技术领域
本发明涉及用于构建转化的厌氧微生物的表达载体和构建所述表达载体的方法，所述厌氧微生物用作治疗缺氧疾病的基因转运体。此外，本发明涉及包含由所述表达载体转化的厌氧微生物的基因转运体、含有所述基因转运体的药物组合物和含有所述基因转运体的缺氧疾病治疗剂。
背景技术
在遗传改造的领域中，噬菌体、动物病毒或植物病毒、质粒等被广泛用作转化微生物的表达载体。作为被转化并使得表达基因产物的靶蛋白的转化体微生物，大肠杆菌(E.coli)、酵母等是被广泛使用的。这些转化的微生物是以表达靶蛋白为目的，并且所述微生物自身的利用未被考虑过。
近些年来，关于转化的微生物自身的利用，治疗恶性肿瘤的方法已经引起了注意，其中将转化的厌氧细菌用作基因转运体；例如，已经提出了使用转化的梭菌(Clostridium)将基因转运至肿瘤位置的方法(参见例如专利公布1至3)，此外，已经提出将转化的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)应用于治疗实体瘤(参见例如非专利公布1和2)。
此外，关于作为用于治疗实体瘤的基因转运体的转化的双歧杆菌(Bifidobacterium)，已有报道被转化以表达胞嘧啶脱氨酶(下文称为CD)的长双歧杆菌可以预期在酶-前药疗法中具有应用(参见例如专利公布4和非专利公布3和4)。CD是将5-氟胞嘧啶(下文称为5-FC)转变为5-FU的酶，5-氟胞嘧啶是具有抗肿瘤活性的5-氟尿嘧啶(下文称为5-FU)的前药(前体)。
这样的转化的细菌的构建需要表达载体。但是，因为在遗传改造领域中常规用于转化大肠杆菌的大肠杆菌来源的质粒载体不能天然地在除了大肠杆菌的细菌中复制，所以在转化的细菌的构建中必须修饰质粒载体，以便其能够在转化的细菌中复制。
在以上公布中，也报道了用于构建用于治疗恶性肿瘤的这些转化的细菌的表达载体，并且专利公布1至3报道了在大肠杆菌和梭菌两者中复制的穿梭质粒pNTR500F、pCD540FT等。
此外，专利公布4报道了在大肠杆菌和双歧杆菌两者中复制的穿梭质粒pBLES100-S-eCD和用于构建穿梭质粒pBLES100-S-eCD的穿梭质粒pBLES100。
此外，还已经报道了穿梭质粒pAV001-HU-eCD，其可以以大于100倍的穿梭质粒pBLES100-S-eCD的效率的高效率转化长双歧杆菌(参见例如专利公布5)。
此外，已经报道了穿梭质粒pAV001-HU-eCD-M968，其是穿梭质粒pAV001-HU-eCD的质粒单核苷酸变体，其中插入穿梭质粒pAV001中的靶基因的DNA已被部分改变(参见例如专利公布6)。
此外，例如，已经报道了在大肠杆菌和双歧杆菌两者中复制的穿梭质粒pDG7、在大肠杆菌和梭菌两者中复制的穿梭质粒pEBM3和pECM2、在大肠杆菌和乳酸杆菌(Lactobacillus)两者中复制的穿梭质粒pLP825等(参见例如非专利公布5)。
如上文所述，已经报道了用于构建除了大肠杆菌的转化体的各种质粒载体，它们都是在大肠杆菌和除了大肠杆菌的转化体细菌两者中复制的穿梭载体，并且没有已知的能够仅在非大肠杆菌转化体细菌中复制的质粒载体。
引用列表
专利文献
[专利公布1]美国专利第6416754号
[专利公布2]美国专利第6652849号
[专利公布3]美国提前公开第2003/0103952号
[专利公布4]JP，A，2002-97144
[专利公布5]WO 2006-57289
[专利公布6]WO 2007-136107
非专利文献
[非专利公布1]Yazawa et al，，Cancer Gene Ther.，7，269-274(2000)
[非专利公布2]Yazawa et al.，Breast Cancer Res.Treat.，66，165-170(2001)
[非专利公布3]Nakamura et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366(2002)
[非专利公布4]Fujimori et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.，5，200-203(2002)
[非专利公布5]Alessandra Argnani et al.，Microbiology.；142：109-114(1996)
发明概述
技术问题
在利用转化体基因转运体治疗缺氧环境中的疾病(下文称为缺氧疾病)的方法中，例如实体瘤或缺血性疾病，所使用的基因转运体需要非致病的专性厌氧菌，其仅在缺氧状态中的疾病组织中存活和增殖，并且不在非缺氧状态中的正常组织中存活或增殖。
此外，非常重要的是基因转运体中的转化基因不会被横向转移到除了所述基因转运体的致病细菌、需氧细菌或兼性厌氧菌，并且即使所述转化基因被横向转移，其不会在该细菌中复制。因为这点，用于构建转化体基因转运体的表达载体期望地仅在所述转化体中复制并且不在除了所述转化体的细菌中复制，特别是不在致病或需氧细菌或兼性厌氧菌中复制。
至今报道的大部分表达载体是在转化体细菌和例如大肠杆菌的除了所述转化体细菌的细菌两者中复制的穿梭载体，并且它们不是仅在非大肠杆菌转化体中复制的表达载体。
本发明的目的是提供这样的表达载体，其仅在非大肠杆菌转化体中复制，但是不在除了所述转化体的细菌中复制，特别是，不在致病或者需氧细菌或兼性厌氧菌中复制，例如大肠杆菌。
此外，本发明的另一目的是提供由表达载体所转化的厌氧微生物构成的基因转运体、含有所述基因转运体的药物组合物和含有转化体细菌的用于治疗缺氧疾病的试剂。
问题解决方法
本发明人之前在具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白中选择了表达CD的基因作为靶基因；然后构建了穿梭质粒pBLES100-S-eCD作为质粒载体，所述靶基因被插入所述质粒载体，其中携带表达CD的基因的大肠杆菌的质粒和长双歧杆菌来源的质粒被融合。本发明人已发现并报道通过使用以上来重组长双歧杆菌105A而生成的长双歧杆菌105A/pBLES100-S-eCD作为用于治疗恶性肿瘤的基因转运体是有前途的(专利公布4)。
为了进一步改进融合质粒，本发明人已报道了长双歧杆菌105A/pAV001-HU-eCD-M968及其构建方法，其中作为质粒pAV001-HU-eCD的质粒单核苷酸变体的质粒pAV001-HU-eCD-M968是通过部分地改变插入的靶基因的DNA而产生的，并且使用以上来重组长双歧杆菌105A(专利公布6)。
因为所有这些质粒都是在双歧杆菌和大肠杆菌两者中复制的穿梭质粒，所以当它们以任何原因被横向转移到大肠杆菌时，它们在大肠杆菌中复制。
本发明人为了解决以上问题已进行了深入的研究，并且通过从以上质粒pAV001-HU-eCD-M968中移除pUC ori而构建了质粒pBifiCD，pUC ori是含有大肠杆菌复制起点的片段。已经证实大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Bio Inc.)未被使用本发明的质粒pBifiCD通过热休克所转化，并且没有横向转移的可能性。
用本发明的质粒转化的细菌表现出良好的CD表达活性，并且当其与前药5-FC联合使用时表现出显著的肿瘤生长抑制作用，这表明其作为用于实体瘤的出色的治疗剂是有前途的，所述用本发明的质粒转化的细菌例如长双歧杆菌105-A/pBifiCD(技术与评价专利微生物保藏国立研究所(National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary)(NPMD)，292-0818日本千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8，保藏日期：2008年2月19日，登录号NITE BP-491)，其是重组长双歧杆菌105-A，所述前药5-FC由所述CD转变为抗肿瘤物质5-FU。
出人意料的是，还发现这些重组双歧杆菌具有高质粒保留稳定性，此外，因为它们不含有大肠杆菌复制起点，所以即使发生了向大肠杆菌的横向转移，它们在大肠杆菌中的复制也是不可能的。因此，该重组细菌作为非常安全和高质量的基因转运体是有前途的。
因此，本发明涉及
<1>表达载体，其是在厌氧微生物中发挥功能的质粒载体，所述表达载体不含有在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元，
<2>如<1>所述的表达载体，其中所述厌氧微生物是除了大肠杆菌的肠细菌，
<3>如<2>所述的表达载体，其中所述除了大肠杆菌的肠细菌是选自以下的肠细菌：双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌，
<4>如<1>至<3>中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体包含(1)在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元和(2)蛋白表达单元，其包括编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，
<5>如<4>所述的表达载体，其中所述在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元是在选自以下的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元：双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌和梭菌，
<6>如<5>所述的表达载体，其中所述在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元是在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元，
<7>如<6>所述的表达载体，其中所述在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元是包含OriV区和RepB基因的pTB6 rep单元，
<8>如<7>所述的表达载体，其中编码所述包含OriV区和RepB基因的pTB6rep单元的基因是由来自SEQ ID NO：4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性，
<9>如<4>至<8>中任一项所述的表达载体，其中所述在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子是在选自以下的细菌中发挥功能的启动子和终止子：双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌和梭菌，
<10>如<9>所述的表达载体，其中所述在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子是在双歧杆菌中发挥功能的启动子和终止子，
<11>如<10>所述的表达载体，其中所述在双歧杆菌中发挥功能的启动子和终止子是编码在双歧杆菌中发挥功能的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子，
<12>如<11>所述的表达载体，其中所述编码在双歧杆菌中发挥功能的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子是编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子，
<13>如<12>所述的表达载体，其中所述编码编码组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子的基因是由分别来自SEQ ID NO：4的第7至第367和第1676至第1789核苷酸的核苷酸序列所示的DNA，或其单核苷酸多态性，
<14>如<4>至<13>所述的表达载体，其中所述具有靶活性的蛋白是对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白，
<15>如<14>所述的表达载体，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(a)具有抗肿瘤活性的蛋白，或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，
<16>如<15>所述的表达载体，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，
<17>如<16>所述的表达载体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶，
<18>如<17>所述的表达载体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶，
<19>如<18>所述的表达载体，其中编码胞嘧啶脱氨酶的基因是由来自SEQ ID NO：4的第395至第1675核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性，
<20>如<4>至<29>中任一项所述的表达载体，其还包含(3)选择标记活性基因单元，其中所述选择标记活性选自抗药性、营养缺陷型和培养基选择性，
<21>如<20>所述的表达载体，其中所述选择标记活性是选自以下的抗药性：壮观霉素抗性、氨苄西林抗性、四环素抗性、新霉素抗性和卡那霉素抗性，
<22>如<21>所述的表达载体，其中所述选择标记活性是壮观霉素抗性，
<23>如<22>所述的表达载体，其中编码表现选择标记活性的蛋白的DNA是编码壮观霉素腺苷酸转移酶(adenyltransferase)的DNA，
<24>如<23>所述的表达载体，其中包含编码壮观霉素腺苷酸转移酶的DNA及其启动子序列的DNA是由来自SEQ ID NO：4的第3398至第4476核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性，以及
<25>如<24>所述的表达载体，其包含由SEQ ID NO：4(pBifiCD)的核苷酸序列所示的DNA序列。
此外，本发明涉及
<26>构建表达载体的过程，所述过程包括产生包含以下的穿梭质粒：(1)在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元和(2)蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，并且所述穿梭质粒在大肠杆菌和除了大肠杆菌的宿主细菌两者中复制，
并且从所述穿梭质粒移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
此外，本发明涉及
<27>基因转运体，其包含由<1>至<25>中任一项所述的表达载体转化的厌氧微生物，
<28>如<27>所述的基因转运体，其中所述厌氧微生物是除了大肠杆菌的肠细菌，
<29>如<28>所述的基因转运体，其中所述除了大肠杆菌的肠细菌选自双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌和梭菌，
<30>如<29>所述的基因转运体，其中所述除了大肠杆菌的肠细菌是双歧杆菌，
<31>如<30>所述的基因转运体，其中所述双歧杆菌选自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，
<32>如<30>所述的基因转运体，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌，
<33>如<27>至<32>中任一项所述的基因转运体，其中它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且能够表达对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白，
<34>如<33>所述的基因转运体，其中它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(a)具有抗肿瘤活性的蛋白或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，
<35>如<34>所述的基因转运体，其中它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，
<36>如<35>所述的基因转运体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶，
<37>如<36>所述的基因转运体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶，以及
<38>如<37>所述的基因转运体，其中所述基因转运体是长双歧杆菌105-A/pBifiCD(技术与评价专利微生物保藏国立研究所(NPMD)登录号NITE BP-491)。
此外，本发明涉及
<39>药物组合物，其包含<27>至<38>中任一项所述的基因转运体，
<40>药物组合物，其包含<34>至<38>中任一项所述的基因转运体和通过蛋白被转变为抗肿瘤物质的抗肿瘤物质前体的组合，所述基因转运体能够表达所述蛋白并且所述蛋白具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性，以及
<41>如<40>所述的药物组合物，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶，并且所述抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。
此外，本发明涉及
<42>用于实体瘤的治疗剂，其包含<34>至<38>中任一项所述的足以表达有效治疗剂量的具有抗肿瘤活性的蛋白的量的基因转运体，
<43>用于实体瘤的治疗剂，其包含以下的组合：<34>至<38>中任一项所述的足以表达具有将抗肿瘤物质前体转变为有效治疗剂量的抗肿瘤物质的活性的蛋白和可以被转变为有效治疗剂量的抗肿瘤物质的量的抗肿瘤物质前体，所述抗肿瘤物质前体被所述基因转运体能够表达的蛋白所转变，以及
<44>如<43>所述的实体瘤治疗剂，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶，并且所述抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。
在本申请中，编码(a)具有抗肿瘤活性的蛋白的DNA或编码(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的DNA下文可以称为“编码靶蛋白的DNA”。
发明的有利效果
本发明的表达载体不包含在除了转化体细菌的细菌中，特别是在大肠杆菌中发挥功能的复制起点，并且它是非常安全的载体，不存在在除了所述转化的细菌的细菌中复制的可能性，特别是不在致病或需氧或兼性厌氧细菌中复制，例如大肠杆菌。
使用本发明的表达载体转化的基因转运体具有高质粒保留稳定性；并且如上文所述，即使所述载体被横向转移到除了所述转化体的细菌，特别是转移到致病或者需氧或兼性厌氧细菌，例如大肠杆菌，也不存在在这些其他细菌中复制的风险。因此，本发明的基因转运体作为高度安全的、高质量的基因转运体是有前途的。
附图简述
[图1]展示构建选择标记质粒(pSPCM-pUC ori)的步骤的图(步骤1)。
[图2]展示构建选择标记活性蛋白质粒(pHU-eCDm-SPCM-pUC ori)的步骤的图(步骤2)。
[图3]展示构建穿梭质粒(pCD穿梭(pCDshuttle))的步骤的图(步骤3)。
[图4]展示构建质粒“pBifiCD”的步骤的图(步骤4)。
[图5]展示长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的抗肿瘤效果的图。
实施方案描述
本发明的表达载体是这样的质粒载体，其在厌氧细菌中并且特别是除了大肠杆菌的肠细菌中发挥功能，例如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌，并且本发明的表达载体是不含有在除了转化的细菌的细菌中，特别是大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元的表达载体。更具体地，本发明的表达载体是例如包含以下的表达载体：(1)在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元，和(2)蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，并且所述表达载体不含有在除了所述转化体细菌的细菌中，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
至今已报道的大部分质粒载体是通过将大肠杆菌来源的质粒和转化体细菌来源的质粒融合而构建的，这是因为基因转染技术的积累信息和转染的确保。它们是在大肠杆菌和转化体细菌两者中发挥功能的穿梭载体，并且不是仅在非大肠杆菌的转化体细菌中发挥功能的表达载体。
本发明的表达载体特征在于，例如，其基本上由以下组成(1)在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元和(2)蛋白表达单元，其基本上由编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段组成。并且所述表达载体不含有在除了所述转化体细菌的细菌中，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的本发明的表达载体的质粒复制单元可以是任何质粒复制单元，只要其在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能，例如在诸如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌的肠细菌中发挥功能，并且只要其在除了转化体细菌的厌氧微生物中不发挥功能；在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的本发明的表达载体的质粒复制单元的实例包括在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元，例如，在双歧杆菌中发挥功能。具体实例包括基本上由在双歧杆菌中发挥功能的OriV区和RepB基因组成的pTB6 rep单元，或其单核苷酸多态性。更多具体实例包括由来自SEQ ID NO：4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性。
此外，本发明的表达载体的蛋白表达单元的启动子和终止子可以是任何启动子和终止子，只要它们在厌氧微生物中发挥功能，例如，在诸如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌的肠细菌中发挥功能；本发明的表达载体的蛋白表达单元的启动子和终止子的实例包括编码在厌氧微生物中发挥功能的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子，例如，编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子DNA，或其单核苷酸多态性。具体实例包括由分别来自SEQ ID NO：4的第7至第367和第1676至第1786核苷酸的核苷酸序列所示的DNA，或其单核苷酸多态性。
此外，本发明的表达载体还可以包含(3)选择标记活性基因单元。本发明的表达载体所具有的选择标记活性不是特殊限定的，只要其能够选择由本发明的质粒载体转化的厌氧微生物；本发明的表达载体所具有的选择标记活性的实例包括抗药性标记和营养缺陷型，所述抗药性标记例如壮观霉素抗性、氨苄西林抗性、四环素抗性、新霉素抗性或卡那霉素抗性，并且壮观霉素抗性是优选的。
选择标记活性基因单元的实例包括，例如含有编码表现壮观霉素抗性活性的蛋白的DNA或其单核苷酸变体的DNA及其启动子序列；例如，编码粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的壮观霉素腺苷酸转移酶(下文称为AAD9盒)的DNA或其单核苷酸多态性。具体实例包括由来自SEQ ID NO：4的第3398至第4476核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性。
本发明涉及的“单核苷酸变体”表示单核苷酸多态性，其中至少一个位点的核苷酸已被改变(下文称为SNP)，并且不仅包括在仅一个位点的SNP还包括在许多位点的SNP。
例如当本发明的缺氧疾病的治疗剂被用作恶性肿瘤的治疗剂时，被并入本发明的表达载体的蛋白表达单元的基因可以是任何基因，只要其表达具有抗肿瘤活性的蛋白或具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，并且只要其不是例如巨大DNA(至少约10kb)的抑制转化的DNA或对于接受体细胞有毒的DNA。
由所述基因表达的具有抗肿瘤活性的蛋白包括，例如细胞因子，细胞因子的具体实例包括干扰素(IFN)-α、β和γ，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15和18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T-细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)、KIT配体和制瘤素M。此外，实例包括血管发生抑制物质，例如内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)和三环(kringle)1、2、3、4和5。
这些蛋白的序列对于不同生物是已知的，并且本发明中使用的编码具有抗肿瘤活性的蛋白的DNA可以通过利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技术来获得。
此外，具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的实例包括：胞嘧啶脱氨酶(下文称为CD)，其是将5-氟胞嘧啶(下文称为5-FC)转变为抗肿瘤活性物质5-氟尿嘧啶(下文称为5-FU)的酶；硝基还原酶，其是将5-氮杂环丙基-2，4-二硝基苯甲酰胺(下文称为CB1945)转变为抗肿瘤活性烷化剂的酶；1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(下文称为HSV1-TK)，其是将更昔洛韦转变为抗肿瘤活性代谢产物的酶；以及β-葡糖醛酸糖苷酶，其是将葡糖醛酸化的抗肿瘤活性物质转变为抗肿瘤活性物质的酶。优选的实例包括CD，其是将5-FC转变为5-FU的酶。
编码CD的DNA可以是，例如，质粒pAdex 1 CSCD(Riken Gene Bank RDB No.1591)，其含有编码大肠杆菌来源的CD的DNA，或分离自质粒pMK116的DNA，其类似地含有编码大肠杆菌来源的CD的DNA(D.A.Mead et al.，Protein Engineering 1：67-74(1986))。
编码大肠杆菌来源的CD的DNA的实例包括由SEQ ID NO：4的第395至第1675核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性。
此外，当本发明的缺氧疾病的治疗剂被用作缺血性疾病的治疗剂时，具有血管生成促进活性的蛋白可以被用作并入本发明的表达载体的蛋白表达单元的基因，所述血管生成促进活性对于治疗缺血性疾病是有用的。具体实例包括成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)。
类似地，这些蛋白的序列对于不同生物是已知的，并且本发明中使用的编码具有血管生成促进活性的蛋白的DNA可以通过利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技术来获得。
本发明的载体包括任何载体，只要其是包含以下的质粒，例如，在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元；蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和含有在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段；以及选择标记活性基因单元。并且只要当所述质粒被转化入厌氧微生物时能在所述厌氧微生物中发挥功能。以及只要所述质粒不含有在除了所述转化体细菌的细菌中，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
实例包括通过以下方法构建的质粒：将包含编码具有靶活性的给定蛋白的DNA和包含在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段的蛋白表达单元并入以下穿梭质粒，并且移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元：pBLES100(专利公布4)、pAV001(专利公布5)、pBRASTA101(Tanaka et al.，2005，Biosci.Biotechnol.Biochem.，69(2)：422-425)、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825等(非专利公布5)，以上在公布中已有报道。
本发明的载体的其他实例包括通过将被并入质粒的蛋白表达单元与另一给定的蛋白表达单元重组并且还移除了在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元而构建的那些，所述被并入的质粒例如pNTR500F、pCD540FT等(专利公布1至3)、pBLES100-S-eCD(专利公布4)、pAV001-HU-eCD(专利公布5)、pAV001-HU-eCD-M968(专利公布6)等。
本发明的表达载体的具体实例包括，例如这样的载体，其具有：作为在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元的pTB6 rep单元，其包含在双歧杆菌中发挥功能的RepB基因和OriV区，和作为含有在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段的编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子；和作为编码具有靶活性的蛋白的DNA的编码将5-FC转变为5-FU的CD酶的DNA；以及作为选择标记活性基因单元的编码粪肠球菌来源的壮观霉素腺苷酸转移酶的DNA(AAD9盒)，。
更多具体实例包括pBifiCD，其由SEQ ID NO：4的核苷酸序列所示。
本发明的载体可以通过例如以下的方法构建。
例如，本发明的载体可以通过以下构建
(1)构建质粒，其包含例如pUC ori的大肠杆菌的复制起点和例如AAD9盒的选择标记活性基因单元(下文称为选择标记质粒)(下文称为步骤1)，
(2)制备选择标记质粒的线性质粒，将其与例如编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子的启动子和终止子以及(a)具有抗肿瘤活性的蛋白或(b)例如包含CD的片段的具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白(下文称为蛋白表达单元)连接，以构建具有选择标记活性基因单元和蛋白表达单元的质粒(下文称为选择标记活性蛋白质粒)(下文称为步骤2)，
(3)制备该选择标记活性蛋白质粒的线性质粒，将其与例如包含在双歧杆菌中发挥功能的RepB基因和OriV区的pTB6 rep单元的DNA片段的在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元(下文称为质粒复制单元)连接，以构建具有大肠杆菌复制起点和选择标记活性基因单元、蛋白表达单元和质粒复制单元的质粒(下文称为穿梭质粒)(下文称为步骤3)，并且
(4)从该穿梭质粒移除大肠杆菌复制起点(下文称为步骤4)。
每个步骤的操作可以按照文献中描述的已知方法实施。
载体也可以通过将蛋白表达单元通过标准方法并入上文提及的不同穿梭质粒，然后通过标准方法类似地移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元而构建，所述穿梭质粒例如穿梭质粒pBLES100(专利公布4)、pAV001(专利公布5)、pBRASTA101(Tanaka et al.，2005，Biosci.Biotechnol.Biochem.，69(2)：422-425)、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825等(非专利公布5)、pNTR500F、pCD540FT等(专利公布1至3)，所述蛋白表达单元包含编码具有靶活性的给定蛋白的DNA和含有在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段。
此外，以与上文本发明的质粒pBifiCD相同的方式，其中含有大肠杆菌复制起点的片段的pUC ori从质粒pAV001-HU-eCD-M968(专利公布6)被移除，本发明的载体也可以通过将在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元从质粒pNTR500F、pCD540FT(专利公布1至3)、pBLES100-S-eCD(专利公布4)、pAV001-HU-eCD(专利公布5)等移除来构建。
此外，本发明的载体也可以通过将被并入质粒pNTR500F、pCD540FT(专利公布1至3)、pBLES100-S-eCD(专利公布4)、pAV001-HU-eCD(专利公布5)、pAV001-HU-eCD-M968(专利公布6)等的蛋白表达单元与另一给定蛋白表达单元重组，然后从其中移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元来构建。
本发明的用于治疗缺氧疾病的基因转运体可以通过转化给定厌氧微生物来构建，所述给定厌氧微生物按照已知遗传改造方法使用本发明的表达载体进行转化。
因为通过本发明的表达载体转化的厌氧微生物是在用于治疗例如实体瘤的缺氧疾病的试剂中使用，所以该厌氧微生物必须是是专性厌氧且非致病的；可以使用例如梭菌或沙门氏菌(Salmonella)的致病细菌，如果它们成为非致病的，并且可以使用例如乳酸杆菌的兼性厌氧菌，如果它已突变为专性厌氧的。
优选的实例包括非致病厌氧细菌；非致病肠细菌是更优选的，并且在它们中双歧杆菌是最优选的。
双歧杆菌的实例包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、双歧双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，并且长双歧杆菌是最优选的。
这些细菌是商业上可获得的或容易地从保藏机构获得的。例如，长双歧杆菌ATCC-15707、双歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等可以容易地从ATCC(美国模式培养物保藏中心(The American Type Culture Collection))获得。
每种细菌的菌株不是特殊限定的，并且长双歧杆菌的菌株的实例包括长双歧杆菌105-A菌株、长双歧杆菌aE-194b菌株、长双歧杆菌bs-601菌株和长双歧杆菌M101-2菌株，并且在它们中长双歧杆菌105-A菌株是优选的。
短双歧杆菌的菌株的实例包括短双歧杆菌标准菌株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1菌株和短双歧杆菌I-53-8W菌株，并且在它们中短双歧杆菌标准菌株和短双歧杆菌aS-1菌株是优选的。
婴儿双歧杆菌的菌株的实例包括婴儿双歧杆菌标准菌株(JCM1222)和婴儿双歧杆菌I-10-5菌株，并且在它们中婴儿双歧杆菌标准菌株和婴儿双歧杆菌I-10-5菌株是优选的。
此外，乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactentis)的菌株的实例包括乳双歧杆菌标准菌株(JCM1220)。
本发明的基因转运体是包含通过本发明的表达载体转化的厌氧微生物的基因转运体，并且不是特殊限定的，只要其能够在缺氧环境中的组织中生长并且能表达具有靶活性的蛋白，此外，具有很小的或没有被横向转移到除了所述转化体的细菌，特别是横向转移到致病或需氧或兼性厌氧微生物的可能性。
本发明的基因转运体的优选的实例包括这样的基因转运体，其能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且能够表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。更优选的实例包括包含能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长的并且能够表达将5-FC转变为5-FU的CD酶的双歧杆菌的基因转运体。特别优选的实例包括通过pBifiCD转化的长双歧杆菌105-A菌株(长双歧杆菌105-A/pBifiCD；NPMD参考号NITE ABP-491)，其在2008年2月19日保藏于独立行政法人技术与评价专利微生物保藏国立研究所(Incorporated Administrative Agency National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary(NPMD))(292-0818日本千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8)，登录号为NITE BP-491。
本发明的基因转运体可以按照商业实验教科书中描述的方法来构建，例如Gene Manual(基因手册)(Kodansha)，Gene Manipulation Experimental Method (基因操作实验方法)，Ed.作者Yasuyuki Takagi(Kodansha)，Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，Molecular Cloning 2nd Edition(分子克隆第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)或Methods in Enzymol.(酶学方法)，194(1991)。
本发明的药物组合物不是特殊限定的，只要其含有本发明的基因转运体。此外，本发明的缺氧疾病的治疗剂不是特殊限定的，只要其含有本发明的基因转运体。
此外，本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以含有两种或更种的本发明的基因转运体。
此外，本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以与含有除了本发明的基因转运体的表现出缺氧疾病治疗效果的化合物的用于缺氧疾病药物组合物或治疗剂联合使用。
此外，本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以含有除了本发明的基因转运体的其他组分，只要本发明的效果不受影响。这些其他组分的实例包括药学上可接受的支持物、赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物或缺氧疾病治疗剂的剂型不是特殊限定的，并且其实例包括含有本发明的基因转运体的液体试剂或固体制剂。液体试剂可以通过纯化本发明的基因转运体的厌氧细菌的培养液，按照要求向其添加适当的生理盐水、液体替换品或医药添加剂，并用其填装安瓿、小瓶等而产生。固体制剂可以通过向液体试剂添加合适的保护剂，用其填装安瓿、小瓶等，并且然后冻干或L-干燥而产生，或通过向液体试剂添加合适的保护剂，将其冻干或L-干燥，并且然后用其填装安瓿、小瓶等而产生。对于本发明药物组合物或缺氧疾病治疗剂的给药方法，口服给药和肠胃外给药两者都是可以的，但肠胃外给药是优选的，例如可以进行静脉内注射、皮下注射、局部输注或脑室内给药，并且静脉内注射是最优选的。
本发明的药物组合物或缺氧疾病治疗剂的基因转运体的剂量不是特殊限定的，只要其对于在疾病位置生长和表达有效治疗剂量的活性蛋白是足够的量。但是，从经济观点和降低副作用的目的而言，剂量优选地在能获得所需的治疗效果的范围内尽可能地小。
本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂中的基因转运体的剂量根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别适当选择，并且可以根据改善程度适当增加或减少。
例如，当将本发明的缺氧疾病治疗剂用作实体瘤治疗剂时，根据厌氧微生物自身表现出的抗肿瘤活性、具有所使用的厌氧微生物产生的抗肿瘤活性的蛋白的类型、转变自抗肿瘤物质前体的抗肿瘤物质的有效治疗剂量、所使用的厌氧微生物产生的活性蛋白的量等来适当地确定剂量。
具体地，在静脉内给药的情况下，因为降低例如由于大量细菌的栓塞风险是特别必需的，所以优选使用以尽可能低的浓度的注射，将注射分为多次注射或用适当的液体代替品稀释注射并且通过连续输注给药。例如，在成人的情况下，将每天106cfu至1012cfu每千克体重的本发明的厌氧微生物的细胞分为1至多次、视情况连续或间隔地进行给药，并且持续1天至多天。更具体地，每成人直接给予1mL至1000mL含有104cfu/mL至1010cfu/mL的本发明的厌氧微生物细胞的制剂，或用适当的液体代替品稀释，分为每天一次至多次进行给药，并且持续1天至连续几天。
此外，在涉及直接对疾病组织直接给药的局部给药的情况下，因为需要细菌细胞在整个疾病组织中尽可能多地建群和增殖，所以在疾病组织的多个位置给予高浓度注射是可取得。例如，在成人的情况下，每天一次或多次给予106cfu至1012cfu每千克体重的本发明的厌氧微生物的细胞，视情况连续或间隔地进行给药，并且按照需要持续1天至多天。更具体地，每成人直接地给予1mL至1000mL含有104cfu/mL至1010cfu/mL的本发明的厌氧微生物的细胞的制剂直接地，优选每天一次至多次，并且按照需要连续地持续1天至几天。
当在治疗期间观察到疾病组织中的细菌已消失，则首先暂停治疗，然后以如以上相似的方式给予细菌。
当本发明的基因转运体或缺氧疾病治疗剂是厌氧细菌，其中插入了能够表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的基因时，将含有作为活性组分的基因转运体的本发明的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂与一定量的可以通过所述基因转运体表达的蛋白转变为有效量的抗肿瘤物质的抗肿瘤物质前体联合使用。该抗肿瘤物质前体可以作为活性组分包含在含有本发明的基因转运体的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂中，但是其优选用作含有抗肿瘤物质前体的药物组合物，该含有抗肿瘤物质前体的药物组合物与含有作为活性组分的本发明的基因转运体的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂组合。
用于本发明的抗肿瘤物质前体不是特殊限定的，只要其在前体(前药)状态时对于正常组织具有较少的副作用的抗肿瘤物质前体，并且在转变为抗肿瘤物质后对于作为治疗靶标的实体瘤具有高治疗效果。实例包括5-FC，其是5-FU的前药；CB1945，其被转变为抗肿瘤活性烷化剂；更昔洛韦，其被转变为抗肿瘤活性代谢产物；以及葡糖醛酸化的抗肿瘤活物质。
以这种方式，当将本发明的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂与抗肿瘤物质前体联合使用时，给予本发明的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂的方法可以与给予含有抗肿瘤物质前体的药物组合物的方法相同或不同，并且这些给药可以同时或在分别的时间进行；含有抗肿瘤物质前体的药物组合物的给药优选地在给予本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂后，允许足够的时间以使本发明的基因转运体在肿瘤细胞上生长之后进行。
此外，当将本发明的药物组合物或用于实体瘤的治疗剂与抗肿瘤物质前体联合使用时，因为基因转运体仅在缺氧环境中的肿瘤细胞组织中建群和增殖，并且在那里局部地产生活性蛋白，所以与使用普通抗肿瘤物质前体治疗实体瘤的方法相比，可以显著地抑制副作用，并且可以将抗肿瘤物质前体的剂量设定在宽范围内。
含有抗肿瘤物质前体的药物组合物的形式不是特殊限定的，并且其可以是任何普通口服制剂，例如粉剂、片剂或胶囊剂；或肠胃外制剂，例如栓剂或注射剂。这样的药物组合物可以通过普通药物方法生产。
抗肿瘤物质前体的剂量可以根据联合使用的基因转运体在肿瘤组织中的生长速率和抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的效率适当进行选择。以与基因转运体的剂量相同的方式，抗肿瘤物质前体的剂量可以根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别视情况进行选择，并且可以根据改善的程度视情况增加或减少。
例如，在实际治疗中，剂量根据使用的抗肿瘤物质前体和转变的抗肿瘤物质的类型、转变自抗肿瘤物质前体的抗肿瘤物质的有效治疗剂量、具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的厌氧微生物所产生的活性蛋白的类型以及使用的厌氧微生物所产生的活性蛋白的量等来适当设定。
具体地，例如，当将含有作为活性组分的长双歧杆菌105-A/pBifiCD(NITE BP-491)的药物组合物和含有作为活性组分的抗肿瘤物质前体5-FC的药物组合物联合给药时，所述长双歧杆菌105-A/pBifiCD具有被引入其中的CD基因并且是本发明的基因转运体，在确认细菌已经在肿瘤组织中建群和增殖，并且细菌已经从血液和正常组织消失后，以1mg/天至100mg/天每成人千克体重、每天一次或多次、在治疗期间连续给予5-FC。给药方法优选为口服给药，但是可以进行例如静脉内给药或肝门给药的肠胃外给药。
本发明涉及的“X和Y的组合”包括X和Y在不同配置(configuration)的情况以及X和Y在相同配置的情况(例如含有X和Y的配置)。当X和Y在不同配置时，X和Y可以各自另外含有另一组分。
本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以应用于缺氧环境中的疾病，并且优选地应用于不同类型的实体癌。实体癌的实例包括大肠癌、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤和鳞癌。
此外，在缺氧环境中的其他疾病的实例包括缺血性疾病，例如心肌梗死或闭塞性动脉硬化，以及下肢缺血性疾病，例如伯格病(Buerger’s disease)。
实施例
结合参考实施例和实施例，本发明在下文更具体地进行解释，但是本发明的技术范围不局限于这些实施例。
<参考实施例1>
DNA模板的制备
将在每个实施例中用作模板的质粒DNA的浓度使用0.1×TE调整至10pg/微升并且贮存在-30℃的冷冻柜中直到使用。用作模板的每个质粒DNA显示在下文表1中。
[表1]
表1 质粒组分和这些组分在新质粒中的作用
<参考实施例2>
引物的制备
将用于PCR扩增和用于检查的每个引物使用0.1×TE溶解以得到100μM的储备液。将该储备液用0.1×TE进一步稀释以得到20μM的引物溶液。将其贮存在-30℃的冷冻柜中直到使用。使用的引物显示在下文表2中。
[表2]
表2 用于质粒的构建和检查的引物
*1：破坏memb B的推定的核糖体结合位点和推定的翻译起始密码子
<参考实施例3>
琼脂糖凝胶电泳
每个下文实施例中的琼脂糖凝胶电泳按照以下进行。
按照需要将样品使用0.1×TE以10倍的级别稀释，并且对样品进行使用用于分析的0.8％或2％的琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲液(含有0.5μg/mL的溴化乙锭)的电泳。琼脂糖凝胶的浓度根据DNA样品的大小来确定。通过同时在不同泳道中将DNA分子量标记进行电泳来检查样品的DNA大小。
当必须定量地测量样品时，使用例如FastRuler DNA梯、低范围(Low Range)(Fermentas)或FastRuler DNA梯、中等范围(Middle Range)(Fermentas)的定量标记。每个定量标记的条带的量为5ng至50ng的级别。
电泳后，将凝胶用UV照射，并且通过比较定量标记的DNA浓度和样品的DNA浓度来估计样品的DNA浓度。
<实施例1>
选择标记质粒(pSPCM-pUC ori)的构建(步骤1)
质粒pSPCM-pUC ori按照下文操作构建。
(1)pUC ori片段的制备(约700bp)
用于pUC ori的PCR扩增条件的检查
使用pBluescript II SK+作为模板，通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/μl pBluescript II SK+、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM pUC ori-F1引物、0.5μl的20μMpUC ori-R1引物、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和29.5μl的无菌纯净水来在冰上制备PCR混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度(block temperature)达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.1]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，将1μl和3μl的反应混合物进行参考实施例3中所示的琼脂糖凝胶电泳，从而检查PCR产物。作为凝胶，使用2％分析琼脂糖凝胶。
根据琼脂糖凝胶分析的结果，确认了存在约700bp的靶单一条带的扩增，并且产量为约1μg。
另外的PCR
按照上文设定的条件进行5管另外的PCR，并且总计获得约10μg的PCR产物。
纯化(蛋白去除和浓缩)
将所有的PCR反应混合物合并后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)将它们纯化，并且通过标准方法去除引物和蛋白。对于DNA洗脱，使用50μl的0.1×TE。
将纯化的PCR产物用0.1×TE稀释10倍，并且使用琼脂糖凝胶电泳来定量。作为凝胶，使用2％分析琼脂糖凝胶。
用限制性酶处理PCR产物
按照以下使用限制性酶Bcu I和Bgl II切割纯化的PCR产物。
将10μl的10×O缓冲液(酶附带的缓冲液)和55单位的Bgl II加入5μg的纯化的PCR产物，并且使用0.1×TE将总量补足为100μl。37℃下孵育2小时后，按照参考实施例4中所述的方法去除蛋白。将30μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和255单位的Bcu I加入其中，并且使用0.1×TE将总量补足为300μl。37℃下孵育2小时后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)将混合物纯化，并且用50μl的0.1×TE洗脱。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
将由限制性酶所切割的PCR产物及其1/10的量的10×上样缓冲液(loading buffer)(Takara Bio Inc.)充分混合以得到用于电泳的样品。将用于纯化的2％琼脂糖凝胶放置在装有1×TAE缓冲液(具有0.5μg/mL的溴化乙锭)的电泳槽中(Mupid，Cosmo Bio Co.，Ltd.)，将电泳样品置于其上，并且在低温房间中(设定为4℃)以50V进行电泳。分子量标记(FastRuler DNA梯，低范围，Fermentas)在单独的泳道中同时行进。
通过UV手持监测器(UVP)，用365nm的UV照射琼脂糖凝胶来确定DNA迁移。开始电泳后130分钟，当约700bp的靶条带达到约1/2凝胶长度的位置时，停止电泳，并且将凝胶从电泳槽中取出。
在用365nm的UV照射凝胶的同时，使用灭菌的刀片(无菌手术刀片(Sterile Surgical Blades)，Ruettgers HmbH&Co.KG)切下靶DNA条带。精细地将切下的凝胶切片，并且置于灭菌的2mL微型管中，预先测量了所述微型管的重量。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
测量装有切下的凝胶的2mL微型管的重量，并且通过从其中减去预先测量的空管的重量来计算凝胶重量。使用QIA快速凝胶提取试剂盒，按照产品说明书从凝胶中提取DNA。最终步骤中的DNA的洗脱使用50μl的0.1×TE。
将部分的纯化的PCR产物用0.1×TE稀释10倍，并且使用分光光度计定量分析纯化的PCR产物。使用2％分析琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳。
对于进行了PCR产物限制性酶处理、DNA片段从琼脂糖凝胶的切除和纯化的DNA片段，确认了在琼脂糖凝胶分析中得到了单一条带。此外，根据通过使用吸收比色计的DNA测量的浓度测量结果，浓度为66ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为1.911。
(2)AAD9片段(约1.1kbp)的制备
用于AAD9基因的PCR扩增条件的检查
使用pBLES100作为模板，通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/μl pBLES100、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM AAD9-F1引物、0.5μl的20μM AAD9-R1引物、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和29.5μl的无菌纯净水在冰上制备PCR混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.2]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，将1μl和3μl的反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而检查PCR产物。作为凝胶，使用2％分析琼脂糖凝胶。
根据琼脂糖凝胶分析的结果，确认了存在约1.1kbp的靶单一条带的扩增。产量为约1μg。
另外的PCR
以如上文相同的方式，进行5管的另外的PCR，并且总计获得约10μg的PCR产物。
纯化(蛋白去除和浓缩)
将所有的PCR反应混合物合并后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒将它们纯化，并且通过标准方法去除引物和蛋白。对于DNA洗脱，使用50μl的0.1×TE。
将纯化的PCR产物用0.1×TE稀释10倍，并且使用琼脂糖凝胶电泳来定量。作为凝胶，使用2％分析琼脂糖凝胶。
用限制性酶处理PCR产物
按照以下使用限制性酶Bcu I和Bgl II切割纯化的PCR产物。
将10μl的10×O缓冲液(酶附带的缓冲液)和36单位的Bgl II加入5μg的纯化的PCR产物，并且使用0.1×TE将总量补足为100μl。37℃下孵育2小时后，去除蛋白。将30μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和165单位的Bcu I加入其中，并且使用0.1×TE将总量补足为300μl。37℃下孵育2小时后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒将混合物纯化，并且用50μl的0.1×TE洗脱。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与上文提及的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”中相同的方法，将由限制性酶切割的PCR产物通过将其进行电泳130分钟来分级，并且切下约1.1kbp的靶条带。作为凝胶，使用0.8％琼脂糖凝胶用于纯化。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
测量装有切下的凝胶的2mL微型管的重量，并且通过从其中减去预先测量的空管的重量来计算凝胶重量。使用QIA快速凝胶提取试剂盒，按照产品说明书从凝胶中提取DNA。最终步骤中的DNA的洗脱使用50μl的0.1×TE。
将部分的纯化的PCR产物用0.1×TE稀释10倍，并且使用分光光度计定量分析纯化的PCR产物。使用2％分析琼脂糖凝胶进行电泳。
对于进行了PCR产物限制性酶处理、DNA片段从琼脂糖凝胶的切除和纯化的DNA片段，确认了在琼脂糖凝胶分析中得到了单一条带。此外，根据通过使用吸收比色计的DNA测量的浓度测量结果中，浓度为40ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为1.927。
(3)pUC ori片段和AAD9片段的连接
连接反应混合物(反应混合物1)通过在冰上，于灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中，混合以下进行制备：4μl的5×快速连接缓冲液、0.75μl(50ng)的pUC ori片段(66ng/μl)、6.25μl(250ng)的AAD9片段(40ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和8μl的0.1×TE，从而纯化的pUC ori片段(约700bp)与纯化的AAD9片段(约1.1kbp)的摩尔比为1∶3，并且其重量比为1∶5。
作为对照，反应混合物(反应混合物2)仅用纯化的AAD9片段来制备。即，将4μl的5×快速连接缓冲液、6.25μl(250ng)的AAD9片段(40ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和8.75μl的0.1×TE在冰上混合，从而得到连接反应混合物(反应混合物2)。
因为AAD9片段使用质粒pBLES 100(专利公布4：JP，A，2002-97144)作为模板，所以即使添加了少量的质粒pBLES 100，在转化大肠杆菌的后续步骤后，其形成作为背景的菌落(colony)。将反应混合物2用作用于检查该背景的对照。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到22℃后，将管置于其上，并且进行连接。
[Math.3]
22℃ 5分钟 (连接反应)
65℃ 5分钟 (反应停止)
4℃ ∞
(4)大肠杆菌的转化
连接反应后，使用1μl的溶液通过热休克来转化大肠杆菌JM109。用于转化的操作过程按照Takara大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Bio Inc.)的产品说明书中所述的方法进行。对于转化后的SOC悬液，将100μl的原始液体和100μl用SOC稀释的10倍稀释液涂板于两块LB琼脂培养基上(含有75μg/mL SPCM)。将用使用连接反应混合物1和2转化的大肠杆菌接种的平板分别定义为平板1和2。将这些平板置于设定为37℃的培养箱中并过夜培养。计数了平板上形成的菌落数。
当使用纯化的pUC ori片段和纯化的AAD9片段(连接反应混合物1)的连接产物进行转化时，每100μl的10倍稀释的细菌液体在选择培养基上形成了28和37个菌落，但是当使用对照的反应混合物2进行转化时，未形成菌落。背景非常低，这表明良好地进行了连接和转化。
(5)检查质粒
重组大肠杆菌的培养
随机选择了上文平板1上的6个菌落，并且使用它们进行培养。用20mL的2×LB填装灭菌的100mL玻璃锥形瓶，并且向其中添加20μl的75mg/mL壮观霉素并充分混合。使用铂环钓起(fish)每个菌落，并且在上文提及的培养基中悬浮。将它们置于设定为37℃的摇动培养箱中，并且于37℃下在摇动的同时培养19.5小时。
质粒DNA的提取
将1.5mL的每种培养液置于两个灭菌的2mL微型管中。将剩余的培养液留在冰上直到完成质粒的提取。使用GeneEluteTM质粒Miniprep试剂盒(GeneEluteTM Plasmid Miniprep Kit)，按照试剂盒的产品说明书，从分配的培养液提取质粒DNA。对于最终步骤中质粒DNA的洗脱，使用50μl的0.1×TE。
质粒DNA浓度的测量
将上文提取的质粒用0.1×TE稀释20倍，通过分光光度计测量DNA浓度，并且通过A260/280比值检查质量。
根据进行两次从重组大肠杆菌提取质粒的结果，表明DNA纯度的A260/280比值为1.944至1.972，并且质粒DNA的纯度良好。当合并两种提取物时，产量为至少5μg。
限制性酶切割
使用100ng的质粒DNA进行Bcu I独自的切割、Bgl II独自的切割以及Bcu I和Bgl II两者的切割。反应条件按照酶的产品说明书。反应体积为20μl。
对于所有6个菌落菌株，当进行两种类型的酶Bcu I和Bgl II的切割时，检测到约700bp和约1.1kbp的两个条带。
此外，当进行Bcu I或Bgl II中单一酶的切割时，检测到约1.8kbp的一个条带。这表明对于所有菌株，质粒大小和组成正如所设计的。
检查质粒DNA序列
将20μl的由上文的限制性酶切割的质粒DNA溶液与2μl的10×上样缓冲液充分混合，并且将该混合物通过标准方法进行电泳。
利用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)，使用通过上文的电泳提取的质粒，进行测序反应。作为测序引物，使用了显示在下文表3中的引物对1和2。
使用GENETY(R)ATSQ分析软件(Genetyx公司)进行序列的比对。将比对后的质粒核苷酸序列与设计的序列(SEQ ID NO：1)进行比较。
在6个菌株中，4个菌株的质粒序列与设计的SEQ ID NO：1的序列匹配，但是剩余的2个质粒菌株分别具有核苷酸取代和缺失。
从与SEQ ID NO：1匹配的4个菌株中选择了一个菌株，并且将从该菌株提取的质粒定义为“pSPCM-pUC ori”。
[表3]
表3测序引物
<实施例2>
选择标记活性蛋白质粒(pHU-eCDm-SPCM-pUC ori)的构建(步骤2)
(1)线性质粒pSPCM-pUC ori的制备
质粒的切割
使用限制性酶Bcu I、Xho I和Bam HI，按下文所述，切割pSPCM-pUC ori。进行Xho I的切割是为了抑制在未切割的质粒转化时的背景。
将25μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和100单位的Bcu I添加到5μg的pSPCM-pUC ori，并且使用0.1×TE将总量补足为250μl。37℃下孵育2小时后，取出其中100ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认了已完成分解。
在等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。确认切割后，从酶反应混合物中去除蛋白。
将20μl的10×Bam HI缓冲液(酶附带的缓冲液)和80单位的Bam HI添加到其中，并使用0.1×TE将总量补足到200μl。37℃下孵育2小时后，取出其中100ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认了DNA未经历内部分解。
在等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。确认切割后，从酶反应混合物中去除蛋白。
将50μl的10×R缓冲液(酶附带的缓冲液)和400单位的Xho I添加到其中，并使用0.1×TE将总量补足到500μl。37℃下孵育2小时后，从酶反应混合物中去除蛋白。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与实施例1中描述的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”中相同的方法，将由限制性酶切割的载体通过将其电泳75分钟来进行分级，并且切下约1.8kbp的靶条带。作为凝胶，使用0.8％琼脂糖凝胶用于纯化。作为分子量标记，使用了FastRuler DNA梯，中等范围(Fermentas)。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与实施例1中描述的“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
将部分的进行了琼脂糖凝胶纯化的载体使用0.1×TE稀释3倍，并通过分光光度计进行定量分析。对于制备的载体是否为约1.8kbp的单一条带，使用0.8％分析琼脂糖凝胶进行了确认。
对于进行了质粒pSPCM-pUC ori限制性酶处理、从琼脂糖凝胶的DNA片段切除和纯化的DNA片段，确认了在琼脂糖凝胶分析中得到了单一条带。在使用吸收比色计的DNA测量中，浓度为21ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为2.049。
(2)插入物(HU-eCD片段)的制备
使用质粒pAV001-HU-eCD-M968(专利公布5：WO 2007/136107)，通过PCR扩增了含有HU-eCD-M968(双歧杆菌的HU蛋白的N-末端9个氨基酸和大肠杆菌来源的CD被融合，并且为了增强对底物5-FC的亲和力在其中引入变异的蛋白)、HU启动子和HU终止子的DNA片段。
按照以下进行两个阶段的PCR(第一PCR和第二PCR)，并制备了HU-eCD片段。
第一PCR
用于PCR扩增的条件的检查
检查两种类型片段(HU-eCD片段1和HU-eCD片段2)的PCR扩增条件。
使用pAV001-HU-eCD-M968作为模板，通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/mL pAV001-HU-eCD-M968、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μMHUeCD F3引物、0.5μl的20μM HUeCD内部R1引物、0.5μl的PrimeSTARHSDNA聚合酶和29.5μl的0.1×TE来在冰上制备PCR混合物(HU-eCD片段1)。以相同方式制备3管该混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.4]
72℃ 60秒
4℃ ∞
以相同方式，使用pAV001-HU-eCD-M968作为模板，通过向灭菌的0.2mLPCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/mL pAV001-HU-eCD-M968、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM HUeCD内部F1引物、0.5μl的20μM HUeCD R1引物、0.5μl的PrimeSTARHSDNA聚合酶和29.5μl的0.1×TE来在冰上制备PCR混合物(HU-eCD片段2)。以相同方式制备8管该混合物。
以相同方式，热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.5]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，将反应混合物合并于一管中。
PCR完成后，使用1μl和3μl的反应混合物检查PCR产物。为检查HU-eCD片段1和2，分别使用0.8％分析琼脂糖凝胶和2％分析琼脂糖凝胶。
根据HUeCD片段1的PCR产物的琼脂糖凝胶分析的结果，确认了存在约1.7kbp的靶单一条带的扩增。产量为至少4.5μg。
此外，在HUeCD片段2的PCR产物的琼脂糖凝胶分析中，确认了存在约150bp的靶单一条带的扩增。产量为约8μg。
通过PCR纯化试剂盒的纯化
按照QIA快速PCR纯化试剂盒的操作手册，将PCR产物进行纯化，从而去除引物。纯化的最终步骤中的DNA的洗脱使用50μl的0.1×TE。
PCR产物通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与上文提及的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”中相同的方法将纯化的PCR产物分级。HU-eCD片段1使用用于纯化的0.8％琼脂糖凝胶进行电泳65分钟，并且切下约1.7kbp的靶条带。HU-eCD片段2使用用于纯化的2％琼脂糖凝胶进行电泳65分钟，并且切下约150bp的靶条带。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与上文“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
纯化的PCR产物的定量分析
将部分的纯化的PCR产物使用0.1×TE稀释3倍，并且通过分光光度计定量分析。HU-eCD片段1的浓度和HU-eCD片段2的浓度都为47ng/μl，并且产量为约2.3μg。
第二PCR
用于PCR扩增的条件的检查
将纯化的HU-eCD片段1和纯化的HU-eCD片段2用作模板，并且检查了用于连接它们的PCR条件。
模板的制备
将517ng纯化的HU-eCD片段1(约1.7kbp)和47ng纯化的HU-eCD片段2(约150bp)混合，并且使用0.1×TE将浓度调整为1ng/μl。两种片段的摩尔比为1∶1。
引物混合物的制备
将10μl的20μM HUeCD F3引物和10μl的20μM HUeCD R1引物等量混合。
PCR混合物的制备
将1μl的1ng/μl HU-eCD片段1和2混合物、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和32.5μl的0.1×TE添加到灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)，并且在冰上进行混合，从而得到PCR反应混合物。以相同方式制备装有该反应混合物的3个管。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，将98℃持续10秒和72℃持续100秒的循环进行5个循环，然后在72℃下添加2μl的上文制备的引物混合物并且与其混合，并且在热循环仪中进行下文的反应。反应完成后，将三个PCR管中的反应混合物合并到一管中。
[Math.6]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，将1μl和3μl的反应混合物使用0.8％分析琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲液(0.5μg/mL溴化乙锭)进行电泳。
第二PCR片段的琼脂糖凝胶分析确认了存在约1.8kbp的靶单一条带的扩增。产量为约13μg。
通过PCR纯化试剂盒的纯化
按照QIA快速PCR纯化试剂盒的操作手册，将PCR产物进行纯化，从而去除引物。纯化的最终步骤中的DNA的洗脱使用50μl的0.1×TE。
将部分的去除了引物的PCR产物用0.1×TE稀释50倍，并通过分光光度计定量分析。
用限制性酶处理PCR产物
使用限制性酶Bcu I和Bam HI切割纯化的PCR产物。
将25μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和100单位的Bcu I添加到5μg的纯化的PCR产物，并且使用0.1×TE将总量补足为250μl。37℃下孵育2小时后，取出其中100ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认DNA未经历内部分解。
在等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。通过电泳进行确认后，从酶反应混合物中去除蛋白。
将20μl的10×Bam HI缓冲液(酶附带的缓冲液)和80单位的Bam HI添加到其中，并使用0.1×TE将总量补足到200μl。37℃下孵育2小时后，取出其中100ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认DNA未经历内部分解。
在等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。通过电泳进行确认后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒来纯化该酶反应混合物。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与上文提及的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”中相同的方法将由限制性酶切割的PCR产物分级，并且切下约1.8kbp的靶条带。作为凝胶，使用了用于纯化的0.8％琼脂糖凝胶，并且开始电泳后75分钟，当约1.8kbp的靶条带达到约1/3凝胶长度的位置时，停止电泳。作为DNA分子量标记，使用了FastRuler DNA梯，中等范围(Fermentas)。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与上文“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
将部分的进行了琼脂糖凝胶纯化的PCR产物使用0.1×TE稀释3倍，并通过分光光度计定量分析。使用0.8％分析琼脂糖凝胶通过电泳进行确认。在PCR产物进行限制性酶处理和琼脂糖凝胶纯化后，通过吸收比色计测量DNA浓度，并且结果为41ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为1.932。此外，在使用琼脂糖凝胶的电泳分析中，存在约1.8kbp的单一条带。
(3)线性pSPCM-pUC ori和HU-eCD片段的连接
按照以下制备连接反应混合物(反应混合物1)和对照反应混合物(反应混合物2和反应混合物3)。
反应混合物1
将4μl的5×快速连接缓冲液、2.4μl(50ng)的pSPCM-pUC ori(21ng/μl)、3.7μl(150ng)的HU-eCD片段(41ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和8.9μl的0.1×TE添加到0.2mL PCR管(Bio-BIK)，这样线性pSPCM-pUC ori(约1.8kbp)和HU-eCD片段(约1.8kbp)的摩尔比为1∶3(重量比也是1∶3)，并在冰上进行混合，从而得到连接反应混合物(反应混合物1)。
反应混合物2
类似地，将4μl的5×快速连接缓冲液、2.4μl(50ng)的pSPCM-pUC ori(21ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和12.6μl的0.1×TE添加到0.2mL PCR管(Bio-BIK)，并在冰上进行混合，从而得到仅具有pSPCM-pUC ori的反应混合物(反应混合物2)。
反应混合物3
类似地，将4μl的5×快速连接缓冲液、3.7μl(150ng)的HU-eCD片段(41ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和11.3μl的0.1×TE添加到0.2mL PCR管(Bio-BIK)，并在冰上进行混合，从而得到仅具有HU-eCD片段的反应混合物(反应混合物3)。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到22℃后，将管置于其上，并且进行连接。
[Math.7]
22℃ 5分钟 (连接反应)
65℃ 5分钟 (反应停止)
4℃ ∞
使用反应混合物2和反应混合物3来估计由于切割后剩余的质粒的背景的比例。
(4)大肠杆菌的转化
通过与实施例1中所述的“大肠杆菌的转化”相同的方法，使用1μl的连接反应后的溶液，进行大肠杆菌JM109的转化。
在使用载体和插入物的连接产物(连接反应混合物1)的转化中，每100μl的10倍稀释细菌液体在选择培养基上形成了34至38个菌落，然而在使用对照反应混合物2(其中仅载体被连接)和对照反应混合物3(其中仅插入物被连接)的转化中，存在0至1个菌落。背景非常低，这表明良好地进行了连接和转化。
(5)质粒的检查
重组大肠杆菌的培养
按照实施例1中所述的“重组大肠杆菌的培养”部分中所述的方法进行。培养进行20.5小时。
质粒DNA的提取
按照实施例1中所述的“质粒DNA的提取”部分中所述的方法进行。
质粒DNA浓度的测量
按照实施例1中所述的“质粒DNA浓度的测量”部分中所述的方法进行。
当测量从所有6个克隆菌株的重组大肠杆菌提取的DNA的浓度时，表明DNA纯度的A260/280比值为1.904至1.916，并且质粒DNA的纯度良好。产量为至少5μg。
限制性酶切割
使用100ng的质粒DNA进行Bcu I独自的切割、Bam HI独自的切割以及Bcu I和Bam HI两者的切割。反应条件按照酶的产品说明书。反应体积为20μl。
琼脂糖凝胶电泳
使用0.8％分析琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳。
对于所有6个克隆菌株，从用两种类型的酶Bcu I和Bam HI的切割中检测到约1.8kbp的一个条带。此外，从用酶Bcu I独自或Bam HI独自的切割中检测到约3.6kbp的一个条带。这表明对于所有克隆菌株，质粒大小和组成正如所设计的。
检查质粒DNA序列
通过与实施例1中所述的“检查质粒DNA序列”部分中相同的方法，使用上文提取的质粒进行测序。作为引物，使用实施例1中所述的表3中的引物对1、2和3。将比对后的质粒核苷酸序列与设计的序列(SEQ ID NO：2)进行比较。
所有6个克隆菌株的质粒序列与SEQ ID NO：2匹配，并且确认了在所有情况下获得了靶菌株。从所有的克隆菌株中选择一个菌株，并且将从该菌株提取的质粒定义为“pHU-eCDm-SPCM-pUC ori”。
<实施例3>
穿梭质粒(pCD穿梭)的构建(步骤3)
(1)线性质粒pHU-eCDm-SPCM-pUC ori的制备
质粒的切割
使用限制性酶Bcu I、Hind III和Sal I按照以下来切割pHU-eCDm-SPCM-pUC ori。进行Hind III切割是为了抑制后续步骤中转化时的背景。
将10μl的10×O缓冲液(酶附带的缓冲液)和34单位的Sal I添加到5μg的pHU-eCDm-SPCM-pUC ori，并且使用0.1×TE将总量补足为100μl。37℃下孵育6小时后，从其中取出50ng，并且使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认了分解已完成。
在等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。确认Sal I的切割后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒来纯化该酶反应混合物。
将20μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和50单位的Bcu I添加到其中，并且使用0.1×TE将总量补足为200μl。37℃下孵育2小时后，去除蛋白。
将10μl的10×R缓冲液(酶附带的缓冲液)和29单位的Hind III添加到其中，并且使用0.1×TE将总量补足为100μl。37℃下孵育2小时后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒将DNA溶液纯化并浓缩。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与实施例1中所述的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”相同的方法，将由限制性酶切割的载体分级，并切下约3.6kbp的靶条带。使用0.8％琼脂糖凝胶用于纯化，以50V进行电泳90分钟。作为分子量标记，使用快速上样1kbp DNA梯(Quick-Load 1kbp DNA ladder)(NEB)。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与实施例1中所述的“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
将部分的进行了琼脂糖凝胶纯化的载体使用0.1×TE稀释3倍，并通过分光光度计定量分析。
当测量用限制性酶处理质粒pHU-eCDm-SPCM-pUC ori并通过琼脂糖凝胶纯化之后的DNA片段的吸光度时，浓度为13ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为1.961。
(2)OriV-RepB基因(插入物)的制备
在作为PCR模板的pBLES100中，RepB基因的ORF的C-末端区和假定的membB基因的ORF的N-末端区是重复的。为了防止membB的ORF被转录，将membB的假定的核糖体结合位点和翻译起始密码子ATG被改变为其他核苷酸。在这种情况下，这样的设计使得RepB的氨基酸没有改变。按照以下进行两个阶段的PCR(第一PCR和第二PCR)，从而得到OriV-RepB基因。
第一PCR
用于PCR扩增的条件的检查
检查两种类型的片段(OriV-RepB基因1和OriV-RepB基因2)的PCR扩增条件。
OriV-RepB基因1
使用pBLES100作为模板，通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/mL pBLES100、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM OriV-rep外部F1引物、0.5μl的20μM OriV-rep内部R1引物、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和29.5μl的0.1×TE来在冰上制备PCR混合物。以相同方式制备3管该混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.8]
72℃ 60秒
4℃ ∞
OriV-RepB基因2
以相同方式，使用pBLES100作为模板，通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl的10pg/mL pBLES100、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM OriV-rep内部F1引物、0.5μl的20μM OriV-rep外部R1引物、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和29.5μl的0.1×TE来在冰上制备PCR混合物。以相同方式制备3管该混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上，并且进行PCR。
[Math.9]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，使用1μl的每种反应混合物检查PCR产物并估计其产量。作为凝胶，使用2％分析琼脂糖凝胶。
根据OriV-RepB基因1的PCR产物的琼脂糖凝胶分析的结果，确认了存在约1.3kbp的靶单一条带的扩增。产量为约4.5μg。
此外，在OriV-RepB基因2的PCR产物的琼脂糖凝胶分析中，确认了存在约400bp的靶单一条带的扩增，并且产量为约4.5μg。
通过PCR纯化试剂盒的纯化
按照标准方法(QIA快速PCR纯化试剂盒的操作过程)纯化并浓缩PCR产物。
PCR产物通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与实施例1中所述的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”相同的方法，将上文纯化并浓缩的PCR产物分级。对于OriV-RepB基因1，使用用于纯化的0.8％琼脂糖凝胶进行电泳80分钟。当约1.3kbp的靶条带达到约1/2凝胶长度的位置，停止电泳。作为分子量标记，使用FastRuler DNA梯，中等范围。另一方面，对于OriV-RepB基因2，使用用于纯化的2％琼脂糖凝胶进行电泳80分钟。当约400bp的靶条带达到约1/2凝胶长度的位置，停止电泳。作为分子量标记，使用FastRulerDNA梯，低范围。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与实施例1中所述的“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切除的凝胶洗脱DNA。
纯化的PCR产物的定量分析
将部分的纯化的PCR产物用0.1×TE稀释4倍，并使用分光光度计定量分析。
当琼脂糖凝胶纯化后的PCR产物使用吸收比色计进行测量时，OriV-RepB基因1和OriV-RepB基因2的浓度分别为37ng/μl和67ng/μl。
第二PCR
用于PCR扩增的条件的检查
将纯化的OriV-RepB片段1和纯化的OriV-RepB片段2用作模板，并且检查用于连接它们的PCR条件。
模板的制备
将325ng纯化的OriV-RepB片段1(约1.3kbp)和100ng纯化的OriV-RepB片段2(约400bp)混合，并且使用0.1×TE将浓度调整为1ng/μl。纯化的OriV-RepB片段1和纯化的OriV-RepB片段2的摩尔混合比例为1∶1。
引物混合物的制备
将20μM OriV-rep外部F1引物和20μM OriV-rep外部R1引物以等量混合。
PCR混合物的制备
通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加1μl的1ng/μl OriV-RepB 1和2混合物，10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和32.5μl的0.1×TE来制备反应混合物，并在冰上混合。以相同方式制备3管该混合物。
热循环仪按照下文条件设定，并在块温度达到98℃后，将管置于其上。
98℃持续10秒和72℃持续70秒的循环进行5个循环，然后添加2μl上文制备的引物混合物并在72℃下与其混合，并且在热循环仪中进行下文的反应。
[Math.10]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，将0.5μl和1μl反应混合物使用0.8％分析琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲液(0.5μg/mL溴化乙锭)进行电泳。
在第二PCR片段的琼脂糖凝胶分析中，确认了存在约1.6kbp的靶单一条带的扩增。产量为至少6μg。
通过PCR纯化试剂盒的纯化
按照QIA快速PCR纯化试剂盒的过程手册，将PCR产物纯化，从而去除引物。纯化的最终步骤中DNA的洗脱使用50μl的0.1×TE。
将部分的去除了引物的PCR产物用0.1×TE稀释20倍，并通过分光光度计定量分析。
用限制性酶处理PCR产物
使用限制性酶Bcu I和Sal I切割纯化的PCR产物。
将10μl的10×O缓冲液(酶附带的缓冲液)和25单位的Sal I添加到5μg纯化的PCR产物，并且使用0.1×TE将总量补足为100μl。37℃下孵育6小时后，取出其中50ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认了DNA未经历内部分解。
等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。确认后，通过进行电泳，使用QIA快速PCR纯化试剂盒纯化DNA。
将20μl的10×Tango缓冲液(酶附带的缓冲液)和110单位的Bcu I添加到其中，并且使用0.1×TE将总量补足为200μl。37℃下孵育2小时后，去除蛋白。
PCR产物通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与实施例1中所述的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”相同的方法，将由限制性酶切割的PCR产物分级，并切下约1.6kbp的靶条带。作为凝胶，使用用于纯化的0.8％琼脂糖凝胶，开始电泳后90分钟，当约1.6kbp的靶条带达到约1/3凝胶长度的位置，停止电泳。作为分子量标记，使用快速上样1kb DNA梯(NEB)。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与实施例1中所述的“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
将部分的纯化的PCR产物使用0.1×TE稀释3倍，并使用分光光度计定量分析。
当限制性酶处理和琼脂糖凝胶纯化后的PCR产物使用吸收比色计进行测量时，DNA的浓度为16ng/μl。此外，表明纯度的A260/280比值为2.041。
(3)线性pHU-eCDm-SPCM-pUC ori和OriV-RepB基因的连接
按照以下制备连接反应混合物(反应混合物1)和对照反应混合物(反应混合物2和反应混合物3)。
反应混合物1
在冰上向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)添加4μl的5×快速连接缓冲液、3.8μl(50ng)的pHU-eCDm-SPCM-pUC ori(13ng/μl)、3.9μl(65ng)的OriV-RepB片段(16.5ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和7.3μl的0.1×TE并混合，这样线性pHU-eCDm-SPCM-pUC ori(约3.6kbp)与OriV-RepB基因(约1.6kbp)的摩尔比为1∶3(重量比为1∶1.3)，从而得到连接反应混合物(反应混合物1)。
反应混合物2
以相同方式，在冰上向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)添加4μl的5×快速连接缓冲液、3.8μl(50ng)的pHU-eCDm-SPCM-pUC ori(13ng/μl)、1μl的5u/μlT4 DNA连接酶和11.2μl的0.1×TE并混合，从而得到仅具有pHU-eCDm-SPCM-pUC ori的反应混合物(反应混合物2)。
反应混合物3
以相同方式，在冰上向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)添加4μl的5×快速连接缓冲液、3.9μl(65ng)的OriV-RepB片段(16.5ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和11.1μl的0.1×TE并混合，从而得到仅具有OriV-RepB基因的反应混合物(反应混合物3)。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到22℃后，将管置于其上，并且进行连接。
[Math.11]
22℃ 5分钟 (连接反应)
65℃ 5分钟 (反应停止)
4℃ ∞
从反应混合物2估计由于未切割的质粒的背景的比例，并且从反应混合物3估计由于用作模板的质粒DNA存在的背景的比例。
(4)大肠杆菌的转化
通过与实施例1中所述的“大肠杆菌的转化”相同的方法，使用1μl的连接反应后的溶液，进行大肠杆菌JM109的转化。
在使用载体和插入物的连接产物(连接反应混合物1)的转化中，每100μl的转化后原始细菌悬液在选择培养基上形成了238和216个菌落，然而对于对照反应混合物2(其中仅载体被连接)，没有检测到菌落，并且在使用对照反应混合物3(其中仅插入物被连接)的转化中，存在8和6个菌落。背景非常低，这表明良好地进行了连接和转化。
(5)质粒的检查
重组大肠杆菌的培养
按照实施例1中所述的“重组大肠杆菌的培养”部分中所述的方法进行。进行培养22.5小时。
质粒DNA的提取
按照实施例1中所述的“质粒DNA的提取”部分中所述的方法进行。
质粒DNA浓度的测量
按照实施例1中所述的“质粒DNA浓度的测量”部分中所述的方法进行。
表明DNA纯度的A260/280比值为从1.951至1.958，并且质粒DNA的纯度良好。产量为至少10μg。
限制性酶切割
使用100ng的质粒DNA进行Bcu I独自的切割、Sal I独自的切割以及Bcu I和Sal I两者的切割。反应条件按照酶的产品说明书。反应体积为20μl。
琼脂糖凝胶电泳
按照实施例1中所述的“琼脂糖凝胶电泳”部分中所述的方法进行。使用0.8％分析琼脂糖凝胶。
对于所有6个候选菌株，用两种类型的酶Bcu I和Sal I的切割，检测到约3.6kbp和1.6kbp的两个条带。此外，从用酶Bcu I独自或Sal I独自的切割中检测到约5.2kbp的一个条带。这表明对于所有候选菌株，质粒大小和组成正如所设计的。
检查质粒DNA序列
通过与实施例1中所述的“检查质粒DNA序列”部分中相同的方法，使用上文提取的质粒进行测序。作为引物，使用实施例1中所述的表3中的引物对1、2、3和4。将比对后的质粒核苷酸序列与设计的序列(SEQ ID NO：3)进行比较。
6个克隆菌株中的4个菌株的质粒序列与SEQ ID NO：3匹配，并且确认获得了靶菌株。对于剩余的两个菌株，在pTB6 rep单元中存在单核苷酸缺失。从4个与SEQ ID NO：3匹配的菌株中选择一个菌株，并且将从该菌株提取的质粒定义为“pCD穿梭”。
(6)双歧杆菌的转化
感受态细胞的制备
将长双歧杆菌Re-105A甘油储备在室温解冻并充分摇动。将10mL的IMR条件培养基装入灭菌的玻璃试管，并且将100μl的解冻的细菌液体添加到其中并充分混合。将其与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将其在37℃下保持24小时来进行培养(第一培养液)。
在充分摇动第一培养液后，将其中100μl进行测量并用于接种装有10mL的IMR条件培养基的试管，将其与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且将其在37℃下保持18小时进行培养(第二培养液)。
将30mL的IMR条件培养基分配到4个50mL容积灭菌塑料管(BD FalconTM管，Becton，Dickinson and Company，Japan)中的每一个。将这些管在37℃的培养箱中预热，并且将1.5mL的第二培养液添加到每个管并充分摇动。轻轻闭合瓶盖，将管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并在37℃下进行培养。当1小时35分钟过去后混浊度(波长600nm)变为0.213时，停止培养，并且将含有培养液的管转移到冰上。在4℃下，将它们以8000rpm离心5分钟。在清洁的工作台上弃去上清，将5mL冰中预冷的PBS缓冲液添加到每个含有细菌细胞的管，并且温和地将细菌细胞悬浮。将4个含有细菌悬液的管合并到一管，并且在4℃下将其以8000rpm离心5分钟。在清洁的工作台上弃去上清，并且将360μl冰中预冷的KMR缓冲液添加到细菌细胞，以将细胞重悬浮。细菌悬液约为720μl。将其保持在冰上过夜，从而得到感受态细胞。通过将细菌悬液的部分用等量的KMR缓冲液稀释2倍来制备细菌悬液，并将其定义为二倍稀释的感受态细胞。
转化
将80μl感受态细胞置于事先冰冷的1.5mL容积灭菌微型管中。将578ng(1μl)的pCD穿梭添加到其中，用移液管温和地混合，然后将其保持在冰上5分钟。作为阳性对照，将498ng(2μl)已被证实在双歧杆菌长双歧杆菌Re-105A中复制的pAV001-HU-eCD-M968与感受态细胞通过与上文相同的操作进行混合。以相同方式，将二倍稀释的感受态细胞和578ng(1μl)的pCD穿梭进行混合。将以上混合物中的每一个转移到事先冰冷的小杯中(BM小杯，BM Equipment Co.，Ltd.)。在该过程中，将没有添加DNA的感受态细胞也添加到另一个小杯中(阴性对照)。
使用电穿孔系统(Gene Pulser II，Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行转化(电穿孔)。将电穿孔仪设定为2.0kV的电压、25微F的电容器和200Ω的电阻器，并按照系统说明书手册操作。
电击后，将800μl的IMR液体培养基和50μl包含维生素C的液体的混合物立刻添加到小杯，并使其在灭菌2mL微型管中恢复。每个管进行相同的操作，并且将这些2mL管开盖并置于干燥器中。使用真空泵去除干燥器中的空气，并将干燥器充入二氧化碳。重复该操作3次，以便用二氧化碳代替干燥器中的空气，并然后将干燥器置于设定为37℃的培养箱中并孵育3小时。
孵育后，充分摇动每个细菌悬液，将其中100μl进行测量，并在2块IMR琼脂培养基(含有75μg/mL SPCM)上涂板。将这些平板与去氧/二氧化碳生成剂(AnaeroPack(R)-Anaero，Mitsubishi Gas Chemical Company)共同置于密封容器内，并在设定为37℃的培养箱中进行培养3天。
菌落的培养
随机选择6个由pCD穿梭转化的菌落，并用于接种装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。作为对照，在室温解冻APS001C主细胞库甘油储备(2007年3月22日制造，系列号：004-0127)，并且将其中100μl用于接种装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。将这些接种的试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将它们在37℃下保持24小时来进行培养(第一培养液)。
在充分摇动第一培养液后，将其中100μl进行测量并用于接种装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。将它们与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将它们在37℃下保持24小时来进行培养(第二培养液)。
质粒的提取
除了APS001C以外，使用2mL的第一培养液，通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒，进行质粒提取和纯化。细节按照试剂盒的产品说明书。
质粒的检查(PCR)
使用这样提取的质粒DNA作为模板，进行PCR，并检查质粒的有/无。通过向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)中添加5μl质粒DNA、10μl的5×PrimeStarTM缓冲液、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、0.5μl的20μM检查F1引物、0.5μl的20μM检查R2引物、0.5μl的PrimeSTARHS DNA聚合酶和29.5μl的0.1×TE来在冰上制备PCR混合物。
以相同方式，使用通过将从大肠杆菌提取的质粒pCD穿梭的浓度调整至10pg/mL而制备的溶液作为模板，制备作为阳性对照的PCR混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到98℃后，将管置于其上。
[Math.12]
72℃ 60秒
4℃ ∞
PCR完成后，使用1μl的反应混合物进行PCR产物的检查。作为凝胶，使用0.8％分析琼脂糖凝胶。
<实施例4>
质粒“pBifiCD”的构建(步骤4)
(1)无pUC ori片段的制备
通过限制性酶的质粒的切割
按照以下由限制性酶Bgl II和Bam HI切割pCD穿梭。
将20μl的10×Bam HI缓冲液(酶附带的缓冲液)和69单位的Bam HI添加到10μg的pCD穿梭，使用0.1×TE将总量补足为200μl，并充分混合。37℃下孵育3小时10分钟后，取出其中50ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认了分解已完成。
等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。确认Bam HI的切割后，从酶反应溶液中去除蛋白。
将10μl的10×O缓冲液(酶附带的缓冲液)和45单位的Bgl II添加到其中，使用0.1×TE将总量补足为100μl，并充分混合。37℃下孵育2小时后，取出其中100ng，并使用0.8％分析琼脂糖凝胶确认分解已完成。
等待确认时，将含有酶反应混合物的管在冰上保存。
将0.1×TE添加到100ng由限制性酶切割的质粒DNA溶液，以使总量成为10μl，将1μl的10×上样缓冲液添加其中，并充分混合。将此用作电泳样品。作为凝胶，使用0.8％分析琼脂糖凝胶。
通过琼脂糖凝胶分级和切除
通过与实施例1中所述的“通过琼脂糖凝胶分级和切除”相同的方法，将由限制性酶切割的载体进行电泳120分钟，并当确认了约4.5kbp的靶条带已充分地脱离约650bp的不需要的条带时，切下约4.5kbp的DNA条带。作为分子量标记，使用快速上样1kbp DNA梯。
从琼脂糖凝胶洗脱DNA
通过与实施例1中所述的“从琼脂糖凝胶洗脱DNA”中相同的方法，从上文切下的凝胶洗脱DNA。
将部分的通过琼脂糖凝胶纯化的载体使用0.1×TE稀释15倍，并使用分光光度计定量分析。
当将由限制性酶切割并通过琼脂糖凝胶纯化的pCD穿梭使用吸收比色计进行测量时，DNA的浓度为47ng/μl，并且表明纯度的A260/280比值为1.937。
(2)纯化的无pUC ori片段的自我连接
连接反应
将纯化的无pUC ori片段(约4.5kbp)进行自我连接。向灭菌的0.2mL PCR管(Bio-BIK)添加4μl的5×快速连接缓冲液、1μl(47ng)的无pUC ori片段(47ng/μl)、1μl的5u/μl T4 DNA连接酶和14μl的0.1×TE，并在冰上混合，从而得到连接反应混合物。制备20管该反应混合物。
热循环仪按照下文条件设定，在块温度达到22℃后，将管置于其上。
[Math.13]
22℃ 5分钟 (连接反应)
65℃ 5分钟 (反应停止)
4℃ ∞
纯化(蛋白去除和浓缩)
将20管连接反应混合物合并到1个灭菌的微型管中，然后去除蛋白。使用10μl的0.1×TE进行DNA的溶解。
(3)双歧杆菌的转化
转化
使用500ng(5μl)纯化的连接反应产物，进行长双歧杆菌Re-105A感受态细胞的转化(电穿孔)。作为背景对照，将500ng(10μl)未进行连接反应的无pUCori片段与感受态细胞以相同方式在单独的管中混合。通过与实施例3中所述的“转化”中相同的方法进行电穿孔操作。
菌落的培养
随机选择8个由纯化的连接反应产物转化的菌落，通过与实施例3中所述的“菌落的培养”中相同的方法进行培养。
质粒的提取
使用1.5mL的第一培养液，通过与实施例1中所述的“质粒DNA的提取”中相同的方法进行质粒提取和纯化。
质粒的检查(PCR)
使用上文提取的质粒DNA作为模板，通过与实施例3中所述的“质粒的检查”中相同的方法进行PCR。
PCR完成后，使用1μl的反应混合物来检查PCR产物。作为凝胶，使用两种类型，即0.8％和2％分析琼脂糖凝胶。
(4)质粒序列的验证
培养
将长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株甘油储备解冻并充分摇动，并且将其中100μl用于接种装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。将该试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将其在37℃下保持24小时来进行培养(第一培养液)。在充分摇动第一培养液后，将其中100μl进行测量并用于接种2个装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管的每一个。将这些试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将它们在37℃下保持24小时来进行培养(第二培养液)。
质粒的提取
按照以下使用适量的第二培养液，通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒，进行质粒提取和纯化。
将4个15mL容积灭菌的塑料管(BD FalconTM，Becton，Dickinson and Company，Japan)每个都装入2.5mL第二培养液，并且将7.5mL的30mM GTA缓冲液添加到每个管。将其摇动并然后在25℃下以12000rpm离心15分钟，并通过移液管弃去上清。将10mL的30mM GTA缓冲液添加到管中的细菌细胞后，将它们在25℃下以12000rpm离心15分钟，并通过移液管弃去上清。将2个含有细菌细胞的管合并到1个管后，将1mL的N-乙酰胞壁酸酶溶液(通过将30mM GTA缓冲液添加到由Seikagaku公司生产的冻干的N-乙酰胞壁酸酶产品而制备为3000单位/mL)添加到每个管并充分混合。将这些管在设定为50℃的水浴中孵育3小时后，将250μl的20mg/mL蛋白酶K(QIAGEN)添加到其中，充分混合，并在设定为60℃的水浴中孵育30分钟。将2个管合并到1个管中。
将等量的P1缓冲液(试剂盒附带)添加到其中并混合(A)。将该混合物分到4个15mL容积塑料管，将与A等量的溶解溶液(0.2M NaOH/2％ SDS)添加到其中并颠倒混合，然后将1.4倍于A的体积的N3缓冲液(试剂盒附带)添加到其中并颠倒混合，并且将细菌细胞进行溶菌与中和。在25℃下以12000rpm离心15分钟后，将上清收集到15mL容积塑料管中。使用QIA快速Spin Column(QIAquick Spin Column)(试剂盒附带)的8个柱来纯化这样收集的液体。纯化方法按照试剂盒的操作手册。使用50μl的0.1×TE进行最终步骤中的DNA洗脱，从而得到约400μl的质粒溶液。
检查质粒DNA序列
通过与实施例1中所述的“检查质粒DNA序列”部分中相同的方法，使用上文提取的质粒进行测序。作为引物，使用实施例1中所述的表3中的引物对1、3和4。将比对后的质粒核苷酸序列与设计的序列(SEQ ID NO：4)进行比较。
测定从克隆菌株中提取的质粒的全序列的结果为，长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD质粒序列与SEQ ID NO：4匹配。将从该克隆菌株中提取的质粒定义为“pBifiCD”。
<测试实施例1>
检查双歧杆菌的转化及基本性质
(1)检查长双歧杆菌Re-105A的转化
检查通过从pCD穿梭移除pUC ori位点并闭环形成的自我连接产物和使用pCD穿梭的长双歧杆菌Re-105A的转化结果。
将相同的感受态细胞用于1至5号平板。对于未添加质粒的阴性对照(1号平板)，菌落数为1和0。
但是，即使对于使用已被证实在双歧杆菌中复制的穿梭质粒pAV001-HU-eCD-M968(专利公布5；WO 2007-136107)转化的阳性对照(5号平板)，菌落数为5和2，并且与阴性对照的数量上的差异小。这表明1至5号平板中使用的感受态细胞的转化效率低。
另一方面，对于6号平板，将使用的感受态细胞的浓度稀释2倍，并且当使用pCD穿梭进行转化时，每个平板形成至少500个菌落。没有进行6号平板的阴性对照，但是推测6号平板上的菌落很可能已被质粒pCD穿梭所转化。此外，发现感受态细胞的浓度对转化效率贡献很大。此外，比较了进行片段连接的情况和未进行片段连接的情况，所述片段中pUC ori已从pCD穿梭中移除，作为由此转化的结果(分别为3号和4号平板)，3号平板菌落数为3和8，4号平板菌落数为1和2，并且在两种情况中菌落数都少。
结果在表4中给出。
[表4]
表4 长双歧杆菌Re-105A的转化
(2)检查转化的长双歧杆菌Re-105A的质粒
当使用从8个长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株和6个长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株提取的质粒作为模板，利用检查引物进行PCR时，对于长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株，检测到约500bp的扩增产物。对于长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株，检测到1.1kbp的扩增产物。因而确认了所有的克隆菌株具有质粒。还显示出pBifiCD不含有pUC ori片段。
<测试实施例2>
检查胞嘧啶脱氨酶活性
使用8个长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株和6个长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株来检查胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。
将1mL的每个APS-2S-2.5R条件培养基中的第二培养液用Tris缓冲液(pH 8.4)洗涤3次，然后超声破碎，从而提取总蛋白。通过改良的Lowry方法来定量测量总蛋白的量，并且使用5μg的总蛋白进行使用5-氟胞嘧啶(5-FC)作为底物的酶反应。通过液相色谱法来定量测量通过酶反应形成的5-氟尿嘧啶(5-FU)和剩余的5-FC的量，并计算CD酶活性。
根据测量长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株和长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株的CD活性的结果，8个长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的CD活性为8.07-10.29(平均：8.74)单位/μg总蛋白，并且细菌菌株之间几乎没有任何差异。
此外，6个长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株的CD活性为8.13-9.66(平均：8.69)单位/μg总蛋白，并且类似地细菌菌株之间几乎没有任何差异。
两种克隆菌株的CD活性几乎相同，但是对于平均值，长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的CD活性稍高；CD活性没有由于pUC ori片段被移除而减少，反而表明其作用良好。
通过该测试证实pCD穿梭和pBifiCD在双歧杆菌中复制并具有充分的CD活性。表5中显示测量结果。
[表5]
表5 使用总蛋白的CD活性
<测试实施例3>
检查质粒保留稳定性
当将通过在含有壮观霉素的培养基中培养而充分活化的培养液在不添加壮观霉素的培养基中进行培养时，按照以下检查质粒保留稳定性。
在添加SPCM的培养基中的选择培养
将2个长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的甘油储备和1个长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株的甘油储备解冻并充分摇动后，将其中100μl进行测量并用于接种装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。通过相同操作进行APS001C MCB(系列号：004-0116)的接种。将这些试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将它们在37℃下保持24小时来进行培养(第一培养液)。在充分摇动第一培养液后，将其中100μl进行测量并用于接种2个装有10mL的APS-2S-2.5R条件培养基的试管。将这些试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并且通过将它们在37℃下保持24小时进行培养(第二培养液)。
在不添加SPCM的培养基中的非选择培养
将装有非选择APS-2S-2.5R条件培养基的10mL试管在设定为37℃的水浴中事先加热，并且在清洁的工作台中，用添加SPCM的培养基中的10μl每个第二培养液接种该培养基(0.1％细菌接种)。接种后，将每个试管与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并置于设定为37℃的培养箱中。快速进行系列的这些操作，以减少培养基的温度变化。将这些试管培养24小时后，使用每个培养液作为接种物，通过相同方法重复传代至非选择APS-2S-2.5R条件培养基上。
在将非选择APS-2S-2.5R条件培养基中的第三代培养液通过充分振荡而摇动后，将其中100μl进行测量并添加到9.9mL厌氧稀释剂(102倍稀释液体)并充分混合。通过相同方法稀释102倍稀释液体以得到104倍稀释液体，然后得到106倍稀释液体。将100μl的106倍稀释液体置于5块BL琼脂培养基的每一个上。将这些平板与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并在设定为37℃的培养箱中厌氧培养2天。
BL-bS琼脂培养基复制
从BL琼脂培养基随机选择300个充分分离的菌落并进行使用。使用灭菌牙签钓起菌落并且按顺序用于接种BL-bS琼脂培养基和BL琼脂培养基。在总共6块琼脂培养基上以每块50个进行接种。根据容器的容积，将接种后的琼脂培养基与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，以保持缺氧状态，并在37℃下培养1天。
培养结束后，通过标记没有明显细菌增殖的牙签的穿刺痕迹，并计数除了这些可以见到细菌增殖的穿刺痕迹来进行计数。因为保留质粒的细菌是SPCM抗性的，所以保留质粒的细菌的百分比以SPCM抗性细菌的百分比给出。根据下文的公式确定保留质粒的细菌的百分比。
[Math.14]
公式1
根据测量质粒保留稳定性的结果，长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株#1和#5中壮观霉素抗性细菌的百分比，即保留质粒的细菌的百分比，对于两个菌株都是非常高的值，为87.7％。
此外，长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭中保留质粒的细菌的百分比为80.3％。
另一方面，由穿梭质粒pAV001-HU-eCD-M968(APS001C：专利公布6；WO 2007-136107)转化的长双歧杆菌Re-105A/pAV001-HU-eCD-M968中保留质粒的细菌的百分比为71.7％，这显著低于本发明的长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD中保留质粒的细菌的百分比。
确认了本发明的质粒pBifiCD在双歧杆菌长双歧杆菌Re-105A中被稳定地保留，并且由本发明的质粒pBifiCD转化的长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD显示出非常高的质粒保留稳定性。
此外，与长双歧杆菌Re-105A/pAV001-HU-eCD-M968相比，两个克隆菌株显示出非常好的保留质粒的细菌的百分比，此外，长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株比长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭克隆菌株给出了更高的保留质粒的细菌的百分比，从而确认移除pUC ori片段改善了保留质粒的细菌的百分比。
表6中显示出测量结果。
[表6]
表6质粒分离的稳定性
<测试实施例4>
检查质粒“pBifiCD”转化大肠杆菌的能力
使用穿梭质粒“pCD穿梭”作为对照，按照以下进行大肠杆菌未被本发明的质粒“pBifiCD”所转化的检查。
(1)质粒的制备
按照以下制备本发明的质粒“pBifiCD”和对照质粒“pCD穿梭”。
培养
用由实施例4中制备的质粒“pBifiCD”所转化的双歧杆菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)，以1％接种APS-2S-2.5R条件培养基，与去氧/二氧化碳生成剂置于密封的容器中，并在37℃下培养24小时。充分摇动后，用其中1％接种APS-2S-2.5R条件培养基，并且以相同方式培养24小时。
类似地，用由实施例3中制备的穿梭质粒“pCD穿梭”所转化的双歧杆菌(长双歧杆菌Re-105A/pCD穿梭)，以1％接种APS-2S-2.5R条件培养基，与去氧/二氧化碳生成剂置于密封的容器中，并在37℃下培养24小时。充分摇动后，用其中1％接种APS-2S-2.5R条件培养基，并且以相同方式培养24小时。
质粒的提取
将2mL每种上文的培养液用30mM GTA缓冲液(pH5.5)洗涤两次，并且进行N-乙酰胞壁酸酶处理，然后进行蛋白酶K处理。通过QIAprep Spin MiniPrep试剂盒进行纯化从而提取质粒DNA，并且每种情况中获得约9μg的质粒DNA。
(2)大肠杆菌的转化
使用50ng(1μl)每种上文制备的质粒“pCD穿梭”和“pBifiCD”，通过热休克进行大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Bio Inc.)(100μl)的转化。转化方法按照感受态细胞提供的产品说明书。
将100μl的每种热休克并用添加SOC的培养基孵育后的细菌悬液在2块LB琼脂培养基(含有75μg/mL壮观霉素)上涂板，并在37℃下培养过夜。
根据检查每个培养后的平板上菌落存在或不存在的结果，仅在使用对照质粒“pCD穿梭”转化的大肠杆菌中检测到菌落。
另一方面，由阴性对照或本发明的质粒“pBifiCD”转化后，未检测到菌落，所述阴性对照中添加0.1×TE而不是质粒。
确认了即使当本发明的质粒“pBifiCD”被强行引入大肠杆菌中时，其也不会在大肠杆菌中复制。
表7中给出结果。
[表7]
表7用pCD穿梭或pBifiCD转化大肠杆菌JM109
<测试实施例5>
长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的抗肿瘤效果的检查
(1)长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的培养的成活细胞的制备(测试药物)
通过以下进行活化培养，将长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的甘油储备在常温下解冻，用其中的适量接种装有添加了碳酸钙的液体培养基的试管，将其与去氧/二氧化碳生成剂共同置于密封的容器中，并在37℃的培养箱中厌氧培养24小时。随后，用适量的该液体培养物接种装有未添加碳酸钙的液体培养基的试管，并且在相同厌氧条件下培养18小时(主要培养物)。
将液体培养物转移到50mL容积聚丙烯锥形管(Becton，Dickinson and Company，Japan)，并且将5mL的该混合液体培养物与4倍量(20mL)的冷(5℃)生理盐水充分混合，如此制备3管。通过以下进行洗涤，将每个管在制冷(4℃)的同时以8,000rpm离心10分钟，并且弃去上清后，再向其中添加20mL的冷生理盐水以悬浮细菌(洗涤操作1)。再进行两次该洗涤操作，并且将已总计洗涤3次的细菌液体合并到1管后，将细菌悬液的体积调整到6.5mL。将如此洗涤的细菌悬液使用8微米滤膜(聚碳酸酯，Toyo Roshi Kaisha，Ltd.，K800A025A)进行过滤，并且将如此收集的滤液中的成活细菌(培养的成活细菌液体)用作测试药物。
(2)移植的肿瘤细胞的培养
于37℃、5％CO2的条件下，在添加了1v/v％青霉素(50000U/mL)/链霉素(50mg/mL)和在56℃下固定30分钟的FBS(10v/v％)的DMEM培养基中，培养人乳腺癌细胞系KPL-1细胞。
融合时，用1×PBS(-)洗涤后，添加1×胰蛋白酶-EDTA以使细胞脱离，并且视情况用DMEM培养基将通过离心(1000rpm/5分钟)收集的细胞稀释并传代。
在移植实验中，使用第五代细胞。将未被台盼蓝染色的成活细胞数目通过Thoma血细胞计数器(Thoma 0.1mm deep ERMA，Tokyo)进行计数，并且通过将它们在汉克溶液(Hanks′solution)中悬浮来将细胞数调整为2.5×106细胞/mL。
(3)荷瘤(tumor-bearing)裸小鼠的制备和肿瘤体积的测量
将0.2mL上文制备的KPL-1细胞悬液移植到裸小鼠的右前肢背侧的皮肤下(5×105细胞/小鼠)。
移植后，使用测径仪，通过测量肿瘤的尺寸(大直径、小直径、厚度)，根据下文的公式来测定肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3)＝大直径(mm)×小直径(mm)×厚度(mm)/2
(4)分组和培养的成活细菌(测试药物)、糖源(乳果糖)和前药(5-FC)的给药
分组和培养的成活细菌的给药(测试药物)
选择16只具有60mm3至95mm3级别的肿瘤体积的KPL-1荷瘤裸小鼠，并平均分为两组(每组8只小鼠)，一组用作对照组(未处理组)，另一组用作处理组。
将每只小鼠0.3mL的培养的成活细菌(测试药物)静脉内给予处理组，每天3次(AM/PM)，持续2天(第1天和第2天)。
给予的培养的成活细菌的总体积为1.8mL，并且给予的细胞总数为5.9×109cfu/小鼠。
按照以下测量给予的成活细菌数。
成活细菌数的测量
将培养的细菌液体用厌氧稀释剂稀释106倍，将其中100μl在3个BLFS平板上涂板，并在密封容器中(AneroPack rectangular jar，Mitsubishi Gas Chemical Co.，Ltd.)，于37℃下，在培养箱中与去氧/二氧化碳生成剂共同厌氧培养3天。根据从检测到的菌落数在30至300的级别的平板，通过下文的公式计算给予的细菌数。
给予的细菌数(cfu)＝菌落数(a)×涂板稀释率(b)×每1mL制剂的转换因子(c)×剂量(mL)
(a)：(P1+P2+P3)/3(3个平板(P1、P2、P3)的平均菌落数)
(b)：×106(106倍稀释)
(c)：×10(每平板各自涂板100μl)
乳果糖的给药
按照以下，再将乳果糖溶液给予处理组作为细菌的糖源。
将1mL以20％(w/v)溶于纯净水并在121℃下高压灭菌20分钟的乳果糖溶液给予到小鼠的腹腔中，每天一次。
给药时间段为21天(第3天至第23天)，从培养的成活细菌的给药完成后的那天开始。
氟胞嘧啶(5-FC)的给药
将0.4mL的5-FC溶液口服给予小鼠，每天3次(约9:00、14:00和18:00)(总给药量1.2mL)。
给药时间段为21天(第3天至第23天)，从APS001F培养的成活细菌的给药完成后的那天开始。
(5)肿瘤生长抑制效果的检查
开始处理(分组时)之前和处理开始后24天，对于所有的小鼠，以3至4天一次的频率测量肿瘤直径，并检查对肿瘤生长的影响。
计算每组的小鼠肿瘤体积的平均值±SD，并且使用相对于对照组的相对肿瘤体积比(T/C(％))作为指标，评定抗肿瘤效果.
对照组和处理组的肿瘤体积(平均值±SD)显示在表8中。
此外，肿瘤体积随天数的变化显示在图5中。
测试结束日(第24天)，处理组的相对肿瘤体积比(T/C(％))为23.0％，并观察到显著的肿瘤生长抑制活性。
[表8]
表8 长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD克隆菌株的抗肿瘤效果
工业应用
本发明的目的是提供这样的表达载体，其仅在转化体细菌中复制，并且不在除了所述转化体细菌的细菌中复制，特别是不在例如大肠杆菌的致病或者需氧或兼性厌氧细菌中复制，以及构建所述表达载体的方法。此外，本发明的目的是提供形成自由所述表达载体转化的厌氧微生物的基因转运体、含有所述基因转运体的药物组合物和含有所述细菌的实体瘤治疗剂。
本发明的载体是非常安全的载体，其不含有在除了所述转化体细菌的细菌中发挥功能，特别是在大肠杆菌中发挥功能的复制起点，并且没有在除了所述转化体细菌的细菌中复制的可能性，特别是不在例如大肠杆菌的致病或者需氧或兼性厌氧细菌中复制。使用本发明的载体转化的基因转运体具有高质粒保留稳定性，并且即使其被横向转移到除了所述转化体细菌的细菌，特别是横向转移到例如大肠杆菌的致病或者需氧或兼性厌氧细菌，不存在在该细菌中复制的可能性，并且其作为非常安全和高质量的基因转运体是有前途的。
仅受理局用
仅国际局用
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.(修改后)用于转化厌氧微生物的质粒载体，其能够在所述厌氧微生物中复制，但不在大肠杆菌中复制，所述质粒载体包含至少一个在所述厌氧微生物中发挥功能但不在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
2.(修改后)如权利要求1所述的质粒载体，还包含蛋白表达单元，所述蛋白表达单元包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段。
3.(修改后)如权利要求2所述的质粒载体，其中所述质粒复制单元是在选自以下的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元：双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌(Clostridium)。
4.(修改后)如权利要求3所述的质粒载体，其中所述质粒复制单元是在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
5.(修改后)如权利要求4所述的质粒载体，其中所述在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元是包含OriV区和RepB基因的pTB6 rep单元。
6.(修改后)如权利要求5所述的质粒载体，其中编码包含OriV区和RepB基因的pTB6 rep单元的基因是由SEQ ID NO：4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其单核苷酸多态性。
7.(修改后)如权利要求2所述的质粒载体，其中所述具有靶活性的蛋白是(a)具有抗肿瘤活性的蛋白，或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
8.(修改后)如权利要求7所述的质粒载体，其中所述具有靶活性的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
9.(修改后)如权利要求8所述的质粒载体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶。
10.(修改后)如权利要求9所述的质粒载体，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶。
11.(修改后)如权利要求10所述的质粒载体，包含SEQ ID NO：4(pBifiCD)的核苷酸序列所示的DNA序列。
12.(修改后)构建用于转化厌氧微生物的质粒载体的方法，所述质粒载体能够在所述厌氧微生物中复制，但不在大肠杆菌中复制，所述质粒载体包含至少一个在所述厌氧微生物中发挥功能但不在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元，所述方法包括
产生包含以下的穿梭质粒：(1)在厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元和在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元，和(2)蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，所述穿梭质粒能够在所述厌氧微生物和大肠杆菌两者中复制，并且
从所述穿梭质粒移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。
13.(修改后)基因转运体，包含用权利要求1至11中任一权利要求所述的质粒载体转化的厌氧微生物。
14.如权利要求13所述的基因转运体，其中所述厌氧微生物选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌(Clostridium)。
15.如权利要求14所述的基因转运体，其中所述厌氧微生物是双歧杆菌。
16.如权利要求15所述的基因转运体，其中所述双歧杆菌选自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
17.如权利要求16所述的基因转运体，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。
18.如权利要求13所述的基因转运体，其中它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且能够表达(a)具有抗肿瘤活性的蛋白，或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
19.如权利要求18所述的基因转运体，其中它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且能够表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
20.如权利要求19所述的基因转运体，其中所述基因转运体是长双歧杆菌105-A/pBifiCD(技术与评价专利微生物保藏国立研究所(National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary)接收号NITE BP-491)。
21.用于实体瘤治疗剂的药物组合物或治疗剂，包含权利要求13至20中任一权利要求所述的基因转运体。