA的探针。
图3概述了Tn5致突变的全过程。在此方法中，Tn5用一个不稳定的（“自杀”）传递载体导入，该载体不能保留在靶细胞中。合适的载体有R91-5及pSup2021，优选的载体是噬菌体P1（Kuner and Kaiser，Proceedings of the National Academy of Sciences（USA），78，425-429〔1981〕）。在大多数受体细胞中，载体和Tn5同时从细胞中丢失。然而，Tn5偶尔会在载体丢失前移至宿主细胞DNA中的一个位点上。该新位点及整个细胞即有了Tn5的Kmr标记。如果该位点在一个功能性DNA顺序中，那么这个顺序的活性将丧失。根据本发明的一个优选实施方案，转座子致突变可在一个氧化葡糖酸杆菌菌株上进行，该菌株可从70g/lL-山梨糖产生约20g/l2-KGA。象氧化葡糖酸杆菌这样的产生2-KGA的微生物的鉴别是根据“Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology”，VolI，275-278（1984）所给出的描述进行的。UV10菌株是一个适用于此目的的宿主。然而，任何从L-山梨糖产生2-KGA的菌株都可用于本发明的目的。
为了鉴别在L-山梨糖至2-KGA途径中致突变的细胞，在一个合适的含7%山梨糖（重量）及合适的氮源的培养基中，在30℃下培养卡那霉素抗性（Krm）细胞。5天后，利用本领域专业人员所熟悉的方法，从发酵产物中筛选出2-KGA及其它山梨糖代谢物。
某些利用L-山梨糖或其衍生物的葡糖酸杆菌的代谢途径，与2-KGA的产生相竞争。将2-KGA还原为L-艾杜糖酸就是这样一个途径（M.Ameyama and O.Adachi，Methods inEnzymology 89，203-211〔1982〕）（Makover etal.1975，如前述）。一种丧失了此竞争性途径的Tn5突变型可望产生更多的2-KGA。
因此，通过转座子致突变，似乎可达到两个目的：
a）可通过创造一种微生物的突变型，使其中一个或多个竞争性副反应受阻，提高此微生物从L-山梨糖产生2-KGA的能力。这是通过在能表达一种酶（该酶引起副反应）的DNA中插入一个转座子而使该DNA失活而完成的。这些酶引起副反应，产生非2-KGA的糖类，使2-KGA产量降低。2-酮-L-古洛糖酸还原酶就是这样一个酶，它可将2-KGA还原为L-艾杜糖酸。通过常规方法筛选出由转座子致突变产生的产生L-艾杜糖酸较少的突变型，可获得原始的由山梨糖产生2-KGA的菌株的突变型，该突变型由于在编码2-酮-L-古洛糖酸还原酶的DNA中插入转座子而使2-KGA的生产有所提高。虽然常规诱变剂能使2-KGA还原酶基因失活，但筛选这样的阻断突变型对Tn5来说更简单，因为由于其Kmr特征，只有突变型才被分离和筛选出来。这样的突变型实际上总是单突变型。
b）某些其它Tn5突变型可破坏与2-KGA的产生直接相关的酶的活性。某些这种突变型可丧失产生L-山梨糖脱氢酶的能力。这样的突变型被认为在合成L-山梨糖脱氢酶所需的DNA中插入了Tn5。这种L-山梨糖脱氢酶相关DNA可能是一个结构基因或一个其功能为合成L-山梨糖脱氢酶所必需的调节单元。缺乏L-山梨糖脱氢酶活性或产生2-KGA所需的任何其它活性的Tn5突变型的染色体，将由来自象葡糖酸杆菌这样的微生物的DNA组成，这种DNA在某些位点上被Tn5这样的转座子DNA所打断。可从突变细胞中分离出这种DNA。从所分离的DNA可构建本发明的探针。该探针可通过将DNA（含被Tn5打断的L-山梨糖脱氢酶相关DNA）与一个合适的载体结合来构建。此重组质粒可通过插入到一个容许其繁殖的合适的宿主细胞中而克隆。
许多宿主/克隆载体结合都可用于克隆双链DNA。例如，有用的克隆载体可能包括染色体DNA、非染色体DNA和合成的DNA顺序的片段，如各种已知的细菌质粒（如象PBR322这样的大肠杆菌质粒）、噬菌体DNA及得自质粒和噬菌体DNA结合的载体（如某些被修饰的质粒采用噬菌体DNA），或其它表达控制顺序或酵母质粒。有用的宿主可包括微生物、哺乳动物细胞、植物细胞等等。其中，优先选用的是微生物及哺乳动物细胞。作为优选的微生物，可以举出一些细菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearotherm-ophilus）及放线菌（Actinomyces）。当然，并非所有的宿主/载体结合对克隆都是等效的。宿主/克隆载体结合的这种特定选择，可在适当考虑所阐述的不脱离本发明范围的原理后作出。
此外，在每个特异性克隆载体中，可选择各种位点插入双链DNA。这些位点常用切割它们的限制性核酸内切酶来标明。例如，在pBR322中，ClaI位点可用来插入用Tn5打断的DNA顺序。各种位点已被其它人用于重组质粒的合成中。本领域专业人员可熟练地识别一些位点。当然，应当理解，用于本发明中的克隆载体不必有一个限制性核酸内切酶位点用于插入所选择的DNA片段。相反，此载体可通过另外的方式连接到此片段上。
可用几个熟知的方法，将DNA顺序插入克隆载体中，形成本发明中可用的重组DNA分子。这些方法包括，例如，直接连接、合成连接物，或通过用末端转移酶延长3′OH末端形成互补的重叠片段，随后使该重叠片段退火形成一个重组质粒。
如图3所示，可通过常规方法将载体中的被Tn5打断的L-山梨糖脱氢酶所需DNA插入宿主细胞中。大肠杆菌是一种优选宿主细胞，尤其是在载体为pBR322的情况下。转化的宿主由此克隆此重组质粒。如图3所示，为形成一个探针，提取该质粒并通过象缺刻翻译或核苷酸激酶标记这样的常规技术对DNA进行放射标记。
根据本发明，如上制备的探针可用于筛选各种DNA片段，以测定它们是否含有表达L-山梨糖脱氢酶所需的未突变DNA顺序。
为形成图3的DNA文库用于而后的筛选，以便确定是否存在能诱导一种或多种酶（用于将L-山梨糖转变为2-KGA的酶）的表达的基因，从能将山梨糖转变为2-KGA的任何生物（优选氧化葡糖酸杆菌UV10）中取出DNA。将此DNA用能识别氧化葡糖酸杆菌所共有的四碱基顺序的核酸内切酶进行限制性酶解，一种优选的酶是能识别GCGC顺序的HhaI。限制性酶解的程度可用熟知的方法来控制，如控制限制性反应的时间长短或酶活力的量，从而使大多数DNA片段的长度在5和10Kb之间。对形成文库来说，这是一个优选长度，虽然也可采用其它长度的DNA。用凝胶电泳或密度梯度沉降这样的熟知方法分离出优选长度的DNA。用末端转移酶（TdT）将一个dC（脱氧胞苷）残基的寡核苷酸延伸物加到分离出来的氧化葡糖酸杆菌DNA的3′OH末端。优选的延伸长度为15-20个碱基。
用于形成图3文库的载体，是能在葡糖酸杆菌以及象大肠杆菌这样的优选无性繁殖有机体中复制的载体。优选的载体是RSF 1010（K.Nagahari and K.Sakaguchi，1978.J.Bact.133，1527-1529）（图4），但任何能在葡糖酸杆菌和大肠杆菌中进行复制的载体都可采用。用PvuⅡ这样的核酸内切酶对RSF1010进行限制性酶解。PvuⅡ可识别一个位点CAGCTG，该位点不在质粒的复制或抗生素抗性所需的区域中。用末端转移酶使载体的3′末端接dG（脱氧乌苷）并延长至15-20个碱基的优选长度。
用加热、然后在100mMNaCl溶液中缓慢冷却混合物这样的熟知方法，使3′OH延长的载体和葡糖酸杆菌DNA一起复性，形成重组分子。用该重组分子转染大肠杆菌这样的优选宿主。在3000个这种独立的重组体的DNA文库中，一个特定的野生型葡糖酸杆菌顺序至少应出现一次。
图3表示了在含有这种L-山梨糖脱氢酶相关基因的野生型基因文库中用探针鉴别克隆。为了鉴别文库中的哪个重组克隆含野生型L-山梨糖脱氢酶相关DNA，用熟知的方法将该克隆与从Tn5突变DNA制备的探针杂交，如将文库的DNA转至滤膜上再与探针一起退火。
含有野生型L-山梨糖脱氢酶相关DNA的重组质粒，可通过转染或流动的方式转入受体微生物中，这是优选的方法（Okumura，et al.1985，Agric Bio Chem.49∶1011-1017）。如果在大肠杆菌宿主或第三种细胞中存在一个合适的辅助质粒使质粒具有转移功能，那么，可通过质粒从大肠杆菌宿主至受体的接合转移，使插入到合适载体（如RSF1010）中的野生型L-山梨糖脱氢酶DNA流动至一个合适的受体中。这种接合可发生在液体培养基中或固体表面上，后者是优选的。优选的受体是一种有机体，如具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的IFO3293。辅助质粒可为一个独立的复制子或被整合到细胞的染色体中。一种优选的辅助质粒是RP4，但也可使用本领域技术人员熟知的其它质粒。
转移至受体中后，此重组质粒可作为一个游离质粒进行复制或者质粒的某些部分可整合到细胞的染色体或质粒DNA中。
克隆的L-山梨糖脱氢酶相关DNA，可在新的宿主中起作用以补充一种宿主表达L-山梨糖脱氢酶活性所需的基因产物。这可能是一种具有L-山梨糖脱氢酶活性的结构蛋白、一种辅助蛋白或一个调节单元。具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的宿主细胞获得了合成L-山梨糖脱氢酶所需的克隆了的DNA，因而能从L-山梨糖产生2-KGA。
可通过将受体培养于含L-山梨糖的培养基中，然后进行2-KGA分析，测定由受体产生的2-KGA。
在以下实例中，利用了下述微生物。
菌株 保藏
氧化葡糖酸杆菌
melanogenus UV 10 FERM-P No 8422
G.O.Suboxydans IFO3293 FERM-P No 8356
大肠杆菌 W3110（P1∶∶Tn5） NRRL B-18148（×）
大肠杆菌 600 ATCC 33525
大肠杆菌 C600（RSF1010） NRRL B-18146（×）
大肠杆菌 J53（RP4） NRRL B-18147（×）
氧化葡糖酸杆菌 M25-18 NRRL B-18143（×）
氧化葡糖酸杆菌 M43-53 NRRL B-18144（×）
氧化葡糖酸杆菌 M23-15 NRRL B-18145（×）
（×）于1986年12月2日按《布达佩斯条约》的有关条款贮藏的新菌株。
在上表中，FERM表示该菌株由Agency of Industrial Science and Technology，Fermentation Research Institute，Japan贮藏。术语NRRL表示该菌株由Northern Regional Research Center of United States Department of Agriculture Peoria，Illinois贮藏。ATCC代表American Type Culture Collection，Rockeville，Maryland，uSA。
实例1
大肠杆菌噬菌体Pl∶∶Tn5及其使用方案是由康涅狄格大学的Claire Berg博士提供的。
葡糖酸杆菌中的Pl∶∶Tn5转座子致突变
大肠杆菌W3110（Pl∶∶Tn5）的起始培养物在LB（Luria Broth）培养基（10g/l NaCl，10g/l Bacto Tryptone（Difco Bacto Peptone），5g/l酵母提取液）中，于30℃在连续搅拌下培养18至20小时。将1ml培养液稀释到100ml Pl培养基（LB培养基，10mM MgCl2，10mg/ml胸腺嘧啶核苷）中，并于30℃培养至A550（1cm光径，在550nm处的光吸收）为0.092。将细胞用冰冷却10分钟，于6℃以2，500rpm沉淀10分钟并重新悬浮在20ml Pl培养基中。于42℃诱导噬菌体产生，20分钟后，于37℃诱导90分钟。加入0.5ml氯仿，搅拌（剧烈混合）并在室温下保温5分钟使细胞完全溶解。细胞碎片以10，000rpm沉淀15分钟。上清液稀释到过量10倍的MCB（缓冲液）（10mM MgCl2，10mM CaCl2）中，用作噬菌体悬浮液。
优选的Pl∶∶Tn5受体菌株为氧化葡糖酸杆菌UV 10菌株，该菌株可从70g/lL-山梨糖产生20-25g/l 2-KGA。受体培养物于28℃在MB（甘露醇液体培养基）（25g/l甘露醇，5g/l酵母抽提物，3g/l bacto peptone）中培养18-20小时，然后取1ml稀释到29ml MB培养基中并培养至A550＝0.4。细胞于6℃以2，500rpm沉淀并悬浮于1.8ml MCB中。将0.1ml细胞与0.1ml噬菌体悬浮液混合，于30℃保温60分钟进行感染。
然后将被感染的细胞用0.8ml MB培养基稀释并置于室温下2小时，平板接种于含50μg/ml卡那霉素的MBA（MB，15g/l琼脂）上，并于30℃培养3-4天。形成菌落的细胞含有插入到染色体中的Tn5。
突变体分析
将卡那霉素（Km）抗性突变菌落于27℃在5ml接种培养基（10g/l CaCO3、7.5g/l酵母提取物、70g/l山梨醇作碳源、0.5g/l甘油、2.5g/lMgSO4-7H2O、50μg/ml Km）中培养48小时，然后取0.5ml移入5ml M3B培养基（70g/l山梨糖、0.05g/l甘油、12g/l CaCO3、2.5g/lMgSO4、5g/l酵母提取物、15g/l玉米浆、50μg/ml Km）中，于27℃培养5天。
分析发酵产物
（1）用高效液相色谱法（HPLC）进行。将每份100μl的各等份液体培养基与2ml 0.5%的邻苯二胺二盐酸盐（荧光标记）于90℃在密封瓶中混合30分钟。在C18 u bond Pak〔商品HPLC柱〕（即30cm×3.9mm）上进行层析;流动相，甲醇/H2O（75∶25）;流速2ml/min;2000磅/吋2（1磅/吋2＝0.068大气压）。
（2）此外，将1μl培养液点在硅胶板上进行薄层层析（TLC），用正丙醇、水、1%磷酸和甲酸（100∶25∶2.5∶0.25）展层。然后按常规方法，在板上喷四唑鎓兰或四价碱（tetrabase）。
对2000UV10∶∶Tn5突变体进行TLC分析后，发现有一个突变体M23-15似乎可比亲本培养物产生更多的2-KGA。发酵产物的薄层层析还表明，副产物艾杜糖酸大为减少。
为证实这些发现，取一环亲本培养物UV10和M23-15突变体在30℃下于2ml MB培养基（50μg/ml Km）中培养过夜;将100μl培养物转移入一个装有10ml M3B培养基（70g/l L-山梨糖10g/l CaCO3、2.5g/l MgSO4·7H2O、5g/l酶母提取物、0.5g/l甘油）、50μg/ml Km的50ml培养瓶中，于30℃在剧烈通气下培养5天。2KGA的水平用HPLC定量。为测定L-艾杜糖酸，将样品的pH调至1.5-2.0之间，并于80℃加热1小时以产生艾杜糖酸内酯。将1ml该内酯溶液加到2ml 4M盐酸羟胺及4M氢氧化钠的等体积溶液中。用经过类似处理的水作空白对照，测量540nm处的光吸收。与标准曲线相比测定L-艾杜糖酸的浓度，结果列入表Ⅰ。
表Ⅰ
用Tn5突变体23-15产生2-KGA
及艾杜糖酸
2-KGA 艾杜糖酸
UV10 19.6g/L 10.9g/L
M23-15 33.3g/L 2.8g/L
从表Ⅰ可见，突变体M23-15产生的2-KGA比亲本UV10要多得多。同时，副产物L-艾杜糖酸的产出降低。
L-艾杜糖酸是由2-KGA还原酶产生的，该酶用NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）作辅因子还原2-KGA。据此，测定M23-15和亲本菌株UV10中的2-KGA还原酶。
取一环培养物在5ml MB培养基中于30℃以300rpm培养一天至饱和。将2ml该培养物转移入一个含100ml MB培养基的500ml锥形瓶中，于30℃以300rpm培养1天。分别用20ml该培养物接种在2个装有M3B培养基的培养瓶中，每个2000ml的培养瓶中装500ml培养基。于30℃，以300rpm培养3天。将该培养液于4℃以400rpm离心10分钟以除去CaCO3，然后于4℃，以4000rpm离心20分钟使细胞沉淀。细胞沉淀物用0.85%冰冷无菌NaCl洗涤两次。
将3克细胞于10ml 10mM KPO4，pH7中再悬浮，并在Biospec Products Bead Beater中匀浆2分钟。匀浆液于4℃以8，800×g离心10分钟以除去细胞碎片，然后于4℃以100，000×g离心60分钟。上清液用作细胞质酶组分。通过读出反应混合物中还原的吡啶辅因子在340nm处光吸收的变化，测定酶活力单位（于25℃，1分钟内形成的产物的微摩尔数）。反应混合物为：1mg 2-KGA（以10mg/ml配在50mM KPO4，pH7.0溶液中，取100μl）、50μl 2mg/ml NADPH（配在50mMKPO4（pH7.0）中）、25μl细胞质酶组分及625μl 50mM KPO4（pH7）。根据厂商说明，蛋白质浓度用Bio Rad蛋白测定法测定。
表Ⅱ
2-KGA还原酶的比活
U/mg蛋白
UV10 0.0342
M23-15 0.000067
表Ⅱ清楚地表明，M23-15的2-KGA还原酶活力比UV10要低得多。因此，用此方法可获得一种比亲本培养物更有效地产生2-KGA的微生物。
实例2
涉及L-山梨糖脱氢酶合成的基因的克隆
产生2-KGA的氧化葡糖酸杆菌UV10的Tn5致突变及随后对5000个突变体的分析，使分离大量比亲本产生更少的2-KGA的菌株成为可能。这些菌株中，有4个产生2-KGA的量少于1g/l。
在这些菌株中，Tn5使一个产生2-KGA所必需的DNA顺序失活。在UV10菌株产生2-KGA的过程中涉及两种酶活力：L-山梨糖脱氢酶（它将L-山梨糖氧化为L-山梨糖酮）及L-山梨糖酮脱氢酶（它使L-山梨糖酮进一步氧化为2-KGA）。为鉴别缺乏哪种活性，将突变体的接种培养物和野生型细胞于MB培养基中在30℃下培养1天，用2ml接种培养物接种在装有100ml M3B、50μg/mlKm的500ml培养瓶中。于30℃培养2天后，将25ml细胞培养物用冰冷却，沉淀，于4℃，用40mM ADA〔N-（2-乙酰氨基）-亚氨二乙酸〕pH6.8缓冲液洗涤2次，然后悬浮在含7%L-山梨糖或2%L-山梨糖酮的20mMADA，pH6.8中，并于30℃在剧烈通气下培养2天。用HPLC测定2-KGA的产生，结果示于表Ⅲ。
表Ⅲ
通过非生长细胞从L-山梨糖或
L-山梨糖酮产生2-KGA
2-KGA（g/l）
L-山梨糖 L-山梨糖酮
UV10 8.3 6.1
M2518 0 2.7
M4353 0 3.8
M4191 0 2.9
野生型对照细胞很容易将L-山梨糖或L-山梨糖酮转化为2-kGA，而突变型则只能将L-山梨糖酮转化为2-KGA。突变细胞不缺乏L-山梨糖酮脱氢酶，而表明缺乏L-山梨糖脱氢酶。
为证实L-山梨糖脱氢酶活力的缺乏，测定酶的水平。将UV10、M43-53、M25-18及M47-118各取一环用来接种15ml甘露醇液体培养基。用静止培养物（1天）接种100ml MB，培养1天，然后按实例1所述接种并培养在M3B中。按前一实例收集细胞并匀浆，匀浆液以100，000×g离心后，收集沉淀组分作为膜组分。使膜组分悬浮在4ml 10mM KPO4，pH7中。使0.6ml膜悬浮液与2.4ml含0.3%TritonX-100的10mM KPO4，pH7，在50ml的空白缓冲液中混合以使膜溶解，搅拌3小时，然后以100，000×g离心1小时。上清液作为溶解的膜组分。通过测定（电子受体）2，6-二氯酚靛酚（DCIP）在600nm处的光吸收的降低进行酶的测定。一个酶活力单位定义为25℃下每分钟催化1μmole DCIP还原的酶量。测定混合液含280μl0.1MKPO4，pH7.0、0.3% TritonX-100、40μl2.5mM DCIP;200μl 1ML-山梨糖、10μl酶溶液及470μlH2O。蛋白质浓度的测定如实例1。
表Ⅳ
膜结合的L-山梨糖脱氢酶的比活
U/mg蛋白
UV10 0.194
M25-18 0.023
M43-53 0.013
M47-118 0.007
突变细胞显然缺乏L-山梨糖脱氢酶活性，表明一种合成L-山梨糖脱氢酶所必需的葡糖酸杆菌DNA顺序已失活。
Tn5-突变体DNA的克隆
根据熟知的方法，从突变株分离出总DNA;用表Ⅴ所列的各种限制酶消化DNA，在1%琼脂糖上用电泳分级分离并吸印到硝酸纤维素滤膜上，整个过程按常规方法进行。（Maniatis，et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1982）。吸印的DNA退火到通过缺刻翻译用32P标记的ColEl∶∶Tn5 DNA上，同源片段用放射自显影法检测。
计算出退火到Tn5探针上的DNA片段的长度，数值示于表Ⅴ。
表Ⅴ
缺乏L-山梨糖脱氢酶的Tn5
突变体的DNA限制分析
片段长度 （总长）
Cla I Eco RI Bam HI
突变体
M25-18 16Kb 16.5Kb 5.0
8.2（13.2）
M38-97 16 16.5 5.2
8.5（13.7）
M41-91 9.2 27 7.6
8.5（16.1）
M43-53 9.2 27 7.0
9.5（16.5）
显然，已获得2种不同类型的2-KGA突变体，根据Tn5的定位，M25-18和M38-97在1组中，M43-53和M41-97则组成2组。
通过以下方法，用载体pBR322将被Tn5失活的M25-18和M43-53的染色体DNA区域克隆到大肠杆菌中。突变体DNA用ClaI进行限制性酶解并在0.7%琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶上切下长度合适的DNA并洗脱。每种情况下可获得大约200ng突变体DNA。按常规方法，大约2μg pBR322DNA在特殊的ClaI位点上被酶解并用小牛碱性磷酸酯酶处理。用T4DNA连接酶连接突变体及载体DNA，并用此重组质粒转化大肠杆菌C600菌株。由于Tn5含新霉素磷酸转移酶基因，因此，可根据Kmr来选择重组细胞。
用一种快速碱溶解法从Kmr转染子中获得质粒（Birnboim and Doly，Nuc.A.Research 7，1513-1527〔1979〕。），将质粒进行限制性酶解并进行电泳，以证实已克隆了正确的片段。pM25-18克隆含有突变1组的L-山梨糖脱氢酶顺序;pM43-53则含有2组的L-山梨糖脱氢酶顺序。
为了获得相应的野生型DNA的克隆，用广宿主范围的载体RSF1010制备UV10菌株的未突变的DNA文库。用大约10个单位的HhalI对UV10的大约200μg的总DNA进行部分限制性酶解1小时。通过凝胶电泳和洗脱获得5-10Kb的片段。用末端转移酶（TdT）将15-20个脱氧胞苷残基连接到这些片段的3′OH末端使其延长。用PvuII进行限制性酶解使约5μg的RSF1010成线性分子。然后，用15-20个脱氧鸟苷残基使载体的3′OH末端延长。将有互补末端的载体及插入物各100ng，以1∶1的比例，于65℃在100μl 150mM NaCl、10mMTris（pH7.9）及0.1mM EDTA中退火3小时，并缓慢冷却至室温，用20μl转染大肠杆菌C600。
在含链霉素的LB琼脂上进行筛选后，获得约3000个重组菌落。将菌落复制物的DNA原位转移到一套尼龙滤膜上，并首先与32P标记的PM25-18一起退火。获得2种不同的1组重组体pURUH80和pURUO10（图5）。通过在10mM Tris（三（羟甲基）-氨基甲烷）pH7.5，1mMEDTA的溶液中加热至90℃，去除滤膜上的放射标记的DNA。将滤膜结合的菌落DNA再杂交到32P pM43-53上。获得单一的2组重组体pURUP88（图6）。因此，本发明提供了一种克隆产生L-山梨糖脱氢酶所必需的野生型葡糖酸杆菌DNA的方法。
实例3
将含有L-山梨糖脱氢酶相关DNA的重组
质粒转移到不产生2KGA的葡糖酸杆菌中
将重组质粒转移到葡糖酸杆菌IFO3293中，该菌可从70g/lL-山梨糖产生0-2g/l 2-KGA。已知该菌具有L-山梨糖酮脱氢酶活性。将50μl静止MB肉汤培养物接种到一个含MB琼脂、100μg/ml Na的平板上，并挑选一个单菌落，分离出一种自发的萘啶酮酸抗性（Nar）的IFO3293衍生物。通过三亲本杂交，用大肠杆菌J53（RP4）作辅助菌株进行重组质粒转移。将约200μl培养在FB培养基（25g/l果糖、5g/l酵母提取物、5g/l bacto-peptone）中的静止期受体IFO3293培养物，与各约100μl在LB培养基中培养至对数中期（最旺盛的生长期）的供体大肠杆菌C600（pURUH80、pURUO10或pURUHP88）及辅助菌大肠杆菌J53（RP4）相混合。将大约75μl混合物接种到置于FB琼脂板（FB，15g/l琼脂）表面上的直径87mm的硝酸纤维素滤膜上。于30℃培养约16小时后，将混合的菌落划线接种到含10μg/l抗生素polymixin B、50μg/ml Na、及100μg/ml链霉素的FB琼脂上，并于30℃进一步培养4-6天。按此法只获得接受了所需的重组质粒的葡糖酸杆菌IFO3293菌落。将这些培养物于30℃在FB培养基中培养4天，然后，将此接种培养物取2ml转移到100ml含100μg/ml链霉素的M3B培养基中，于30℃在连续搅拌下培养5-7天。测定2-KGA（表Ⅵ）。
表Ⅵ
用重组细菌产生2-KGA
宿主 质粒 2KGA（g/L）
大肠杆菌C600 - 0
RSF1010 0
PURUH80 0
PURUO10 0
PURUP88 0
葡糖酸杆菌 IFO3293 - 1.8
RSF1010 0.5
PURUH80 25
PURUO10 28
PURUP88 11.8
显然，L-山梨糖脱氢酶基因相关重组质粒互补了IFO3293的2-KGA缺陷。为证实这一点，对以上重组培养物进行酶测定。从表Ⅶ中的结果可见，重组葡糖酸杆菌所具有的L-山梨糖脱氢酶活性至少比得上UV10菌株，并比亲本菌株IFO3293高得多。
表Ⅶ
重组葡糖酸杆菌的L-山梨糖
脱氢酶活力
UV10 0.194U/mg
IFO3293 0.019
IFO3293（pURO10） 0.2
IFO3293（pURP88） 0.13