一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和 应用 【技术领域】
本发明涉及一种试剂盒， 具体地说关于一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒 及其检测方法和应用 【背景技术】
2005 年美国卫生研究院、 癌症研究院、 疾控中心等多家单位做了一个年度报告， “认为人类在抗癌大战中是失败” ， 也就是说癌症死亡率没有降低， 其列举出造成抗癌大战 失败的几个因素是 ： 1、 肿瘤细胞异质性 ； 2、 肿瘤细胞耐药性 ； 3、 抗癌药物设计思路不完善 等。同时， 该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在研究中发现， 导致 癌症死亡率不降的另二个重要原因是 ： 1、 不能做到真正的早期诊断 ； 2、 转移的病理机制不 清楚。依照传统的医学影像及和其它生化 ( 如蛋白标记物 ) 指标来诊断癌症， 认为占位性 癌块在 2 公分下是属于早期癌症的诊断 ( 更小些有时无症状体征 )， 这一临床概念值得认 真讨论。影像医学的 2 公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的， 从细胞学角度， 1 公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞， 2 公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2 亿个肿 瘤细胞， 从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成 2 公分的癌块， 其病理演变过程相当长， 可 能是一年或两年、 甚至三年以上， 很难证实的是在这个过程中， 肿块是癌症唯一的发生地和 单独的病灶。临床上已证实 ： 一旦形成肿块的同时， 其他癌细胞通过不同途径迁移到其他 部位克隆生长 ； 一旦切除原发灶后， 其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以 2 公分以下的肿块大小来界定早期与否， 不够严谨 ( 有些病例， 在发现原发病灶 时， 同时发现转移病灶， 不在我们表述的内容中 )， 这时已经是晚期了， 这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。
血小板衍生内皮细胞生长因子 (platelet derived endothelial cell growth factor， PD-ECGF) 最早从新鲜血小板溶解物中提取， 其后证实与胸苷磷酸化酶 (TP) 是同一 种物质， 其基因位于染色体 22q13″。PD-ECGF 在肝癌组织中表达率达 67.8％～ 70.5％， 高 于癌周正常肝组织， 且在 TNM 高分期组肝癌中表达高于 TNM 低分期组 ； 伴有门静脉癌栓的肝 细胞癌中， PD-ECGF 表达水平高于不伴有门静脉癌栓者， 提示 PD-ECGF 可能与肝癌生长和侵 袭转移中的血管生成有关， PD-ECGF 水平可作为肝癌转移复发的预测指标。Volm 等用免疫 组化方法研究了 168 例非小细胞肺癌组织中 PD-ECGF、 bFGF 和 VEGF 的表达， 发现 3 个指标 均阴性的患者中 43％有淋巴结转移， 而 3 个指标均阳性的患者中 77％发生淋巴结转移， 两 组存在显著差异。在 mRNA 水平、 蛋白质表达和酶活性分析中都证实了 PD-ECGF 在膀胱癌等 肿瘤的恶性进展中起着重要作用。PD-ECGFmRNA 表达越高， 局部浸润范围越广， 越容易出现 预后越差。 淋巴结或远处转移，
随着分子生物技术日益完善， 功能基因组学， 癌症基因组学等研究的深入展开， 至 今， 我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断， 在癌变前期或癌细胞形成 ( 单克隆 时 ) 就能做到早期预测诊断。采用核酸原位杂交技术检测 PD-ECGF 基因， 对癌症的早期基因水平的转移诊断有非常重要的临床意义。PD-ECGF( 血小板衍生内皮细胞生长因子 ) 基 因， 基因序列号 ： NM_001014440， 970bp， mRNA.22q13.33″， CDS ： 138… 899bp。
原位杂交技术 (in situ hybridization) 是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来， 以标记的核酸分子为探针， 在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。 其原理是使含 有特异序列、 经过标记的核酸单链 ( 即探针 )， 在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交， 再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细 胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。 【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测 试剂盒的用途。
本发明的再一的目的是， 提供一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒。
本发明的另一的目的是， 提供一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测方法。
为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、 复发疾病药 物中的应用， 所述的试剂盒包括杂交探针、 标记物， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所 示。 所述的癌症是肝癌或膀胱癌。
所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示的 RNA 序列。
所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 35 125
所述的放射性核素选自 3H、 S、 I 或 32P 中的一种。
所述的非放射性标记物选自生物素、 地高辛、 碱性磷酸酶、 辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
所述的试剂盒还包括增效剂， 所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物， 其中所述的杂 交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测方法， 该方法包括以下步骤 ：
a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测 RNA 接触， 形成杂交复合体 ；
b、 检测 a 步骤得到的杂交复合体。
本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针， 杂交液， 显色剂， 增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知， 具体操作步骤是标本处理、 预杂交、 杂 交、 免疫组化染色、 镜下进行定量分析、 结果报告， 其中杂交的具体步骤包括 ：
仪器操作 ：
1). 将待测标本放入反应槽中 ；
2). 仪器自动弃去液体， 自动加消化液 ；
3). 仪器自动弃去液体， 自动后固定 ；
4). 仪器自动弃去液体， 自动预杂交 (42℃ ) ；
5). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
6). 仪器自动弃去液体， 自动杂交 (42℃ ) ；
7). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
8). 仪器自动弃去液体， 自动与 DIG 抗体培养 ( 室温 ) ；
9). 仪器自动弃去液体， 自动清洗， 显色 ；
10). 取出封片镜检。
本发明优点在于 ：
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、 特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、 简单， 能在区级以上医院普遍使用和推广。
3、 本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物， 以及影像医学检查有 显著不同。本发明可以在基因水平上检测 PD-ECGF 基因异常表达， 在影像医学检查未发现 占位性癌病灶复发之前， 癌症生化指标未产生异常之前， 亦未形成肿瘤之前， 能及早做到以 上基因表达异常的信息采集， 给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及 早预测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、 早期预防、 早期治疗， 有可能从源头上彻底根 治癌症恶疾。 【附图说明】
图 1 是本发明实施例中肝癌转移病人 PD-ECGF 基因表达图片。
图 2 是本发明实施例中膀胱癌转移病人 PD-ECGF 基因表达图片。
图 3 是本发明实施例中正常人 PD-ECGF 基因表达图片。 【具体实施方式】
下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。
实施例 1
一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物、 增效剂， 其中， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体 和标本组成如下 ：
消化液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
保护液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
预杂交液 1300μl/ 管 2管/盒 无色透明液体
正义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
反义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
封闭液 1000μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
碱性磷酸酶抗体 1μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
显色剂 A 175μl/ 管 1管/盒 黄色液体
显色剂 B 320μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
缓冲液 I 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 II 10x 80ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体缓冲液 III 10x 20m/ 瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体 缓冲液 IV 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体 固定液 90ml/ 瓶 1瓶/盒 无色透明液体 阳性对照标本 6 片 / 盒 上述试剂成分说明 ： ( 所有试剂购自 SIGMA) 1、 消化液 ： 20mg/ml 蛋白酶 K， 100mg 蛋白酶 K， 加 DEPC-H2O 5ml ； 2、 保护液 ： 0.2g 的 glycine 加入 1ml 的 1× 缓冲液 I ； 3、 预杂交液 ： 1× 缓冲液 II 7.5ml 50×D 3ml 10mg/ml yest t-RNA 750ul 11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0.04M EDTA 3ml 50％ formamide 15ml 4、 封闭液 ： 0.03g 的 bloking( 购买自罗氏公司 ) 加入 1ml 1× 缓冲液 III ； 5、 10x 缓冲液 I ： (PH7.1-7.4)NaCl 80g
Na2HPO4.12H2O 360g
KCl 2g
KH2PO42g
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
6、 10x 缓冲液 II ： (PH7.0)
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
HCl 几滴
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
7、 缓冲液 III ： (PH7.9)
Tris 121.1g
NaCl 87.66g
HCl 60ml 左右
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
8、 缓冲液 IV ：
1M Tris-HCl(PH9.5) ： Tirs 121.1g 加 HCl 3ml 左右， 加水 900ml， 调 PH 至 9.5， 加 水至 1l， 并高压灭菌 ；
1M NaCl ： NaCl 58.44 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
0.5M MgCl2 ： 101.65g MgCl2.6H2O 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
9、 固定液 ： 多聚甲醛 40g 加 1× 缓冲液 I 至 1l， 稍加热 ( 约 50-60 度 ) 搅拌至溶 解；
10、 显色剂 A ： NBT 1g 加 70％ DMF11.44ml ；
11、 显色剂 B ： BCIP 1g 加 100％ DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
实施例 2
一种 PD-ECGF 基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用
一、 标本处理
1、 用 10ml 的离心管， 装 4.5ml 淋巴细胞分离液， 再将 3ml 抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液 ( 血∶淋巴细胞分离液＝ 1 ∶ 1.5) 的离心管中， 2000r/min 离心 10min ；
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中， 再在此管中加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混 匀， 1500g/min 离心 10min ；
3、 弃上清 . 沉淀加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混匀， 1500g/min 离心 10min ；
4、 弃上清， 并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。 再将沉淀制成悬液， 滴在玻片上 推片， 自然干燥。( 有条件的医院可以用制片机制片。)3ml 血， 可以做 4 张片子 ；
5、 用 40ml 4％固定液， 在玻璃缸中， 固定 30min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min。每缸 可以放 16 片 ；
6、 标本可保存在 -20℃， 或继续做实验。
二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度 1、 将 10× 缓冲液 I 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 I ；
2、 将 20× 缓冲液 II 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 2× 缓冲液 II ；
按 1 ∶ 100 稀释成 0.2× 缓冲液 II ； 按 1 ∶ 200 稀释成 0.1× 缓冲液 II ；
3、 将 10× 缓冲液 III 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 III ；
4、 10× 缓冲液 IV 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 × 缓冲液 IV( 取 1#， 2#， 3# 各 10ml， 加水至 100ml 既可 )。
三、 实验步骤 ：
1、 取每位待检者标本两张， ( 另外两张留作复查用 ) 及阳性对照标本两张 ( 每次 实验做一对阳性对照 ) ；
2、 在 玻 璃 缸 里 加 消 化 液 ( 消 化 液 100ul 加 1× 缓 冲 液 199.9ml， 即为使用浓 度 )20ml。37℃水浴预热 10 分钟。放进 16 张玻片， 37℃处理 12min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min ；
3、 用 0.2％的保护液 ( 保护液 1ml 加 1× 缓冲液 I99ml 即为使用浓度 ) 洗 10min， 三蒸水洗 5min， 以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥 ；
4、 将玻片放入保湿盒内， 加预杂交液 20ul/ 片 . 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 3h 以上 ；
5、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内， 用 70 ％， 90 ％， 95 ％的乙醇各洗 2min， 自然干燥 ；
6、 将玻片放入保湿盒内， 每位病人标本两张， 一张加正义杂交液 20ul/ 片， 另一张 加反义杂交液 20ul/ 片， 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 16-24h ；
7、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内
在 42℃恒温水浴箱中用 2× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.2× 缓冲液 II 洗一次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.1× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min ；
8、 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 取出玻片， 自然干燥 ；
9、 将 玻 片 放 入 保 湿 盒 内， 加 0.5 ％ l 封 闭 液 (1ml 封 闭 液 加 5ml1× 缓 冲 液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒， 在室温下作用 30min ；
10、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 自然干燥 ；
11、 将玻片放入保湿盒内， 加碱性磷酸酶抗体 ( 加入 1.8ml 1× 缓冲液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒在室温下作用 30min ；
12、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 3 次， 每次 15min ；
13、 1× 缓冲液 IV 洗 2min， 加显色剂 ( 显色剂 A73.3ul， 显色剂 B157.5ul 加到 30ml 1× 缓冲液 IV 中， 混匀 )， 室温避光 12h 以上 ；
14、 用三蒸水洗 5min， 自然干燥， ( 用甘油加 10％的 1× 缓冲液 I 混匀 ) 封片镜检。
四、 结果判断
在光镜下计数 100-300 个细胞， 计算染上紫色细胞的百分比。
阳性对照标本加反义杂交液的应该 80％以上染上紫色。
所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
地高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针， 不但探针的具有生物素标记优点， 还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点 )， 将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测 RNA 核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 在光镜下观察 mRNA 的存在和定位， 根据染色的细胞数， 判断目的基因的表达量。 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术， 该方法通过检测底物细胞中的 PD-ECGF 基因表达量， 用来确定癌症是否发生和 / 或转移。
临床研究表明， PD-ECGF 基因具有广谱性， 因为 PD-ECGF 基因在正常人中表达低或 零表达。如果 PD-ECGF 基因高表达， 说明癌症已经复发、 转移、 扩散， 从而获得癌症的基因水 平的诊断信息。当检测到 PD-ECGF 基因的表达高于正常对照时， 则可预测受试者为癌症早 期转移或癌症转移易感者， 这些癌症包括肝癌或膀胱癌。
本发明实施例采样为 ： 肝癌转移病人 5 名， 膀胱癌转移病人 5 名， 正常对照组 5 名。 抽所有待检人的外周血 3-5 毫升 ( 分离白细胞 ) 做原位杂交。结果表示， 所有癌症转移病 人 PD-ECGF 基因有过度表达， 细胞染色 ； 正常对照组 PD-ECGF 基因不表达， 细胞无染色。具 体结果请见图 1， 图 2 和图 3。
实施例 3
用 PD-ECGF 基因试剂盒检测膀胱癌转移疾病与用 CA125 基因试剂盒检测膀胱癌转 移疾病之间平行实验。
为了科学评价上述基因各自在膀胱癌转移疾病的特异性、 敏感性、 准确性。 我们用 平行试验的方法， 同时检测上述基因的 mRNA， 检测技术采用核酸原位杂交技术， 用同一例膀 胱癌转移疾病患者的外周血， 同时检测 PD-ECGF 基因和 CA125 基因， NM-024690， ( 进行核酸 原位杂交、 免疫组化染色、 镜下记数、 结果报告等均采用实施例 1 和实施例 2 的原位杂交技 术的相同方法和步骤及试剂 )。 发现 PD-ECGF 基因在膀胱癌转移疾病病人中表达量比 CA125 基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明， PD-ECGF 基因对膀胱癌转移疾病诊断的特 异性、 敏感性、 准确性比 CA125 基因更好， 原位杂交基因表达图显示， PD-ECGF 基因的表达量 是 70％， CA125 基因的表达量是 47％。本发明的试剂盒作于膀胱癌等转移疾病诊断的指标
有非常重要的临床意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 芮屈生物技术 ( 上海 ) 有限公司
<120> 一种 PD-ECGF 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>970
<212>DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400>1
gaagcgggaa agggccacaa tggggtctgg gaggtgggcg gggcggagcg gggatgtcca
gccacgtcgc tttgttttcc cacgctagga gctaccacaa caggtgctgc gagccgtaag
cgccccccac ccgcgctatg ggctcggacg cctgggtggg cctttggcgg ccacaccggc
cccgcggccc catcgcggcg cactacggag gccccgggcc caaatacaag ctgccgccca
acaccggcta cgccctgcat gacccgtcgc ggccgcgcgc ccccgccttc accttcggcg
cgcgcttccc cacgcagcag acgacgtgcg gccccgggcc aggccacctg gtgcccgctc
gcatgaccgt gcgcggcacc gacggcgccc ccgcctactc catctacggc cgcccacgcc
gctcagcgcc cttcctcact ccgggacctg gcaggtactt cccggagcga gcggggaacg
cgacgtaccc cagtgcgcct cggcacacca ttgctccccg aaactggggt gtccaggcgg
aacagcagag cccaggtccc gcggcctata cggtgccctc gctcttgggt ccgcgcgtca
tcggcaaagt ctccgcccca acttgctcca tctacggccg cagagcggct ggcagtttct
tcgaggacct cagcaagacc ccgggcccct gcgcctatca ggtcgtgagt ccaggggtct
acaagtcccg ggccccccag ttcacgattc tggcgcggac ttcgctcccc caagacaaca
ctcggaagcc agggcccgcg gcctacaacg tggatcagca ccggaagccc cgcggctgga
gtttcgggat ccggcactcg gactacctgg ccccgctggt gaccgacgcg gacaactgac
ccgccaggcg ggagcggccc cacacgtgtt tgcttaaagt ctgcgagtcc gcatcgtgtc
cgcctctctc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 970