一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法.pdf

本发明公开了一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体等比例混合，接种至红茶菌培养液中培养后与海藻酸钠溶液等积混合后，滴入CaCl2溶液中，得到的含菌凝胶球置于CaCl2溶液中，静置即制得直投式红茶菌发酵剂，本发明具有生周期短、产量高、无废弃物等优点，以该发明生产出的直投式红茶菌发酵剂，解决了传统红茶菌在工业化生产中菌相易变、工艺复杂的问题，为红茶菌饮料的工业化生产提供了可靠途径。并且由于该发明中使用的菌种均为对人体无毒害的确切益生菌，可用该产品生产出保健性和安全性均有保障的功能饮料。

1、  一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：
a、将酵母菌接入酵母菌液体培养基中，静置培养，温度20℃-25℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
b、将醋酸菌接入醋酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度25℃-35℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
c、将乳酸菌接入乳酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度35℃-40℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
d、将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体等比例混合，接种至红茶菌培养液中，旋转式摇床，转速150rpm；温度25℃-35℃，培养1-2天；
e、配制浓度为3％-8％的海藻酸钠溶液，110℃-130℃灭菌20-30min；配制浓度为0.05％-18％的CaCl₂溶液，110℃-130℃灭菌20-30min，将步骤4得到的含菌培养液与海藻酸钠溶液等积混合后，滴入CaCl₂溶液中；
f、将步骤e得到的含菌凝胶球置于CaCl₂溶液中，2-6℃静置12-36小时即制得直投式红茶菌发酵剂。

2、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的酵母菌为酿酒酵母或巴斯德酵母中的至少一种。

3、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的酵母菌液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)或麦芽汁培养基。

4、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的醋酸菌为醋化醋杆菌木质亚种、葡萄糖醋杆菌、产酮醋杆菌、弱氧化醋杆菌、巴氏醋杆菌中的至少一种。

5、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的乳酸菌为双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳酸菌、干酪乳杆菌中的至少一种。

6、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的乳酸菌液体培养基为BCG培养基或M17培养基或MRS培养基或TJA培养基。

7、  根据权利要求1所述的一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的红茶菌培养液采用重量比为5％-25％的糖，0.2-5％的茶，水余量，将水烧沸，沸水冷却至85℃～90℃时，加入茶，保温20min，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀制得。

一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，属于生物工程或食品工程领域。
背景技术：
红茶菌又名“海宝”、“胃宝”，用红茶水泡养红茶菌可得到含有乳酸、茶多酚、维生素等多种天然营养物质的饮料，研究发现，红茶菌在改善胃肠道功能、抗癌、抗菌、免疫等方面均有不俗的表现。但其至今没能形成大规模工业推广。究其具体原因有以下几点：
1、对红茶菌保健性能研究不够透彻：
有关红茶菌保健功能和安全性的研究报道在国内很少，只有陈喧等人报道了茶叶和红茶菌中的有效成分对人体肠道生态平衡的作用，即葡萄糖二酸1，4内酯及葡萄糖酸对人体有抑菌，解毒、抗癌的作用。国外Anita M.Hartman等利用小鼠长期饮用红茶菌对生长寿命、食欲变化、器官等进行跟踪比较发现，对照组各方面均比饮用组差。这说明红茶菌饮料的确有一定保健功效。
2、对于红茶菌的菌种及菌种组合的优势群体的研究还未展开：
对红茶菌粒中的微生物研究，仅限于分离纯化和鉴定。Ai Leng Teoh对红茶菌发酵饮料中的微生物进行了详细的研究，利用氧四环素作为抑制细菌生长的物质，对红茶菌发酵中的菌膜和液体基质中的酵母菌分离，得到了布鲁克丝假丝酵母(C andidacrusei)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克勒克酵母(K loeckera)、拜耳结合酵母(Zygosaccharomycesbailii)。Safak，S等从发酵红茶菌中分离得到11种酵母菌，其中8株为酿酒(Saccharomycescerevisiae)，2株为克鲁假丝酵(Candidacrusei)，1株Kluyveromyce safricanus，但目前还没有学者系统的做过红茶菌菌种组合的优势群体的研究。
3、没有摆脱传统工艺的局限性：
传统红茶菌饮料生产中，由于发酵用红茶菌为膜状结构，具有繁殖能力，且菌相互生关系和菌相比例系不是恒定不变的，处于变化状态，易受外界环境影响，易受污染，影响正常发酵，它存在着易变、不易控制，菌膜的回收清洗不方便、发酵性能不稳定等缺点。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种操作简单，培养周期短，含菌体数量高、发酵能力强，可以实现红茶菌饮料生产的工业化推广的直投式红茶菌发酵剂的制备方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种直投式红茶菌发酵剂的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：
a、将酵母菌接入酵母菌液体培养基中，静置培养，温度20℃-25℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
b、将醋酸菌接入醋酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度25℃-35℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
c、将乳酸菌接入乳酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度35℃-40℃，培养1-3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
d、将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体等比例混合，接种至红茶菌培养液中，旋转式摇床，转速150rpm；温度25℃-35℃，培养1-2天；
e、配制浓度为3％-8％的海藻酸钠溶液，110℃-130℃灭菌20-30min；配制浓度为0.05％-18％的CaCl₂溶液，110℃-130℃灭菌20-30min，将步骤4得到的含菌培养液与海藻酸钠溶液等积混合后，滴入CaCl₂溶液中；
f、将步骤e得到的含菌凝胶球置于CaCl₂溶液中，2-6℃静置12-36小时即制得直投式红茶菌发酵剂。
为了进一步实现本发明的目的，所述的酵母菌为酿酒酵母或巴斯德酵母中的至少一种。
为了进一步实现本发明的目的，所述的酵母菌液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)或麦芽汁培养基。
为了进一步实现本发明的目的，所述的醋酸菌为醋化醋杆菌木质亚种、葡萄糖醋杆菌、产酮醋杆菌、弱氧化醋杆菌、巴氏醋杆菌中的至少一种。
为了进一步实现本发明的目的，所述的乳酸菌为双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳酸菌、干酪乳杆菌中的至少一种。
为了进一步实现本发明的目的，所述的乳酸菌液体培养基为BCG培养基或M17培养基或MRS培养基或TJA培养基。
为了进一步实现本发明的目的，所述的红茶菌培养液采用重量比为5％-25％的糖，0.2-5％的茶，水余量，将水烧沸，沸水冷却至85℃～90℃时，加入茶，保温20min，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀制得。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：
本发明人经过广泛而深入细致的研究，掌握了红茶菌菌相的构成以及互生关系，通过对分离得到的优势菌种反复组合，终于筛选出可直接组合用于生产直投式红茶菌发酵剂的菌株。所选菌株均为人们熟知的益生菌，对人体无毒无害安全稳定，且具有相当的保健功效。通过海藻酸钠包埋固定化处理，将混合培养后的五种菌体混合物制成可直接用于生产的含菌凝胶珠即直投式发酵剂。在此基础上对直投式红茶菌发酵剂生产工艺进行了改进和完善，从而完成了本发明。
本发明根据红茶菌的菌相组成，采用一般液体培养基，培养发酵性能和互生关系较好的益生菌醋化醋杆菌木质亚种(Acetobacterxylinum)、保加利亚乳杆菌(Lactobacterium bulagricum)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus Hansen)，收获菌体，然后在红茶菌发酵液中混合培养，使其达到平衡，然后加入到一定的海藻酸钠溶液中，滴入一定浓度的氯化钙溶液，得到可直接用于工业化生产的直投式红茶菌发酵剂。其外观为凝胶珠形式。本发明产品在生产过程中可以直接接种，无须中间继代培养过程，使用方便，发酵产品质量稳定，尤其是海藻酸钠包埋得到的凝胶珠可反复使用达三个月以上，是一类新型商品化生产菌种。本发明可以方便、简单的生产直投式红茶菌发酵剂，具有工艺简单、生产周期短，产量高、效果明显等优点，整个生产过程中无污染无废弃物，所需物质可反复利用，成本低廉。其次，以本发明提供的方法生产出的直投式红茶菌发酵剂解决了传统红茶菌饮料生产中菌相比例不固定、菌膜的回收清洗不方便、发酵性能不稳定等缺点，该方法操作简单，含菌体数量高、发酵能力强。此外，以该方法提供的直投式红茶菌发酵剂，可以生产出安全稳定且具有相当保健功能的红茶菌饮料，有助于实现红茶菌饮料生产的工业化推广，有较强的实用性。
具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式作详细说明：
1、菌种：
醋酸菌：醋化醋杆菌木质亚种；也可采用葡萄糖醋杆菌、产酮醋杆菌、弱氧化醋杆菌、巴氏醋杆菌等其它同类醋酸菌。
乳酸菌：保加利亚乳杆菌、双歧杆菌；也可采用嗜热链球菌、嗜酸乳酸菌、干酪乳杆菌等其它同类乳酸菌。
酵母菌：巴斯德酵母、酿酒酵母；也可采用其它同类酵母菌。
2、制备菌种培养基：
酵母菌液体培养基：
可采用已有的马铃薯淀粉培养基和麦芽浸膏培养基，也可采用按下述方法制得的马铃薯淀粉培养基：将马铃薯洗净去皮后，切成小块，称取200g，加水200g，煮沸30min，加水定容至1L，用双层纱布过滤，加入20g蔗糖和20g琼脂于滤液中，煮沸，待蔗糖和琼脂完全溶解后，补加蒸发损失的水分至1L混匀，以100ml/瓶分装到250ml三角瓶中，于110℃-130℃灭菌20-30min。
醋酸菌液体培养基：可采用已有的醋酸菌液体培养基，也可采用按下述方法制得的醋酸菌液体培养基：葡萄糖30g，酵母提取物5.0g，蛋白胨3g，碳酸钙10g，加水定容至1000mL。以100ml/瓶分装到250ml三角瓶中，110℃-121℃灭菌10-25min。
乳酸菌培养基：
可采用已有的乳酸菌培养基(BCG培养基或M17培养基或MRS培养基等)，也可采用按下述方法制得的乳酸菌培养基(TJA培养基)：番茄汁50g，酵母抽提液5.0g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钾2.0g，吐温-801.0g，乙酸钠1.0g，蒸馏水1000mL，pH6.8左右。先将番茄洗净放入打浆机中打碎，过滤，滤液备用。将上述酵母抽提液、牛肉膏、乳糖、葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠置于1000mL烧杯中，加水完全溶解后，加温至沸，然后加入番茄汁和吐温，搅匀，补足水分到1000mL，调节pH值至6.8。以100ml/瓶分装到250ml三角瓶中，110℃-121℃灭菌10-25min。
3、器材：10ml注射器外套及5^#头皮静脉针，100ml三角烧瓶(无菌)，50ml带盖离心管(无菌)。20～22℃及37℃水浴，水平式离心机，旋转式摇床。
实施例1：
将巴斯德酵母和酿酒酵母接入上述酵母菌液体培养基中，静置培养，温度22℃，培养2天，离心收获菌体并用无菌水洗涤两次；
将醋化醋杆菌木质亚种接入上述醋酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度30℃，培养2天，离心收获菌体并用无菌水洗涤两次；
将保加利亚乳杆菌和双歧杆菌接入上述乳酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度37℃，培养2天，离心收获菌体并用无菌水洗涤两次；
制备红茶菌培养液：取蔗糖150g，普洱茶20g，水830g，将水烧沸，沸水冷却至85℃～90℃时，加入茶，保温20min，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀，分装至500mL三角瓶中，牛皮纸包扎后，进行巴氏灭菌，冷却至室温备用。
海藻酸钠溶液：总重量50g，其中5％的海藻酸钠，水余量，121℃灭菌25min，4℃存放。
CaCl₂溶液：总重量1000g，其中无水CaCl₂10％，水余量，pH6～8，121℃灭菌25min，4℃存放。
CaCl₂溶液。
取将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体各0.5g混合，接种至红茶菌培养液中，旋转式摇床，转速150rpm；温度30℃，培养1.5天；
将CaCl₂溶液移入三角瓶中，121℃灭菌25min，将头皮静脉针通过三角烧瓶口的棉塞伸入三角瓶内，并与10ml注射器连接。将此浸入37℃水浴锅中10min。
将上述含菌培养液与海藻酸钠溶液等积混合(海藻酸钠菌体混悬液)移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠菌体混悬液滴入CaCl₂溶液中。
滴完，将三角瓶移入20～22℃水浴放置1h。倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗1次。得到的含菌凝胶球重新置于CaCl₂溶液中，4℃静置24小时，制得直投式红茶菌发酵剂。
实施例2：
将巴斯德酵母接入上述酵母菌液体培养基中，静置培养，温度20℃，培养1天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次；
将葡萄糖醋杆菌和产酮醋杆菌接入上述醋酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度25℃，培养1天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次；
将嗜热链球菌、嗜酸乳酸菌接入上述乳酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度35℃，培养1天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次；
制备红茶菌培养液：取蔗糖50g，龙井茶2g，水948g，将水烧沸，沸水冷却至85℃～90℃时，加入茶，保温20min，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀，分装至500mL三角瓶中，牛皮纸包扎后，进行巴氏灭菌，冷却至室温备用。
海藻酸钠溶液：总重量50g，其中3％的海藻酸钠，水余量，110℃灭菌20min，2℃存放。
CaCl₂溶液：总重量1000g其中无水CaCl₂ 0.05％，水余量，pH6～8，110℃灭菌20min。
取将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体各0.5g混合，接种至红茶菌培养液中，旋转式摇床，转速150rpm；温度25℃，培养1天；
将CaCl₂溶液移入三角瓶中，110℃灭菌20min，将头皮静脉针通过三角烧瓶口的棉塞伸入三角瓶内，并与10ml注射器连接。将此浸入37℃水浴锅中10min。
将上述含菌培养液与海藻酸钠溶液等积混合(海藻酸钠菌体混悬液)移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠菌体混悬液滴入CaCl₂溶液中。
滴完，将三角瓶移入20～22℃水浴放置1h。倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗1次。得到的含菌凝胶球重新置于CaCl₂溶液中，2℃静置12小时，制得直投式红茶菌发酵剂。
实施例3：
将巴斯德酵母、酿酒酵母接入上述酵母菌液体培养基中，静置培养，温度25℃，培养3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤至少一次；
将醋化醋杆菌木质亚种、弱氧化醋杆菌、巴氏醋杆菌接入上述醋酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度35℃，培养3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤三次；
将干酪乳杆菌接入上述乳酸菌液体培养基中，旋转式摇床，转速220rpm；温度40℃，培养3天，离心收获菌体并用无菌水洗涤3次；
制备红茶菌培养液：取蔗糖250g，普洱茶50g，水700g，将水烧沸，沸水冷却至85℃～90℃时，加入茶，保温20min，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀，分装至500mL三角瓶中，牛皮纸包扎后，进行巴氏灭菌，冷却至室温备用。
海藻酸钠溶液：总重量50g，其中8％的海藻酸钠，水余量，130℃灭菌30min，6℃存放。
CaCl₂溶液：总重量1000g其中无水CaCl₂ 18％，水余量，pH6～8，130℃灭菌30min。
取将离心收获的酵母菌菌体和醋酸菌菌体和乳酸菌菌体各0.5g混合，接种至红茶菌培养液中，旋转式摇床，转速150rpm；温度35℃，培养2天；
将CaCl₂溶液移入三角瓶中，130℃灭菌30min，将头皮静脉针通过三角烧瓶口的棉塞伸入三角瓶内，并与10ml注射器连接。将此浸入37℃水浴锅中10min。
将上述含菌培养液与海藻酸钠溶液等积混合(海藻酸钠菌体混悬液)移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠菌体混悬液滴入CaCl₂溶液中。
滴完，将三角瓶移入20～22℃水浴放置1h。倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗2次。得到的含菌凝胶球重新置于CaCl₂溶液中，6℃静置36小时，制得直投式红茶菌发酵剂。