本发明提供了分离的突变atpE蛋白，并从所述突变atpE蛋白中 鉴别了一种ATP酶结合结构域。本发明也提供了相关核酸、载体、 宿主细胞、药用组合物和产品。本发明进一步提供了确定试验化合 物是否与atpE蛋白相互作用(即是否与本发明的ATP酶结合结构域 相互作用)的方法，也提供了包含所述试验化合物的药用组合物，具 体的，所述试验化合物被用作抗微生物药，更具体来说用作抗分枝 杆菌药，尤其被用以治疗患结核的患者。
发明背景
在全世界成人死亡原因中结核(TB)排名前列(次于AIDS)，每年 导致2-3百万成人死亡，并且是减少全球贫困和疾病工作的关键性 障碍(1)。引起该病重新泛滥的因素包括，许多国家在实施抗结核计 划中遇到的困难，免疫抑制人数的迅速增加(主要由于HIV感染)， 以及进出结核高发区的人群流动。TB和HIV在双重感染人群中互 相促进传染一目前有1100万人-不仅提高发病率也提高了死亡率 (2，3)。另外在HIV感染者的致死原因中，TB也排名前列(4)。
尽管第一线抗TB药物能取得90％以上的有效率，但它们的复 杂性会在缺乏适当医疗措施和抗TB计划时引起差药物依从性(poor compliance)，并从而引起抗性(5)。结核病菌的多重药物抗性(MDR) 菌株会使得治疗变得非常复杂(6)。全球结核药物开发联盟(The Global Alliance for TB Drug Development)已经指出，任何新的治疗方法都必 须具有以下三种相对于已有治疗方法的优势中的至少一种：缩短或 简化有效TB疗法；提高针对MDR菌株的效率；改进潜在TB感染 形式的治疗。这种新药能够极大地改善病人的依从性，从而降低TB 治疗计划(例如世界卫生组织的现代结核病控制策略(Directly Observed Treatment Short-course(DOTs))(7))的成本。
当前处于研发期和临床使用期的新型抗TB候选药物很可能来 自现有的药物家族(例如莫西沙星)，或者来自第一线药物的类似物例 如MJH-98-1-81(来自异烟肼)、噁唑烷酮类，和利福喷丁(一种非常 类似利福平的物质)(8)。尽管这些药物可能是有效的，但结构类似物 只能暂时解决抗性问题(9)，因为它们的作用机制与现有药物家族一 致。
总体上抗生素通常通过特定机制来抑制细菌代谢从而抑制细菌 的复制。例如异烟肼对合成枝菌酸的酶作用机制进行干扰，其中枝 菌酸是细胞壁的必需成分，而利福平则对细菌的DNA转录机制加以 干扰。因此人们热衷于探索新的方法来鉴别新型抗TB化合物，与 已知药物相比，这些化合物靶作用于分枝杆菌细胞生长和复制过程 中不同的特定方面。
发明概述
本发明提供了分离的突变atpE蛋白，其氨基酸序列选自(SEQ ID No.1)、(SEQ ID No.2)、(SEQ ID No.3)、(SEQ ID No.4)和(SEQ ID No.5)，和分离的突变atpE蛋白的编码核酸序列，选自(SEQ ID No.6)、(SEQ ID No.7)、(SEQ ID No.8)、(SFQ ID No.9)和(SEQ ID No.10)，以及包含瞬时表达核酸的载体。在一个具体实施方案中突 变atpE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2，而其编码核酸序列由SEQ ID No.7组成。
本发明还提供了宿主-载体系统，其中包括具有瞬时表达载体的 细胞。
本发明也提供了包含突变atpE蛋白的分离的细胞，其中所述蛋 白使得这些细胞具有抗微生物药的抗性。
本发明也提供了鉴别抗微生物化合物的方法，其步骤包括：
(a)在生理条件下使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触；
(b)确定此试验化合物是否与该atpE蛋白相互作用。
本发明也提供了评价试验化合物与atpE蛋白相互作用潜力的方 法，其步骤包括：
(a)使用分子建模(molecular modeling)技术来建立atpE蛋白的三 维结构；
(b)使用计算方法在试验化合物和atpE蛋白三维结构间进行契合 操作；和
(c)分析契合操作结果，以量化试验化合物和atpE蛋白三维结构 间的联系。
本发明也致力于提供ATP酶的F0部分的结合位点，其中至少包 含一个C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和 Phe65；一个A亚基的Ser182、Leu183、Ser184、Leu185和Arg186，并且 所述氨基酸都具有表3、4或5中任一个所列的原子坐标。
本发明的另一目标，是提供使用前述结合结构域的，用以鉴别 可与ATP酶的F0部分相互作用的化合物以及鉴别它们作为抗微生物 化合物潜力的方法，特别是使用前述结合结构域来鉴别抗分枝杆菌 化合物。
因此本发明的另一目的是提供治疗微生物感染者的方法，该法 包括给予感染者可与ATP酶的F0部分相互作用的化合物，尤其是与 atpE蛋白中赋予其抗性的突变位点或与本发明的结合位点相互作用 的化合物。本发明还提供了治疗患有结核的患者方法，包括给予患 者通过上述任何筛选方法得到的可与atpE蛋白相互作用的药物。这 种治疗方法使用可与ATP酶的F0部分相互作用，特别是与atpE蛋 白相互作用的化合物，但是，先前已知的可与ATP酶的F0部分相互 作用，特别是与atpE蛋白相互作用的化合物要排除在外。特别是要 排除按照任何公开治疗方法使用DARQ J(11)化合物。
本发明也提供了药用组合物，其中包括可在细胞中与atpE蛋白 相互作用的药物，和药学可接受的载体。最后，本发明提供了产品， 包括包装和药物，其中(a)药物可在细胞中与atpE蛋白相互作用，(b) 包装包括指导如何使用该药物治疗细菌感染者的标签。在本发明的 一个具体实施方案中，描述了如何使用DARQ J来制备抗微生物药 物。
下文中将对本发明的各个方面进行更加详细的说明。
附图简述
表1.先导DARQ化合物(J)的最小抑制浓度(MIC)，此浓度的 J化合物将不同分枝杆菌的生长抑制90％。如果没有特 别指出，试验菌株数的n＝1。
表2.DARQ J化合物的结合位点周围的氨基酸。
表3.结核分枝杆菌(M.tuberculosis)野生型和DARQ J抗性突 变株中DARQ J化合物的结合位点周围氨基酸的原子坐 标。
表4.野生型结核分枝杆菌中DARQ J化合物的结合位点的原 子坐标。
表5.突变型结核分枝杆菌中DARQ J化合物的结合位点的原 子坐标。
表6.结核分枝杆菌突变atpE蛋白(SEQ ID No.2)的原子坐 标。
表7.结核分枝杆菌野生型atpE蛋白(SEQ ID No.1)的原子坐 标。
图1.R207910，这里也指J或DARQ J的绝对构型。
图2.结核分枝杆菌和突变耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)atpE蛋 白的序列比对。Mtb_S：结核分枝杆菌H37Rv的药物敏 感株，atpE(1-81)。收录号(Accession number)Swiss-Prot Q10598(SEQ ID No.1)。Mtb_R：结核分枝杆菌BK12的 耐药株，atpE(1-81)(SEQ ID No.2)。Msm_S：耻垢分枝 杆菌的药物敏感株，atpE(1-86)。从Institute for Genome Research得到的序列(SEQ ID No.3)。Msm_R09(SEQ ID No.4)和R10(SEQ ID No.5)：耻垢分枝杆菌的耐药株， atpE(1-86)。内部得到的序列，人：人(Homo sapiens)， ATP5G3(66-142)。收录号：Ensembl ENSP00000284727。 顶端序号：结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌atpE。底端序 号：人ATP5G3(66-142)。阴影部分表示使用BLOSUM62 矩阵得到的氨基酸相似度(黑色＝高度相似；灰色＝中度 相似)。箭头表示在抗性突变株中发现的点突变位置。
图3.在DARQ J、异烟肼和DCCD存在时结核分枝杆菌中总 细胞ATP测量结果。在结核分枝杆菌野生型和DARQ J 抗性突变株内，波长526nm处测得的氧化萤光素的相对 发光单位(Relative Luminescence Units)。
图4.三个C亚基(A链、K链和L链)和A亚基(M链)的带状 结构表示，这些亚基共同形成DARQ J化合物的结合位 点。
发明详述
定义
如果没有另外加以明确说明，本申请中使用的下列术语的含义 均在下文列出。
“atpE蛋白”指ATP酶复合体F0亚基的C链(由SwissProt entry Q10598，结核分枝杆菌代表)，或者是与所述结核分枝杆菌序列具有 至少70、80、90、95或99％序列同一性的蛋白。
“F1F0ATP酶”又称为ATP酶、ATP合酶或F1F0ATP酶，其是 指催化ATP合成或水解的多亚基大复合体。F1F0ATP酶由两个结构 域组成：F1部分，它位于膜的外部并含有催化位点；F0部分，它跨 越双层膜并含有质子孔(proton pore)。在细菌原生质膜、叶绿体内囊 体膜和线粒体内膜上都发现了ATP酶，ATP酶使用质子电化学梯度 来驱动ATP的合成。
“给药”指以某种方式递药，可通过本领域技术人员已知的各 种方法中任何一种和递药系统来进行。可通过如局部给药、静脉内 给药、心包内给药、口服给药、移植给药、透粘膜给药、透皮给药、 肌内给药、皮下给药、胸(膜)腔内给药、鞘内给药、淋巴管内给药、 皮损内注射或者硬膜外给药进行。也可进行如一次、多次给药，和/ 或在一个或多个较长时期内进行给药。
“宿主细胞”包括(但不仅限于)细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细胞。可通过本领域熟知的磷酸钙沉淀法、电 穿孔法和微注射法等方法来转染细菌细胞。
“分离的”atpE蛋白指包含atpE蛋白的膜片段制备物，或者其 它合适的制备物，其中atpE蛋白保留了其天然功能并且不含有一些/ 所有其天然环境中的其它蛋白。这意味着包括含F0F1ATP酶的F0部 分的膜制备物，特别是含有本发明的突变atpE蛋白的F0部分的膜制 备物。
“细菌细胞”指任何细菌细胞。细菌细胞包括(但不仅限于)正常、 不正常和转化的细胞，例如分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌和耻垢 分枝杆菌、棒状杆菌、诺卡氏菌、革兰氏阳性菌例如链球菌、葡萄 球菌和肠球菌，革兰氏阴性菌例如大肠杆菌、流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
“核酸”和“多核苷酸”在本文中含义相同，都指脱氧核糖核 苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可以 指天然产物或合成的类似物。
当提及给定细胞的“生理条件”时，通常指细胞所处的生化环 境。细胞的生化环境包括(但不仅限于)细胞通常面对的所有/一些蛋 白酶。这种条件包括(但不仅限于)体内条件。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中含义相同，都指氨基酸残 基的聚合物。氨基酸残基可是天然产物或者是其化学类似物。多肽、 肽和蛋白也包括修饰后产物，例如糖基化、连接上脂质、硫酸化、 羟基化和ADP-核糖基化。
“受试者”又称为“感染者”或“患者”，包括任何动物，例如 哺乳动物或鸟类，包括(但不仅限于)牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、 猫、啮齿类如小鼠或大鼠、火鸡、小鸡和灵长类。在优选的实施方 案中受试者指人。
“治疗”包括(但不仅限于)将受试者的疾病加以消除、使疾病过 程逆转、延缓疾病发展、减轻病痛，或者其它改善。
“载体”指本领域已知的任何核酸载体。这种载体包括(但不仅 限于)质粒载体、粘粒载体和噬菌体载体。
“候选物”和“试验化合物”在本文中含义相同，都指相信可 作为生物反应修饰剂而与其它基团(即atpE蛋白)相互作用的物质。 例如相信代表性候选物可与atpE蛋白相互作用，并可修饰ATP酶活 性。可使用本发明的方法进行研究的候选物包括如(但不仅限于)肽、 酶、酶底物、辅因子、糖、寡核苷酸、小分子量化合物和单抗。
“调节”指将野生atpE蛋白或突变atpE蛋白的任一或所有化学 和生物学活性/特性，加以提高、降低，或进行其它改变。
“相互作用”指分子间可检测性的互相作用，包括分子间的“结 合”相互作用。相互作用可以是如天然发生的蛋白-蛋白间或者蛋白- 核酸间相互作用。可以使用本领域已知方法来检测这些相互作用， 如使用酵母双杂交系统、免疫沉淀反应、闪烁亲近分析法、或滤器 结合检测。
这里所用的“原子坐标”或“结构坐标”指描述原子在Protein Data Bank(PDB)格式(format)中位置的数学坐标，包括每个原子的X、 Y、Z和B坐标。本领域技术人员应理解，由X射线结晶学确定的 一组结构坐标并不是没有标准偏差的。在本发明中，任何来源的一 组ATP合酶结构坐标，当叠加在相应于表3、4、5、6或7所列原 子坐标的非氢原子位置上时，其非氢原子位置的均方根偏差小于 即认为它们均有实质同一性或同源性。在更优选的实施方案 中，任何来源的ATP合酶的任何组的结构坐标，当叠加在相应于表 3、4、5、6或7所列原子坐标的非氢原子位置上时，其非氢原子位 置的均方根偏差小于即认为它们均有实质同一性或同源性。
发明的实施方案
突变atpE蛋白
本发明提供了分离的突变atpE蛋白，具体来说是细菌atpE蛋白， 再具体来说是分枝杆菌atpE蛋白，更具体来说是结核分枝杆菌和耻 垢分枝杆菌atpE蛋白。突变选自单点突变、插入或删除。在本发明 的一个实施方案中，所述突变包括在20-40位氨基酸特别是30-40位 氨基酸之中任意位置(优选在34位氨基酸)引入至少一个点突变，或 者在60-75位氨基酸特别是62-73位氨基酸之中任意位置(优选在69 位氨基酸)引入至少一个点突变，如图2中的序列比对所示。在另一 实施方案中，分离的突变atpE蛋白选自Mtb_R(SEQ ID No.2)、 Msm_R09(SEQ ID No.4)和Msm_R10(SEQ ID No.5)，如图2所示， 或者是与上述的任何氨基酸序列具有至少70、80、90、95、97或98％ 的序列同一性的蛋白。
本发明还提供了分离的编码所述突变atpE蛋白的核酸。在一个 实施方案中，所述核酸序列包含所有编码F0部分的基因(参见如 J.Biol.Chem，1994，Vol.269(10)，p.7285-7289)，其中所述基因转录自一 个单启动子，并包含编码本发明突变atpE蛋白的核酸序列。核酸可 以是DNA或RNA，优选为DNA，在另一实施方案中核酸选自编码 Mtb_R(SEQ ID No.7)、Msm_R09(SEQ ID No.9)或Msm_R10(SEQ ID No.10)的核酸序列，或者是与上述任何核酸序列具有至少70、80、90、 95、97或98％的序列同一性的核酸序列。
可使用商品化计算程序来计算核酸和多肽序列的同一性百分 比，这些工具将查询序列与参考序列进行比较。可使用以下程序(由 National Center for Biotechnology Information提供)来确定同源性/同 一性：BLAST、gapped BLAST、BLASTN和PSI-BLAST(均可使用 默认参数)。
algorithm GAP算法(Genetics Computer Group，Madison，WI)使 用Needleman和Wunsch algorithm比较两个完整序列，它们可使契 合数达到最大并使缺口数(gap)为最小。一般使用默认参数，gap扣 分(gap creation penalty)＝12，gap延伸扣分(gap extension penalty)＝4。
FASTDB软件基于Brutlag等人报道的算法(Comp.App.Biosci.，6； 237-245(1990))，是另一种确定一个核酸序列(或其部分)与查询序列 间最佳整体契合度的方法。该软件能够对序列进行全面比对。全面 比对的结果在同一性百分比中。使用FASTDB搜索DNA以计算同 一性百分比时合适的参数为：Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或 者等于查询序列的碱基长度(二者之中较短者)。计算氨基酸序列同一 性百分比和相似度时合适的参数为：Matrix＝PAM 150，k-tuple＝2， Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05， Window Size＝500或者等于查询序列的碱基长度(二者之中较短者)。
本发明还提供了包含瞬时核酸的载体。在一个实施方案中载体 是质粒载体。
本发明也提供了宿主-载体系统，包括具有瞬时质粒载体的宿主 细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，在一个实施方案中宿 主细胞是细菌细胞，特别是分枝杆菌细胞例如结核分枝杆菌或耻垢 分枝杆菌。
本发明也提供了包含突变atpE蛋白的分离细胞，该蛋白在细胞 中引起抗微生物药的抗性。在一个实施方案中，这种分离细胞是转 化有突变分枝杆菌atpE蛋白的耻垢分枝杆菌细胞，该突变蛋白特别 是指在20-40位氨基酸特别是30-40位氨基酸之中任意位置(优选在 34位氨基酸)引入至少一个点突变，或者在60-75位氨基酸特别是 62-73位氨基酸之中任意位置(优选在69位氨基酸)引入至少一个点 突变的突变蛋白，如图2中序列比对所示。
筛选方法
本发明也提供了鉴别抗微生物化合物的方法，所述方法的步骤 包括：
(a)在生理条件下使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触；
(b)确定该试验化合物是否与atpE蛋白相互作用。
在一个实施方案中，上述方法中所用的atpE蛋白为细菌atpE蛋 白(特别是分枝杆菌蛋白)，包括上文所述的野生型蛋白和突变蛋白。 在本发明的另一实施方案中，上述方法中所用的分枝杆菌atpE蛋白， 是本发明的突变分枝杆菌atpE蛋白。在上述方法的一个特殊实施方 案中，使用转化有本发明的突变atpE蛋白的宿主细胞，并且通过确 定对F1Fo-ATP酶(包含所述突变atpE蛋白)酶活的可能抑制来测量该 试验化合物与所述atpE蛋白间的相互作用。使用本领域已知方法来 确定对F1Fo-ATP酶活性的抑制，例如向包含有ATP酶和作为底物 的ATP的系统中添加该物质，并通过将ADP的生成与NADPH的 氧化(经由丙酮酸激酶和乳酸氢化酶反应)相偶联来检测酶活。
在这种方法的一个实施方案中，可以在结合试验中使用atpE蛋 白。结合试验可以是竞争性的或者是非竞争性的。这种试验可以对 大量化合物进行快速筛选，来确定任何能够与多肽相结合的化合物。
这里本发明提供了用以鉴别试验化合物是否与本发明的分离atpE 蛋白相结合的方法，从而鉴别潜在的抗微生物化合物，所述方法步 骤包括：
a)使表达atpE蛋白的细胞，在存在或不存在已知能与该蛋白结合 的化合物的情况下，与试验化合物相接触，其中所述细胞不正常表 达所述atpE蛋白。
b)使用已知能与该atpE蛋白结合的化合物作为参考，来确定该试 验化合物与atpE蛋白的结合。
使用本领域已知的研究蛋白-配体相互作用的方法，来测量试验 化合物或已知能与atpE蛋白结合的化合物(下文中也指参考化合物) 的结合作用。例如可使用标记的物质或参考化合物来测量这种结合 作用。可使用本领域已知的任何便利方法来对试验化合物或参考化 合物，特别是化合物J(图1)进行标记，例如放射性标记、荧光标记 或酶标记。在上述方法的一个具体实施方案中，对已知能与atpE蛋 白结合的化合物(也即参考化合物)进行可检测性标记，并且使用所述 标记确定试验化合物与atpE蛋白的结合。使用放射性标记、荧光标 记或酶标记，更优选使用放射性标记对所述参考化合物进行标记，
在本发明的另一可选实施方案中，上述结合实验在细胞组合物 上进行，即在含有上文所定义atpE蛋白的细胞提取物中，细胞碎片 或细胞器中进行。更具体来说，上述结合试验在细胞组合物中进行， 即在含有上文所定义atpE蛋白片段的膜制备物中进行，其中所述的 细胞组合物(即膜制备物)由耻垢分枝杆菌细胞获得，而该细胞转化有 突变分枝杆菌atpE蛋白，这种突变蛋白特别是指在20-40位氨基酸 特别是30-40位氨基酸之中任意位置(优选在34位氨基酸)引入至少 一个点突变，或者在60-75位氨基酸特别是62-73位氨基酸之中任意 位置(优选在69位氨基酸)引入至少一个点突变的突变蛋白，如图2 中序列比对所示。以Mtb_S(SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQ ID No.2) 的序号作为参照，上述区域相应于14-34位氨基酸，特别是24-34位 氨基酸，优选相应于28位氨基酸，或者相应于54-69位氨基酸，特 别是56-67位氨基酸，优选为63位氨基酸。
在的一个实施方案中，结合实验使用膜制备物进行。可在传统 滤器-结合实验(如使用Brandel过滤实验装置)或者高通量闪烁亲近分 析法(SPA and Cytostar-T flashplate technology；Amersham Pharmacia Biotech)中使用这些膜制备物，来检测具有放射性标记的atpE配体(包 括3H标记的DARQs)的结合作用，和结合位点竞争物对这些放射性 标记的替换。可使用Packard Topcount或能够对96-、384-、1536- 微滴定板进行快速测量的类似装置来测量放射性。SPA/Cytostar-T技 术尤其适用于高通量筛选，因此该技术适合用于对能够替换标准配 体的化合物进行筛选。
其它在近似自然条件下研究配体与atpE结合作用的方法，利用 了Biacore(Biacore)装置开发的表面胞质团共振效应。膜制备物中或 整个细胞中的atpE蛋白可被连接到Biacore的生物传感器芯片上， 在存在和不存在化合物的情况下检测配体的结合作用，来鉴别结合 位点的竞争物。
分子建模
本发明还提供了评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用潜力 的方法，步骤包括：
(a)使用分子建模技术来阐明atpE蛋白的三维结构；
(b)使用计算机方法在试验化合物和atpE蛋白的三维结构间进行 契合操作；
(c)分析所述契合操作的结果，以量化试验化合物和atpE蛋白三 维结构间的联系。
本领域已知的分子建模技术，包括硬件和软件都适于创建受体 模型和酶的构象，并加以利用。
有许多可用的计算机程序都适合于进行计算机建模、模型建立 操作，以及对本文所述方法中与化合物相互作用的atpE进行鉴别、 选择和测量操作。这些程序包括如，GRID(来自Oxford University， UK)，MCSS(来自Accelrys，Inc.，San Diego，CA)，AUTODOCK来自 Oxford Molecular Group)，FLEX X(来自Tripos，St.Louis.MO)， DOCK(来自University of California，San Francisco，CA)，CAVEAT (来自Universty of California，Berkeley)，HOOK(来自Accelrys，Inc.， San Diego，CA)，以及3D数据库系统如MACCS-3D(来自MDL Information Systems，San Leandro，CA)，UNITY(来自Tripos，St. Louis.MO)和CATALYST(来自Accelrys，Inc.，San Diego，CA)。也可 使用软件包如LUDI(来自Biosym Technologies，San Diego，CA)， LEGEND(来自Accelrys，Inc，San Diego，CA)和LEAPFROG(来自 Tripos，St.Louis.MO)Potential来在计算机中从头(“de novo”)设计潜 在候选物。可使用程序如GAUSSIAN 92，AMBER， QUANTA/CHARMM和INSIGHT II/DISCOVER来分析化合物的变 形能(deformation energy)和静电排斥力。可在任何合适的硬件上进行 这些计算机测量和建模操作，如Silicon Graphics，Sun Microsystems 工作站等。这些建模技术、方法、硬件和软件包都只是代表，不仅 限于所列举的这些。也可依照本发明使用本领域已知的其它建模技 术，参见如N.C.Cohen，Molecular Modeling in Drug Design，Academic Press(1996)。
在本发明的一个实施方案中，atpE蛋白的三维结构，用Ile28、 Glu61和Ile63的原子坐标(E.coli(Protein Database 1Q01))+/-所述氨 基酸骨架原子的均方根偏差(不超过优选不超过)得到。
如下文例子所述，本发明的目的之一是提供atpE蛋白的三维结 构。表6和7提供了突变atpE蛋白(SEQ ID No.2)和野生型atpE蛋 白(SEQ ID No.1)的原子坐标。因此在一个实施方案中，使用表6或 7的原子坐标得到atpE蛋白的三维结构。在特别的实施方案中，使 用表7的原子坐标得到atpE蛋白的三维结构。DARQ J化合物抑制 A亚基的Arg186与C亚基的去质子形式的Glu61之间的相互作用。 因此本发明的目的之一是提供使用表6或7中的原子坐标来评价试 验化合物与atpE蛋白发生相互作用潜力的方法。
结合位点
在本发明的另一实施方案中鉴定了ATP酶的F0部分。结合位 点是被鉴别为能够与DARQ J化合物结合的位点，发现它与上文中 鉴别的结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的atpE蛋白(17)中抗性赋予突 变位点区域一致。因此本发明提供了ATP酶的F0部分中的结合位 点，其特性为包含atpE蛋白中的抗性赋予突变位点。这里所用的抗 性赋予突变位点指atpE蛋白的14-34位氨基酸，特别是24-34位氨 基酸，以及53-69位氨基酸，特别是56-67位氨基酸，这里使用Mtb_S (SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQ ID No.2)的序号作为参照。
在另一实施方案中，结合位点至少包含一个C亚基的氨基酸 Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和Phe65，以及一个 A亚基的氨基酸Ser182、Leu183、Leu185和Arg186(A亚基为，表3、4、 5中的Ser 206-Leu 207-Leu 209和Arg 210)，这里所述氨基酸具 有表3、4、5中任一个所列原子坐标，或者具有同源结构坐标，其 中同源结构坐标叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标的非氢原子 位置上时，其非氢原子的均方根偏差小于优选小于在特别实施方案中，结合位点包含第一C亚基的氨基酸Ala21、Gly25； 第二C亚基的氨基酸Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、 Tyr64、Phe65；第三C亚基的氨基酸Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、 Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、 Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64和Phe65； 以及一个A亚基的氨基酸Leu183、Leu185和Arg186，其中所述氨基酸 具有表3、4、5中任一个所列原子坐标，或者具有同源结构坐标， 其中同源结构坐标叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标的非氢原 子位置上时，其非氢原子的均方根偏差小于优选小于在更特别的实施方案中，结合位点组成为：第一C亚基的Ala21、 Gly25；第二C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、 Tyr64、Phe65；第三C亚基的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、 Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、 Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65以及一 个A亚基的Leu183、Leu185和Arg186，其中所述氨基酸具有表3、4、 5中任一个所列原子坐标。在最特别的实施方案中，结合位点组成 为：第一C亚基的Ala21、Gly25；第二C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、 Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65；第三C亚基的Met17、Gly19、 Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、 Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、 Tyr64、Phe65以及一个A亚基的Leu183、Leu185和Arg186，这里所述 氨基酸具有表3所列原子坐标。
因此本发明的目的之一，是在计算机筛选程序中使用上述原子 坐标来评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用的潜力。在一个实 施方案中，本发明提供了评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用 潜力的方法，包括：使用分子建模技术产生ATP酶F0部分结合位 点的三维结构；使用计算机方法在试验化合物和结合位点三维结构 之间进行契合操作；分析所述契合操作结果，以量化试验化合物与 结合位点三维结构间的相互联系。在本发明的另一实施方案中，结 合位点的三维结构用表3、4或5所列原子坐标产生，或者用同源结 构坐标产生，其中同源结构叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标 的非氢原子位置上时，其非氢原子的均方根偏差小于优选小 于在特别的实施方案中，三维结构从以下原子坐标得到， 表3、4或5中任一个的A链的Ala21、Gly25；表3、4或5中任一个 的K链的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65； 表3、4或5中任一个的L链的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、 Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、 Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65； 表3、4或5中任一个的M链的Ser206、Leu207、Leu207和Arg210。
在这种筛选方法中，或者通过形状互补性，或者通过估计的相 互作用能来判断这些化合物与结合位点的契合度(Meng，E.C.et al.，J. Coma.Chem 13：505-524(1992))。
结合位点的应用
在设计结合到本发明的atpE蛋白并增强或抑制其活性的化合物 时，通常考虑两个因素。第一，该化合物必须能够与atpE蛋白发生 物理的、结构上的结合。在atpE蛋白和该化合物间的相互联系中， 非共价分子相互作用起重要作用，包括氢键、范德华力和疏水相互 作用。第二，该化合物必须能够呈现出可允许它与atpE发生联系的 构象。尽管该化合物的某些部分不直接参与它与atpE的相互联系， 但这些部分仍可能会影响分子的整体构象，从而对结合亲和力、疗 效、药物样(drug-like)性质和药效产生显著影响。对构象的要求包括 化学实体或化合物的整体三维构象和方向，这些化学实体或化合物 涉及到全部或部分的atpE活性位点，或者其它区域，或者涉及到(含 有多个直接与atpE作用的化学实体的)化合物中功能基团的间距。
在实际合成配体或其它化合物对并其进行测试之前，可以先使 用计算机建模技术对配体或其它化合物对atpE的潜在的、预测的、 抑制性的激动剂、拮抗剂或结合作用进行分析。如果给定化合物理 论结构不足以使其与atpE发生联系并产生相互作用，那么就可以不 合成并测试该化合物。但是如果计算机建模说明化合物对atpE具有 强烈的作用，那么该分子即可以被合成并测试它与atpE发生相互作 用的能力。如此即可避免合成不起作用的化合物。在某些情况下， 通过建模预测其失活化合物，合成并对其进行测试，以研究与atpE 特定区域发生相互作用的化合物的SAP(结构-活性关系)。
本领域技术人员可从多种方法选取一种来对化学实体片段、化 合物或药物进行筛选，筛选依据它们与atpE的发生联系的能力，特 别是依据它们与atpE的单个结合口袋(pocket)或活性位点发生联系的 能力来进行。使用这种方法时，可以首先根据atpE或atpE-配体复 合体的原子坐标，在计算机上对如活性位点等进行目测(visual)。然 后可将选出的化学实体、化合物或药物以多个不同方向进行放置， 或者将它们装(dock)在atpE的一个单独结合口袋内。可使用Quanta 和Sybyl等软件来进行装入操作，然后使用标准分子力场(mechanics forcefields)软件如CHARMM和AMBER使分子能量最小化，并进 行分子动力学分析。
可使用专门的计算机程序来辅助选择化学实体。这包括(但不仅 限于)GRID(Goodford，P.J.，“一种确定重要生物大分子的能量有利 的结合位点的方法”，″A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules，″J.Med.Chem.28：849-857(1985)，来自Oxford University，Oxford，UK)；MCSS(Miranker，A.and M.Karplus，“结合 位点的功能图：一种同时多拷贝搜索方法”″Functionality Maps of Binding Sites：A Multiple Copy Simultaneous Search Method.″Proteins： Structure，Function and Genetics 11：29-34(1991)，来自Molecular Simulations，Burlington，Mass.)；AUTODOCK(Goodsell，D.S.and A.J. Olsen，“通过模拟退火来进行底物道蛋白的自动停泊”″Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing″Proteins： Structure.Function，and Genetics 8：195-202(1990)，来自Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.)；DOCK(Kuntz，I.D.et al.，“分析 大分子-配体相互作用的基因组方法”″A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions，″J.-Mol.Biol.161：269-288(1982)， 来自University of California，San Francisco，Calif.)
可以使用软件来分析表面位点以确定相似的抑制蛋白或化合物 的结构，如GRID软件，它可以确定探针与不同特性功能基团以及 与大分子表面间可能存在的作用位点。用分子上合适的抑制基团(如 质子化的伯胺(protonated primary amine))作为探针，可使用GRID工 具在合适的能量等高线(energy contour)水平上鉴别可接近位点周围的 潜在热点。可使用DOCK程序来分析活位点或配体结合位点，并 找出具有互补空间特性的配体。
一旦选定化学实体、化合物或药物，可以将它们组装成单独配 体、化合物、抑制剂或活化剂。可通过在三维图像上对片段间的相 互关系进行目测来进行组装。然后使用如Quanta或Sybyl等软件进 行人工建模。
可有助于将单独化学实体、化合物或药物进行连接的计算机软 件程序包括(但不仅限于)CAVEAT(Bartlett，P.A.et al.，“CAVEAT： 一种生物活性分子的结构-起源设计工具”″CAVEAT：A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules.″In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems，Special Pub.，Royal Chem.Soc.，78，pp.82-196(1989))；3D 数据库系统如MACCS-3D(MDL In Information Systems，San Leandro， Calif.and Martin，Y.C.，“药物设计中的3D数据库”″3D Database Searching in Drug Design″，J.Med.Chem.35：2145-2154(1992)；HOOK (来自Molecular Simulations，Burlington，Mass.)。
有若干种方法可用来搜索三维数据库测试药效团假设并为下一 步筛选选出化合物。这些方法包括CAVEAT软件(Bacon et al.，J.Mol. Biol.225：849-858(1992))。例如，CAVEAT使用环状化合物数据库， 这些化合物可以作为间隔基团(″spacers″)将任何数目的已经定位在活 性位点的化学片段连接起来。该软件使得本领域技术人员可以很快 得到几百种可能的方法，来将已知的(或怀疑是)紧密连接所必需的片 段连接起来。不是逐步构建atpE的抑制活化剂、激动剂或拮抗剂， 如上文所述一次构建出一个化学实体，而是可使用空活性位点或已 知分子的任意部分来整体设计或从头设计这些化合物。这些方法包 括：LUDI(Bohm，H.-J.，LUDI软件：一种新型从头设计酶抑制剂的 方法，″The Computer Program LUDI：A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors″，J.ComR.Aid.Molec.Design，6，pp.61- 78(1992)，Biosym Technologies，San Diego，Calif.)；LEGEND (Nishibata，Y.and A.Itai，Tetrahedron 47：8985(1991)，Molecular Simulations，Burlington，Mass.)和LeapFrog(Tripos Associates，St. Louis，Mo.)。
例如，LUDI软件可以确定出一系列相互作用位点，以将氢键和 疏水片段放置进去。然后LUDI使用接头文库将最多四个不同相互 作用位点连接起来形成一个片段。接着更小的“桥”(bridging)分子 例如--CH2-和--COO-被用来将这些片段连接起来。例如就DHFR 酶而言，LUDI复制了其公认抑制剂氨甲喋呤内的关键功能基团的放 置情况。也参见Rotstein and Murcko，J.Med.Chem.36：1700-1710 (1992)。
依据本发明也可使用其它分子建模技术。参见如Cohen，N.C.et al.，“药物化学的分子建模软件和方法”″Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry，J.Med.Chem.33：883-894 (1990)；Navia，M.A.and M.A.Murcko，“药物设计中结构信息的运 用”″The Use of Structural Information in Drug Design，″Current Opinions in Structural Biology，2，pp.202-210(1992)。
一旦通过上述方法设计并选定某化合物，即可通过计算机方法 和/或合成化合物后测试生物活性，来测试该化合物与atpE发生结 合或联系的亲和力并加以优化。抑制剂或化合物可能会与一种以上 整体结合能相似的atpE构象发生相互作用。在这些情况下，结合带 来的变形能就是自由化合物能量与化合物结合到atpE时所观察到构 象的平均能量之间的差异。
设计或选定的用以与atpE结合或发生联系的化合物可被进一步 通过计算机方法进行优化，以使其结合态中其与atpE相互之间优选 没有静电排斥力。这种非互补(如静电力)相互作用包括排斥性电荷- 电荷、偶极(dipole)-偶极和电荷-偶极相互作用。具体来说，当抑制 剂结合后，抑制剂与atpE之间的所有静电相互作用的总和优选对结 合焓起抵消或有利的作用。通过这些方法也设计出弱结合化合物以 确定SAR，参见如U.S.Appl.Nos.60/275,629；60/331,235；60/379,617； and，10/097,249。
本领域中已有明确的计算机软件来评价化合物的变形能和静电 相互作用。为这种应用设计的软件如，Gaussian 92，C版本(M.J. Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，Pa.，COPYRGT 1992)；AMBER，4.0 版本(P.A.Kollman，University of California at San Francisco， COPYRGT 1994)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations，Inc.， Burlington，Mass.COPYRGT 1994)；Insight II/Discover(Biosysm Technologies Inc.，San Diego，Calif.COPYRGT 1994)。本领域技术人 员也知道其它的硬件系统和软件包。
一旦按上述方法优化选定或设计出与atpE联系的化合物，即可 对其一些原子或侧链基团进行替换以改善或调节其结合特性。通常 一开始替换为保守性替换，即新的基团具有与原基团相似的大小、 形状、疏水性和电荷。当然，应避免使用本领域中已知会改变构象 的组分。然后同样使用上文详述的计算机方法，对这些经化学替换 的化合物与atpE的契合有效性进行分析。
本发明也提供了系统尤其是计算机系统，其中包含了本文所述 的序列和/或结构坐标。设计这些系统的目的是为atpE或ATP酶F0部 分中的结合位点确定结构和合理的药物设计。计算机系统是指上文 所述的任何计算机方法中，用于分析本发明的序列和/或结构坐标的 硬件、软件和数据库。本发明中基于计算机的系统中的硬件至少应 包括CPU、输出装置、输入装置和数据存储装置。技术人员可很容 易的认识到目前的商品计算机系统适于应用在本发明中。
因此本发明的目的之一是提供计算机可读的数据存储装置，其 中包含本文所述结构坐标。这里所用的“计算机可读的数据存储装 置”指任何可被计算机读取或直接存取的装置。这种装置包括(但不 仅限于)磁存储装置如软盘、硬盘和磁带；光存储装置如光盘CD- ROM；电存储装置如RAM和ROM；以及这些装置的综合如磁/光 存储装置。
治疗方法
如上文所述，提供使用从上述任意筛选方法得到的化合物来治 疗微生物感染受试者的治疗方法也是本发明的目的之一。总体上细 菌病原体被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。同时具有抗革兰氏 阳性和革兰氏阴性菌的抗微生物化合物通常被认为具有广谱抗菌活 性。本发明的化合物具有抗革兰氏阳性菌活性和/或抗革兰氏阴性菌 活性。特别的，本发明的化合物至少可抵抗一种革兰氏阳性菌，优 选可抵抗若干种革兰氏阳性菌，更优选可抵抗一种或多种革兰氏阳 性菌和/或一种或多种革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌包括葡萄球菌如金黄 色葡萄球菌(S.aureus)；肠球菌如粪肠球菌(E.faecalis)；链球菌如肺 炎链球菌(S.pneumoniae)、变异链球菌(S.mutans)、产脓链球菌(S. pyogens)；杆菌例如芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；李斯特氏菌如单核 细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；嗜血杆菌如流感嗜 血杆菌(H.influenza)；莫拉氏菌如卡他莫拉菌(M.catarrhalis)；假单 胞菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和埃希氏菌如大肠杆 菌(E.coli)。
革兰氏阳性病原菌如葡萄球菌、肠球菌和链球菌特别重要，因 为这些种类的抗性菌株一旦建立，就很难治疗也很难根除(如从医院 环境中根除)。这种菌株的实例有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)，青霉素耐药肺 炎链球菌和多耐药性粪肠球菌。
本发明化合物也显示出对耐药菌株的活性。
本发明的化合物对那些生存依赖于F1F0ATP合酶正常功能的细 菌尤其有效。与任何现有理论不同(Without being bound to any theory)，认为本发明化合物的活性依赖于对F1F0ATP合酶的抑制， 具体是对F1F0ATP合酶F0复合体的抑制，更具体是对F1F0ATP合 酶F0复合体中从A亚基Arg186到C亚基Glu61的质子转移的抑制， 从而通过降低细菌细胞的ATP水平来杀死细菌。使用上述任何筛选 方法鉴别出的化合物对革兰氏阳性菌特别有效，尤其是分枝杆菌， 特别对由以下细菌引起的感染最为有效，非洲分枝杆菌(M. africanum)、鸟分枝杆菌(M.avium)、牛分枝杆菌(M.bovis)、牛分枝 杆菌-BCG(M.bovis-BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、偶然分枝杆菌 (M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)、麻风杆菌(M.leprea)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)和偶发分枝杆菌(M.ranae) 引起的感染。
在上文和下文中，化合物能够治疗细菌感染都指的是该化合物 能够治疗由一种或更多菌株引起的感染。但是，当用DARQ J作为 抗微生物化合物时，此处的“抗微生物”是指化合物能够治疗一种 或更多菌株引起的感染，只要所述菌株不是分枝杆菌。
可用本发明的化合物治疗的感染包括如(但不仅限于)中枢神经系 统感染、外耳感染、中耳感染例如急性分泌性中耳炎、硬脑膜窦(cranial sinuses)感染、眼部感染、口腔感染如牙齿、牙龈和粘膜感染、上呼 吸道感染、下呼吸道感染、泌尿生殖器感染、胃肠感染、妇产科感 染、败血病、骨骼与关节感染、皮肤与皮肤结构感染、细菌性心内 膜炎、烧伤、手术后的感染预防和免疫抑制病人例如癌症化疗病人 和器官移植病人的感染预防。
本发明也提供了治疗结核患者的方法，包括给予患者能够与atpE 蛋白相互作用的药物。
药用组合物
本发明也提供了药用组合物，包含能在细胞中与atpE蛋白相互 作用的药物和药学上可接受的载体。
这种药物可被制成包含该药物和药学上可接受载体或稀释剂的 组合物。该药物的形式可以为生理条件下的功能衍生物，例如酯或 盐，如酸加成盐或碱金属盐，或者N或S氧化物。可根据任何合适 的给药途径和方法制备组合物。药学上可接受的载体或稀释剂包括 那些通过以下方式给药的制剂中使用的物质：口服给药、直肠给药、 鼻腔给药、吸入给药、局部给药(包括口腔和舌下)、阴道给药或非胃 肠道给药(包括皮下、静脉内、肌肉内、皮内、鞘内、硬膜外)。当 然，要依据目的给药途径来选择载体或稀释药，目的给药途径可依 赖于药物及治疗目的。可方便的将制剂制成单位剂量的形式并可使 用制药学领域熟知的任何方法来进行制备。这些方法的步骤包括将 由一种或多种附加成分组成的载体和活性成分联系起来。一般来说， 将活性成分与液体载体(或者是细碎的固体载体，或者同时使用两者) 均匀并紧密的相联来制备制剂，然后如果必要就对产品进行定形。
对固体组合物来说，常用的无毒固体载体包括如药物级别的甘 露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、 滑石、蔗糖、葡萄糖、碳酸镁等。可使用如聚亚烷基二醇、乙酰基 甘油三酯等载体将上文定义的活性化合物制成栓剂。例如可将上文 定义的活性化合物和任选的药学辅料溶解或分散在载体中(如水、葡 聚糖生理盐水溶液、甘油、乙醇等)形成溶液或悬液，如此制备液体 药用组合物。如果需要，待给予的药物组合物也可包含微小量的无 毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如醋酸钠、失水 山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、油酸三乙醇胺等。本领域技 术人员已知(或容易理解)制备这些剂型的实际方法，参见如Gennaro et al.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company， Easton，Pennsylvania，18th Edition，1990。
任何情况下，待给予的组合物或制剂所含有的活性化合物的剂 量，都足以有效减轻待治疗受试者的症状。
如本领域技术人员所熟知，确定本发明化合物的精确给药剂量 和给药频率的依据是所用的具体化合物、具体的治疗病症、治疗病 症的严重性(severity)、年龄、体重、性别、饮食、治疗时间和病人 的总体生理条件、治疗模式，以及病人可能采用的其它药物治疗。 另外，每天的有效剂量显然可根据治疗受试者的反应和/或开具本发 明化合物处方的医生的评价来加以减少和增加。
可以制备的剂型或组合物中含有的活性成分量范围可以为0.25- 95％，其余是无毒载体。根据给药模式，药用组合物中活性成分的 含量优选为0.05-99％(重量)，更优选为0.1-70％，同时药学上可接受 的载体含量为1-99.95％，更优选为30-99.9％，所有百分比基数均为 组合物总量。
可使用任何常用的赋形剂来制备用以通过口服给药的药学上可 接受的无毒组合物，常用的赋形剂例如药物级别的甘露醇、乳糖、 纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、化石、蔗糖、 葡萄糖、碳酸镁等。这种组合物的剂型为溶液、混悬液、片剂、丸 剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等。这些组合物可含有1-95％的活性成 分，优选含2-50％，最优选含5-8％。
非胃肠道给药的一般特征为通过注射给药，通过皮下、肌内或 静脉内进行注射。注射剂可被制成常规形式，可以是溶液或混悬液 形式、适于注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或者乳化液形 式。合适的赋形剂包括如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外 如果需要待给药的药物组合物也可包含微小量的无毒辅助物质，如 润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如例如醋酸钠、失水山梨醇单月 桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、油酸三乙醇胺等。
这些非胃肠道给药组合物中活性成分的含量高度依赖于活性成 分的具体特性，化合物的活性和受试者的需要。不过溶液中活性成 分适用含量为0.1％-10％，并且如果组合物为固体，随后要稀释到上 述浓度的话，活性成分的含量可以更高。优选的，组合物溶液中含 有0.2-2％的活性药物。
最后，本发明提供了产品，包括包装和药物，其中(a)药物在细 胞中与atpE蛋白相互作用，并且(b)包装中含有说明如何使用该药物 治疗细菌感染者的标签，特别是将该药物用作抗分枝杆菌药物。
所有本文中的“标准方法”、“标准方案”和“标准程序”，当在 分子生物学技术背景下使用时，都指常规实验指南中的方案和程序， 例如Current Protocols in Molecular Biology，editors F.Ausubel et al.， John Wiley and Sons，Inc.1994，or Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A laboratory manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989。
参考下文的实验细节可更好的理解本发明，不过本领域技术人 员显然会认识到这些实验细节仅用于阐述本发明，同时在下文权利 要求书中将更全面的定义本发明。另外贯穿本文引用了多个出版物， 这些出版物的公开内容通过引用结合到本文，以更全面的阐述本发 明所属的技术内容。
实验描述
使用耻垢分枝杆菌为替代物，我们发现了一系列具有体外抗几 种分枝杆菌活性的DARQ(11)。目前，DARQ系列中有20种分子对 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv的最小抑制浓度 (MIC)小于0.5μg/ml，其中通过小鼠体内模型确认有三种分子具有 抗分枝杆菌活性。
DARQ在结构上和机制上都与氟喹诺酮(包括甲氧基喹诺酮)显 著不同，并且与其它喹啉类物质也不同，其中包括甲氟喹及其类似 物，4-甲基喹啉和4-喹啉基腙(12-16)。DARQ与其它喹诺酮或喹啉 类物质的一个主要的结构上的不同是DARQ类物质携带的功能侧链 (3’)的特异性。另外，没有与现有化学物质的对分枝杆菌的交叉抗性， 这说明了作用机制也不同。
DARQ的先导化合物，这里指J或者DARQ J(图1)，我们发现 它在体外具有独特的强效和选择性的抗分枝杆菌活性谱(表1)。它对 实验室菌株H37Rv和六个完全敏感分离菌株的中值MIC为0.060 μg/ml，而利福平为1.00μg/ml。J化合物在体外对耐一线与二线TB 药的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)临床分离菌株也表现出相似的效 果，所述一线TB药为利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，二 线TB药为莫西沙星具有抗性。J化合物对八个具有异烟肼抗性的临 床分离菌株的MIC为0.010μg/ml。J化合物没有与现用抗TB药物 的交叉抗药性，这说明J可能保留有抗MDR-TB菌株的活性。事实 上，使用BACTECTM培养系统，将MCR-TB菌株暴露在固定浓度的 J化合物下，清楚地看见了对细菌生长的剂量依赖性抑制作用。在 MDR-TB的30个分离菌株里，有13株(43％)对0.100μg/ml的J化 合物敏感，另17株(57％)对0.010μg/ml的J化合物敏感。当使用 BACTECTM系统进行测试时，在另外10株完全药物敏感的菌株中， 只有一株表现出对J有类似的高敏感性(MIC小于0.010μg/ml)，而 所有菌株对0.100μg/ml的J化合物都具有敏感性。
其强效活性在其它分枝杆菌上也被证明，包括牛结核分枝杆菌 和堪萨斯分枝杆菌，以及对许多抗TB药物具有天然抗性并参与机 会感染的菌，例如鸟分枝杆菌复合体(MAC)、脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abcessus)、偶发分枝杆菌和海鱼分枝杆菌。
令人惊奇的是，J的活性表现出对分枝杆菌的特异性。J对分枝 杆菌的近缘细菌种几乎没有活性，这些菌例如棒状杆菌 (Corynebacterium)(MIC 4.00μg/ml)和诺卡氏菌(Nocardia)(MIC＞ 4.00μg/ml)，并且对其它生物没有活性，这包括革兰氏阳性菌肺炎 链球菌、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林抗性菌株)(MIC＞32μg/ml) 和粪肠球菌，以及革兰氏阴性菌大肠杆菌、流感嗜血杆菌和幽门螺 杆菌。
将处于对数生长期的结核分枝杆菌用100xMIC浓度的J化合 物处理，12d后细菌计数结果减少3个数量级(103log reduction)，这 说明J在体外具有杀菌活性。J对静止期的结核杆菌的作用目前尚未 研究。
突变株筛选，交叉抗药性和推定的药物靶点
我们致力于通过考查分枝杆菌抗性，来鉴别出分子药物靶点并 提出作用机制。在体外使用抑制浓度的J化合物选择出结核分枝杆 菌和耻垢分枝杆菌的抗性突变株，目的是：
---确定分枝杆菌中抗性突变株的比例(以利福平作为对照)
---评估抗性突变株的抗性模式(包括对喹诺酮类药的交叉/非交叉 抗性)
---考查作用机制
筛选实验中，结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中对J敏感性降低 的突变株比例分别为，MICx4浓度下5x10-7和2x10-8，MICx8 浓度下5x10-8和1x10-8(支持在线数据(supporting online text))。结 核分枝杆菌中的突变株比例与那些对利福平具有抗性的突变株所占 比例(10-7-10-8)相当，这说明几乎不存在对J的天然抗性。另外，对J 具有抗性的结核分枝杆菌菌株对抗TB药物异烟肼、利福平、链霉 素、阿米卡星、乙胺丁醇和莫西沙星的敏感性没有变化。对结核分 枝杆菌和耻垢分枝杆菌中J敏感性降低的突变株的进一步研究表明， 在DNA回旋酶的gyrA和gyrB区域中没有突变，在典型产生喹诺 酮抗性的序列上也没有突变。这证明J化合物的分子靶点与氟喹诺 酮的靶点不同。
一种确定J的分子靶点并推断作用机制的方法是，在结核分枝 杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性菌株中，鉴别出抗性赋予突变并 加以对比。对结核分枝杆菌抗性菌株BK12、两个耻垢分枝杆菌抗性 菌株R09和R10，以及亲代耻垢分枝杆菌的基因组测序已接近完成。 通过对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性菌株的基因组序 列进行对比分析，我们鉴别出了抗性赋予突变(图2)。我们的结果表 明，与相应亲代野生型相比，在所有三个独立突变株中都发挥作用 的唯一基因编码atpE(ATP合酶F0亚基的一部分)。这提示突变株对 J的抗性由atpE引起，说明J抑制了新的结核分枝杆菌靶点----ATP 合酶的质子泵。
进行了互补研究以说明突变atpE引起对J的抗性，直接推断出 atpE基因产物就是J对分枝杆菌的作用靶点。假设已知ATP合酶操 纵子的所有基因都必须以协同方式表达，即所有编码F0部分的基因 都必须从同一位置表达，我们就扩增了耻垢分枝杆菌抗性突变株 (D32V)操纵子的F0部分，并通过PCR选择出没有额外突变的克隆。 用含有如此选出的突变F0片段的质粒转化野生型耻垢分枝杆菌。所 得细胞获得了对J的抗性，其MIC几乎与耻垢分枝杆菌抗性突变株 R09(D32V)相同。另外，当从该转化体中重新分离出质粒并对atpE 基因进行测序后，发现它具有保留的突变等位基因(D32V)。
使用Roche公司的ATP Bioluminescence Luciferase Assay Kit HS II试剂盒测量J对分枝杆菌中存在的总细胞ATP量的作用，进一步 证实了DARQ J对结核分枝杆菌中ATP生成的影响。该实验的依据 是，在526nm波长下可以测量由ATP驱动的从D-虫萤光素到氧化 虫萤光素的转化情况。
简要来说，在野生结核分枝杆菌和突变株中检测了DARQ J对 总ATP的作用。使用DCCD(已知它是ATP合酶的抑制剂)作为阳性 对照，使用异烟肼(它抑制细胞壁某些成分的生物合成，但是对ATP 生成没有作用)作为阴性对照。
如图3所示，使用DARQ J处理野生型结核分枝杆菌，在这些 细菌中引起了剂量依赖性的ATP生产下降。与之对比，异烟肼则对 ATP生成没有作用。如上文所述，将这些细菌暴露在高浓度的DARQ J下得到了具有二芳基喹啉抗性的结核分枝杆菌突变株。即使用100 倍MIC浓度的J处理这些结核分枝杆菌突变株，它们的ATP生成也 没有任何下降。与之对比，DCCD则能够阻遏这些突变株中ATP的 生成，这提示DARQ J和DCCD在ATP合酶上具有不同的结合口袋。
DARQ J结合区域的计算机建模和鉴别
为进一步探索DCCD和DARQ J的不同作用机制，分别建立了 野生结核分枝杆菌和DARQ J抗性突变株的ATP合酶的计算机3D 模型。通过建立公开氨基酸序列P63691和AJ865377的3D模型， 对表4和表5中的原子坐标进行了计算。发现DARQ J的实际结合 位点位于A亚基和C亚基的接触区域，更具体来说是在A亚基的“Arg 210”和C亚基的“Glu 61”周围，如表3、4或5所示。这与上文 中对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性突变株的抗性赋予 突变筛选结果完全一致。
该模型的依据是对ATP酶结构中A-和C-螺旋的相对位置、氨 基酸骨架和侧链方向进行最小内在应力计算优化的结果。从先前公 开的不同生物的常规螺旋几何构型出发[E-Coli PDB entry code 1C17- V.K.Rastogi and M.E.Girvin，Nature，402，263-268(1999)]，通过若干 分子动力学模拟循环和分子力学弛豫方法得到了几何构型。使用根 据MMFF94s[Halgren，T.A.(1996)，J.Comput.Chem.，17，490-519]确 定的力场参数(forcefield parameterization)也进行了分子动力学和弛豫 几何分析。事实上可以使用任何分子动力学分析软件[Berendsen， H.J.C.，van der Spoel，D.and van Drunen，R.，Comp.Phys.Comm.91 (1995)，43-56；Lindahl，E.，Hess，B.and van der Spoel，D.，J.Mol.Mod. 7(2001)306-317.]，然后进行适当的几何优化[J.W.Ponder and F.M. Richards，J.Comput.Chem.，8，1016-1024(1987).]。
根据提出的抑制模式和生物试验中出现的抗性诱导突变位点， 表3、4和5中的计算坐标包含进了部分的预测结构(半径30埃范围)， 该结构在这些酶中被认为与MTB ATP酶活性抑制有关的区域的结 构。
讨论
DARQ J是一类新型抗TB化学药物的一员，它具有与参考化合 物相同或更低的MIC。其抗菌谱的独特之处在于，对分枝杆菌具有 特异性，包括在人类致病菌中重要的非典型分枝杆菌；MAC，堪萨 斯分枝杆菌(M.kansasii)和快速生长的偶发分枝杆菌及脓肿分枝 杆菌(M.abscessus)。这种特异性抗分枝杆菌谱与异烟肼(它对MAC 没有作用)不同。J化合物的临床用途将主要用于定向治疗TB和分 枝杆菌感染。与具有广谱抗菌能力的抗生素相比，J不能抑制非分枝 杆菌微生物的特性会产生更小的选择压力，也降低了其它种类细菌 产生抗药性的风险(9)。
J化物的靶点和作用机制与其它抗TB药物不同。不同细菌和 真核生物ATP合酶序列间的对比，尤其是ATP酶复合体F0亚基C 链序列的对比，以及野生型和突变型结核分枝杆菌的ATP合酶的3D 模型，共同提供了J抗菌谱特异性的基本原理，也在较小程度上提 供了安全性。
对建立的分枝杆菌ATP酶模型的动力学分析表明，这些结构中 的A亚基和C亚基的接触区域上(在A亚基的“Arg 210”和C亚基 的“Glu 61”周围)存在一个洞穴(根据表3的原子坐标，即为结合位 点)。表4和表5提供了两个研究变异体中此位点周围的原子坐标， 以及它们的平均位置。通过禁止这两个氨基酸相互作用，DARQ J 抑制剂能够干扰涉及到这两个氨基酸的正常质子转移步骤。可以从 预测的结合位点的不对称性来理解DARQ J的立体特异性；活性手 性对映体也理想的容纳于此洞穴，而该化合物的其它形式与变异ATP 酶的契合度降低。
我们在这里得出的结合位点在ATP酶系统上所处位置与DCCD 的结合位点所处位置完全不同。根据牛ATP酶结晶″1E79″(参见 C.Gibbons，M.G.Montgomery，A.G.W.Leslie，J.E.Walker， Nat.Struct.Biol.，7，1055(2000))，DARQ结合位点位于酶的膜部分，而 DCCD结合位点在胞内约90埃。因此可参与DCCD类型MTB ATP 酶抑制的原子不在本文的结合位点(它仅跨越酶的膜部分)原子坐标表 所列区域之内，反之，酶中涉及到DARQ J抑制模式的部分也不存 在于报道的“1E79”结构中(它仅出现于胞内部分)。这种结合位点 上的差异可以解释结核分枝杆菌在体外ATP生成试验中的不同反 应。
但是更早的关于DCCD对线粒体ATP酶作用的研究推测，在该 酶F0区域亲脂性(lipophyllic)环境中的一个酸性氨基酸周围存在 另一个结合位点，如Sebald W，Machleidt W，Wachter E.，Proc Natl Acad Sci U S A.1980Feb；77(2)：785-789。可以认为这个线粒体ATP 酶上的结合位点与本文描述的分枝杆菌位点类似。
同时，新的作用机制也确保，目前流行的对现有治疗措施具有 抗性突变的TB菌株对J化合物没有交叉抗药性。从我们的体外研究 可清楚地看出，J化合物至少对MDR-TB分离菌株具有高效抗菌作 用，甚至对那些对四种药物都具有抗药性的菌株也有作用，其作用 程度与对结核分枝杆菌的野生型全敏感(pan-susceptible)菌株的作 用程度相同。这一发现具有重要意义，因为它清楚地说明J与现有 的抗TB药物间没有交叉抗药性。如果对ATP酶膜部分中的结合口 袋进行进一步鉴别，则该研究的结果将有助于进一步开发新型抗菌 化合物，特别是开发以这些生物体中ATP合成为靶点的抗分枝杆菌 化合物。
参考文献
1.Global Alliance for TB Drug Development，Developing a faster TB cure(2004；http://www.tballiance.org)(TB药物开发全球联盟， 快速TB疗法的开发).
2.E.L.Corbett et al.，Arch.Intern.Med.163，1009(2003).
3.UNAIDS，AIDS epidemic update 2003(2003； www.unaids.org/Unaids/EN/Resources).
4.World Health Organization，Tuberculosis(2004； http://www.who.int/health_topics/tuberculosis/en/)(世卫组织，结核 病).
5.R.J.O′Brien，P.P.Nunn，Am.J.Respir.Crit.Care Med.163，1055 (2001).
6.World Health Organization，Tuberculosis Fact Sheet No 104(2004； http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fsl04/en/)(世卫组织，结 核病事实报告第104号).
7.A.J.Claxton，J.Cramer，C.Pierce，Clin.Ther.23，1296(2001).
8.N.Lounis et al.，Antimicrob.Agents Chemother.45，3482(2001).
9.A.S.Ginsburg，J.H.Grosset，W.R.Bishai，Lancet Infect.Dis.3， 432(2003).
10.C.K.Stover et al.，Nature 405，962(2000).
11.Guillemont J，Emile G，Patent(国际公开号WO 2004/011436.国 际公开日2004年2月5日).
12.Barbachyn MR，Brickner SJ，Patent(国际公开号：WO 93/09103， 国际公开日：1993年5月13日，国际申请号：PCT/US92/08267， 国际申请日：1992).
13.R.Jain，B.Vaitilingam，A.Nayyar，P.B.Palde，Bioorg.Med. Chem.Lett.13，1051(2003).
14.C.M.Kunin，W.Y.Ellis，Antimicrob.Agents Chemother.44，848 (2000).
15.L.Savini，L.Chiasserini，A.Gaeta，C.Pellerano，Bioorg.Med Chem 10，2193(2002).
16.S.Vangapandu，M.Jain，R.Jain，S.Kaur，P.P.Singh，Bioorg.Med. Chem.12，2501(2004).
17.K.Andries et al.，Science 307，223(2005).
表1.
表2
序列 P63691＝SEQ ID No.1＝MYCTUB C-亚单位，wt
序列 AJ865377＝SEQ ID No.2＝MYCTUB C-亚单位，突变型
序列 P63654＝SEQ ID No.11＝MYCTUB A-亚单位，wt和突变 型
基于表3的原子坐标的结合位点周围的氨基酸
##C-亚单位 1 ##-A链
Ala21、Gly25
##C-亚单位 2 ##-K链
Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65
##C-亚单位 3 ##-L链
Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、 Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、 Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65.
## A 亚单位 ##-M 链
Ser182、Leu183、Leu185、Arg186(在表3中为Ser 206-Leu 207-Leu 209 和Arg 210)
表3
表3-续
表3-续
表3-续
表3-续
表4
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表4-续
表5
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表5-续
表6
表6-续
表6-续
表6-续
表6-续
表6-续
表6-续
表6-续
表6-续
表7
表7-续
表7-续
表7-续
表7-续
表7-续
表7-续
表7-续
表7-续
序列表
<110>Janssen Pharmaceutica N.V.
<120>Mutant atpE proteins
<130>PRD2323p
<150>EP 04104720.0
<151>2004-09-28
<150>US 60/620500
<151>2004-10-20
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>81
<212>PRT
<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
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20 25 30
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35 40 45
Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Ala Tyr
50 55 60
Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe Ala Thr Pro Val
65 70 75 80
Lys
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50 55 60
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Lys
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Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu
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<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)
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cggcaacccg aggcgcaagg gcggctgttc acaccgttct tcatcaccgt cggtttggtt 180
gaggcggcat acttcatcaa cctggcgttt atggcgctgt tcgtcttcgc tacacccgtc 240
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<210>12
<211>250
<212>PRT
<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400>12
Met Thr Glu Thr Ile Leu Ala Ala Gln Ile Glu Val Gly Glu His His
1 5 10 15
Thr Ala Thr Trp Leu Gly Met Thr Val Asn Thr Asp Thr Val Leu Ser
20 25 30
Thr Ala Ile Ala Gly Leu Ile Val Ile Ala Leu Ala Phe Tyr Leu Arg
35 40 45
Ala Lys Val Thr Ser Thr Asp Val Pro Gly Gly Val Gln Leu Phe Phe
50 55 60
Glu Ala Ile Thr Ile Gln Met Arg Asn Gln Val Glu Ser Ala Ile Gly
65 70 75 80
Met Arg Ile Ala Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Phe Val
85 90 95
Phe Ile Leu Ile Ser Asn Trp Leu Ala Val Leu Pro Val Gln Tyr Thr
100 105 110
Asp Lys His Gly His Thr Thr Glu Leu Leu Lys Ser Ala Ala Ala Asp
115 120 125
Ile Asn Tyr Val Leu Ala Leu Ala Leu Phe Val Phe Val Cys Tyr His
130 135 140
Thr Ala Gly Ile Trp Arg Arg Gly Ile Val Gly His Pro Ile Lys Leu
145 150 155 160
Leu Lys Gly His Val Thr Leu Leu Ala Pro Ile Asn Leu Val Glu Glu
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195 200 205
Met Trp Ala Pro Asn Ala Ile Trp Lys Ala Phe Asp Leu Phe Val Gly
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Ala Ile Gln Ala Phe Ile Phe Ala Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Phe Ser
225 230 235 240
Gln Ala Met Glu Leu Glu Glu Glu His His
245 250