禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法.pdf

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1、10申请公布号CN102004151A43申请公布日20110406CN102004151ACN102004151A21申请号201010532373522申请日20101105G01N33/569200601G01N33/531200601C12N7/0420060171申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所地址150001黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号72发明人孙建宏刘景利胡井雷杨帆王在时韩正博张从禄田国彬74专利代理机构北京君智知识产权代理事务所11305代理人郑明54发明名称禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法57摘要本发明涉及禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制。

2、备方法。本标准物质是由禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页CN102004164A1/1页21一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质，其特征在于该抗原标准物质含有灭活的禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡红细胞凝集价均7LOG2；该抗。

3、原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对禽流感病毒H5亚型、H7亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血清均呈阴性反应。2一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质的制备方法，其特征在于是通过利用由我国分离的禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒经过以下步骤1制备禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质候选物H9亚型禽流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验；2标准物质的标定、定值。3如权利要求2所述的一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质的制备方法，其特征在于制备过程中使用的冻干保护剂为用。

4、注射用水配制蔗糖浓度为100的冻干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按19比例配制。权利要求书CN102004151ACN102004164A1/12页3禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法技术领域0001本发明涉及一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法，属于兽用生物制品领域。背景技术0002英国药典BP的化学对照物质是从1963年才开始提出，由于WHO在英国建立了国际生物标准物质中心，所以英国一直沿用国际标准物质，而其本国标准物质建立较晚，至1970年后，欧洲药典问世，英国除引用国际标准物质外，也用欧洲药典标准物质，少量使用本国的标准物质。即使如此，BP1968年版。

5、及其增补本再加英国药典1968年收载的数量已超过260个，1980年版已超过300个，BP1993版收载了371个。美国药典委员会可提供约1805多种药品标准物质；欧洲药典委员会有2098种，其中生物制品标准物质有319种。0003目前，我国已研制出国家一级标准物质1262种，二级标准物质1739种，涉及钢铁、地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域。兽用生物制品的标准物质研究较滞后，目前只有192种，而兽用生物制品检验用标准物质几乎为零。0004兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪器和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。

6、。0005禽流感AI是我国重点防控的重大动物疫病，禽流感病毒AIVH9亚型流行很广泛。目前禽流感诊断、免疫监测及其疫苗免疫效果评价中应用最广泛的方法是HI试验，这是2006年我国农业部批准通过的方法，但是目前我国尚无禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验用标准物质及其相关研究的报道，国外国际动物卫生组织OIE等参考实验室也没有，严重影响了前后不同时期检测数据的一致性和不同实验室数据的可比性。近年各级实验室对禽流感标准物质的需求越来越多，特别是H9亚型和H5亚型相关的诊断试剂标准物质，因此研制禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质尤为迫切，该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进。

7、行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。0006目前我国标准物质的研制主要参考和遵循1987年7月10日国家计量局发布实施的标准物质管理办法以及一级标准物质技术规范JJG100694，但是这个技术规范是适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制，对于生物制品标准物质，特别是兽用生物制品标准物质研制目前尚无技术规范可循。因此兽用生物制品标准物质研制是一项无基础的研究，填补了该项研究领域的空白。发明内容0007本发明为制备一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质，该抗原标准物质含有灭活的禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡红细胞凝集价应7LOG2；该抗。

8、原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对禽流感病毒H5亚型、H7亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血清均呈阴性反应。说明书CN102004151ACN102004164A2/12页40008本发明的主要制备方法为00091制备禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质候选物，包括H9亚型禽流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验；2标准物质的标定、定值。0010本发明技术方案的详细阐述0011包括禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质、其制备方法和程序、其制备规程和协作标定操作规范等内容。001。

9、2本发明人在国家现行的禽流感病毒H9亚型株血凝抑制方法基础上，制定了禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质的质量标准和制备规程，研制出了禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质，并与中国兽药监察所、中国农业大学等8家单位对其效价进行了协作标定。0013一、禽流感病毒H9亚型株血凝抑制抗原标准物质的制备00141病毒毒种00151病毒毒种的来源0016本发明用于制造禽流感病毒H9亚型株血凝抑制抗原标准物质的病毒毒株为A型禽流感病毒A/CHICKEN/SHANGHAI/10/01H9N2株简称CKSH01株，由中国国家禽流感参考实验室中国哈尔滨市中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内鉴定、保管和供应。00。

10、172病毒毒种的特性00181红细胞凝集价按附录1进行鸡红细胞凝集价测定，毒种对1鸡红细胞凝集价应8LOG2。00192病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取106、107、1083个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚01ML。置37继续孵育，24H前死亡的鸡胚弃去不计，2472H内死亡的鸡胚随时取出并于28冷藏保存。至72H，测定所有鸡胚液的红细胞凝集价，凝集价4LOG2者判为感染，计算EID50中国兽药典委员会中华人民共和国兽药典二五年版三部中国农业出版社，2006，本发明以下称中国兽药典，每ML病毒含量应1075EID50。00203特异性将毒种用灭菌生理盐水稀。

11、释至103EID50/01ML与等量禽流感病毒H9亚型特异阳性血清混合，置室温中和1H后，接种10日龄SPF鸡胚10个，观察120H。在接种后24120H内不应引起特异死亡，至少有8/10接种鸡胚健活，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。00214对鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种45周龄SPF鸡10只，每只01ML。另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察14日，感染鸡和对照鸡均不应出现任何异常反应。00225纯净性按中国兽药典规定的方法应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。00236基础种子代数5代以内。00247毒种保存在70以下，保存期为60。

12、个月。00252实验动物0026所使用的SPF鸡及SPF鸡胚均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。00273禽流感病毒H9亚型株血凝抑制抗原标准物质候选物的制备说明书CN102004151ACN102004164A3/12页500281抗原的制备0029按照常规方法中国兽药典，将毒种接种SPF鸡胚，收获鸡胚液制备禽流感病毒H9亚型株血凝抑制抗原半成品，经灭活、浓缩，进行无菌检验、效价测定后，按每瓶1ML分装冻干。保护剂采用本课题研制的配方和配制方法用注射用水配制蔗糖浓度为100的冻干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按19比例配制，批号为200901。00302抗原检验00311物理性状白色或。

13、灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。00322无菌检验抽样检验，应无细菌或霉菌生长。00333效价测定按冻干时不同部位随机抽取3个样品进行HA测定，每个样品重复测2次，凝集价应均不低于7LOG2。00344特异性检验采用血凝抑制试验的方法详见附录1，用该抗原分别对禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征病毒阳性血清进行血凝抑制试验，该抗原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对其它阳性血清均呈阴性反应。00355剩余水分测定按中国兽药典剩余水分测定法进行，应低于3。00366真空度测定按中国兽药典进行，用高频电子火花仪进行检测，应符合。

14、规定。00374标准物质的定值00381定值方法红细胞凝集试验96孔微量板法进行测定。00392定值单位由68家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用同一方法进行协作标定。00403定值要求00411应对每个被测标准样品分别做六到八次独立的测定，分两个单元，每个单元做三次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。00422所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期内。00434数据处理00441汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。00452在数据。

15、服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。00463当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据。剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。00475均一性检验00481抽样数量冻干数量在500支以上时取样25支；冻干数量在500只以下时取样15支。00492测量分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。00506稳定性检验抗原在20、4、37条件下保存，并定期进行HA价测定，每一时间均要进行2次重复测量，用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算每次。

16、的平均值，该值说明书CN102004151ACN102004164A4/12页6与定值的偏差应不大于标准偏差。0051二、禽流感H9亚型血凝抑制抗原标准物质的使用0052抗原系用A型禽流感病毒A/CHICKEN/SHANGHAI/10/01H9N2株接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液，用甲醛溶液灭活，经浓缩后，加适宜稳定剂冻干制成。主要用于0053一HA试验中，校定H9亚型抗原HA效价00541标准抗原的稀释取禽流感H9亚型抗原冻干安瓿1支，启封后加1ML生理盐水恢复原量；先进行10倍、20倍、80倍稀释，然后依次进行1/320、1/400、1/480、1/560、1/640、1/720、1/80。

17、0倍稀释。00552工作抗原的稀释取禽流感H9亚型工作抗原1支，启封后加生理盐水恢复原量；先进行10倍、20倍、80倍稀释，然后依次进行320、400、480、560、640、720、800依次递增80倍进行稀释。00563红细胞凝集试验00571取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25L加入到孔中，加入生理盐水25L，再加入1鸡红细胞悬液25L。00582对照50L生理盐水25L1鸡红细胞悬液。00593在微量振荡器振荡1MIN2MIN。00604室温2426放置30MIN，判定结果。将血凝板倾斜70且静置10秒左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细。

18、胞对照孔一样者为完全不凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50凝集孔；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔。00615结论当标准抗原完全凝集孔对应的最高稀释度为46080倍，且对照孔呈时，工作抗原完全凝集孔对应的最高稀释度即为该抗原的红细胞凝集价。0062二HI试验中，校定禽流感病毒H9亚型抗体的HI效价00631抗原的稀释取禽流感H9亚型抗原冻干安瓿1支，启封后加1ML生理盐水恢复原量；先做10倍、20倍、80倍稀释。然后依次进行320、。

19、400、480、560、640倍稀释。00642红细胞凝集试验00651取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25L加入到孔中，加入生理盐水25L，再加入1鸡红细胞悬液25L。00662对照50L生理盐水25L1鸡红细胞悬液。00673在微量振荡器振荡12MIN。00684室温2426放置30分钟，判定结果。将血凝板倾斜70且静置10秒左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50凝集孔；除底部有少许红细胞外，反应孔其。

20、他部位几乎为完全凝集孔者；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔。00695结论完全凝集孔对应的最高稀释度应为46080倍。说明书CN102004151ACN102004164A5/12页700703微量血凝抑制试验007114HAU抗原的配制与验证00721抗原稀释方法0073将含有400个血凝单位的抗原先进行10倍稀释，再进行100倍稀释，即100倍稀释液为4HAU血凝素。将配制的4HAU血凝素用生理盐水进行12、13、14、15、16和17稀释。00742取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25L加入到孔中，加入生理盐水25L，再加入1鸡红细胞悬液25L。00753对照。

21、50L生理盐水25L1鸡红细胞悬液。00764以上试验做2个平行重复。00775在微量振荡器振荡12MIN。00786室温2426放置30MIN，判定结果。00797判定标准如果配制的抗原液为4HAU，则14稀释度将给出100凝集点，即反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集；如果4HAU高于4个单位，可能15或16为100凝集点；如果较低，则可能12或13为100凝集点。应根据测定结果适当调整，使抗原工作液确为4HAU。00802血清的稀释00811标准阳性血清的的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍和120倍稀释；然后进行720、840、960、1080和1200倍稀释。将稀释好的阳性。

22、血清每一稀释倍数取0025ML，分别加入到V型微量反应板对应孔中。00822阴性血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0025ML生理盐水；第1孔加入恢复原量后的阴性血清0025ML，反复抽打35次混匀；从第1孔吸取0025ML血清加入第2孔，混匀后吸取0025ML加入第3孔，如此进行对倍稀释至第6孔，从第6孔吸取0025ML弃去。00833被检血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0025ML生理盐水；第1孔加0025ML被检血清，反复抽打35次混匀；从第1孔吸取0025ML血清加入第2孔，混匀后吸取0025ML加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0025ML弃去。008433。

23、V型微量反应板上所有血清孔加入4HAU的抗原液25L。最后1排设50L生理盐水和25L生理盐水25L4HAU抗原各4个孔做对照。00854充分振荡后，室温2426下静置30分钟。每孔再加入1鸡红细胞悬液25L，充分振荡。00865室温2426放置30分钟后判定结果。将血凝板倾斜70且静置10秒左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50凝集孔；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者；反应孔底部无红细胞，。

24、整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔。00876结论0088阳性血清840倍稀释孔为，960、1080和1200倍稀释孔为、或说明书CN102004151ACN102004164A6/12页8；50L生理盐水对照孔为，25L生理盐水25L4HAU抗原孔为，此时试验方可判为成立。0089被检血清的完全不凝集孔对应的最高稀释度即为该血清的红细胞凝集抑制价。0090本发明的优点0091本发明涉及禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法。本标准物质是由禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定。

25、值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。0092实施例10093抗原制造及半成品检验00941生产用毒种制备00951毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取104稀释度，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚01ML，密封针孔，置37继续孵育，不必翻蛋。接种24H后，每8H照蛋1次，至72H，死亡的鸡胚随时取出，气室部向上直立，在28中冷却，接种后24H前死亡者弃去不用。将冷却824H的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剔除气室部的卵壳，揭去卵黄壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜勿使卵黄破。

26、裂，吸出鸡胚液尿囊液和羊水。尿囊液收集于一灭菌容器内。制备的病毒毒种经检验应符合该病毒毒种的标准见附录2禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原毒种标准。00962病毒液的制备00971接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作104稀释，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚01ML，密封针孔，置37继续孵育，不必翻蛋。00982孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋2次，将24H前死亡的鸡胚弃去，24H后死亡的鸡胚随时取出，至72H，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于28冷却8H以上。00993收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜谨防卵黄破裂，用。

27、灭菌小镊子亚压住鸡胚，用10ML无菌注射器吸取胚液。在吸取胚液前应对每个鸡胚仔细检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌中性瓶中，每更换一中性瓶时同时更换注射器，每吸取完一枚胚应将聂子在火焰上烧一下再用来接触下一枚胚。收获的鸡胚液放在28条件下保存。01003病毒液的检验01011无菌检验每瓶鸡胚液分别取样，按中国兽药典规定的方法进行检验，应无细菌或霉菌或支原体生长也无外源病毒。01022HA价测定每瓶鸡胚液分别取样，样品对鸡红细胞凝集价均7LOG2。01033灭活将上述检验合格的胚液以灭菌多层纱布滤过，混合于一个大。

28、容器内，按最终浓度为01的量加入甲醛溶液；加甲醛溶液后最好倾倒于另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后置于37灭活24H以瓶内温度达到37开始计时，期间振摇1次。灭活后将胚液置于28条件下保存。说明书CN102004151ACN102004164A7/12页901044灭活检验取1011日龄SPF鸡胚5个，各尿囊腔内接种灭活胚液01ML，37孵育72H，收获鸡胚液，测定血凝性为阴性，并盲传1代，测定血凝性，也无血凝现象，判为灭活完全。01055浓缩与保存将灭活彻底的鸡胚液分装到灭菌的透析袋中，袋外铺加聚乙二醇，在室温下透析浓缩5倍左右。0106浓缩后的鸡胚液分别收集于灭菌容器内。

29、，置于48条件下存放，不得超过3个月。01076半成品检验透析后鸡胚液分别取样，进行无菌检验，无细菌或霉菌生长。透析后鸡胚液分别取样，样品对1鸡红细胞凝集价9LOG2。01087抗原配制、分装及冻干0109保护剂的配制用注射用水配制蔗糖浓度为100的冻干保护剂，过滤除菌后备用。0110抗原制备将检验合格的鸡胚液，混入同一容器内，保护剂与鸡胚液按19比例配制。0111分装与冻干将配好的抗原液用安瓶进行分装，每瓶1ML，精确度在5以内，分装后迅速进行冷冻真空干燥。密封后放置20保存。0112实施例20113成品检验01141物理性状白色或灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。01。

30、152无菌检验抽样检验，应无细菌或霉菌生长。检验结果见表1，所有冻干制品全部呈阴性。0116表1无菌检验统计表011701183效价测定按冻干时不同部位随机抽取样品进行血凝集性测定按附录1进行，测定结果见表2。结果表明对1鸡红细胞的凝集价均不低于7LOG2，达到9LOG2。0119表201抗原效价检测结果0120说明书CN102004151ACN102004164A8/12页100121注表中“”表示全部凝集，“”表示部分全部凝集，“”表示不凝集。01224特异性检验采用血凝抑制试验的方法详见附录1，用该抗原分别对禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征病毒。

31、阳性血清进行血凝抑制试验，该抗原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对其它阳性血清均呈均不能抑制。0123表3抗原特异性检验统计表01240125注表中“”表示全部凝集，即抗原与血清未产生抑制反应；“”表示不凝集，即抗原与血清产生抑制反应。01265剩余水分测定按中国兽药典剩余水分测定法进行，检验结果见表4，结果显示，所有样品的剩余水份的含量均小于3，符合标准物质的要求。0127表4剩余水份检验结果012801296真空度测定按中国兽药典规定真空度测定法进行，所有安瓶真空度均符合要说明书CN102004151ACN102004164A9/12页11求，出现应有的辉光。0130实施例301。

32、311标准物质效价的定值01321定值方法0133红细胞凝集试验96孔微量板法进行测定。01342定值单位0135由68家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用同一方法进行协作标定。01363定值要求01371应对每个被测标准样品分别做六到8次独立的测定，分两个单元，每个单元做三次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。01382所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期内。01394数据处理01401汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。014。

33、12在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。用统计学方法剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。01423当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据。剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。01434抗原效价的定值结果协作标定结果见表5。汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。经描述性统计学分析，该批抗原血凝效价为46080，最终定值为400。0144表5协作标定结果0145说明书CN102004151ACN102004164A10/12页120146注表中数值为抗原全部凝集的最。

34、高稀释倍数。01472均一性检验0148随机抽取样品15支，用电子分析天平分别称量其净重量，结果见表26。描述性生物统计分析得出样品重量均在0112013G之间，平均数为0123G；CV为41，均在95正常值范围内；结果表明该批标准物质装量均一。0149表6样品秤重分析结果015001513稳定性检验0152结果见表7、8、9，结果表明该抗原在37条件下保存28天HA价未下降，35天略有降低。4保存6个月和20保存18个月时HA价未下降。0153表7稳定性检验结果一01540155表8稳定性检验结果二01560157表9稳定性检验结果三说明书CN102004151ACN102004164A11。

35、/12页1301580159附录10160禽流感血凝HA和血凝抑制HI试验01611材料01621196孔V型90度微量反应板、单道及多道微量移液器配有吸头、加样槽、吸管、烧杯等。016312085生理盐水0164121生理盐水配制量取85GNACL，加蒸馏水至1000ML；0165122以121灭菌30分钟，备用；0166123生理盐水一经使用，于28保存不超过1周。016713阿氏ALSEVERS液称葡萄糖205G、柠檬酸钠08G、柠檬酸0055G、氯化钠042G，加蒸馏水至100ML，加热溶解后调PH值至61，69KPA15MIN高压灭菌，28保存备用。0168141鸡红细胞悬液采集23。

36、只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用085生理盐水洗涤3次，每次均以3000RPM/MIN离心5MIN，洗涤后用生理盐水配成1V/V红细胞悬液，28保存备用。016915抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用生理盐水溶解。01702操作术式017121血凝HA试验0172211在V型微量反应板中，每孔加0025ML生理盐水。0173212第1孔加0025ML抗原，反复抽打35次混匀。0174213从第1孔吸取0025ML抗原加入第2孔，混匀后吸取0025ML加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0025ML弃去。0175214每。

37、孔加0025ML生理盐水。0176215每孔加入0025ML1V/V鸡红细胞悬液。0177216将反应板在振荡器上震荡12分钟或轻扣反应板混合反应物，在室温2025下静置2030分钟或284560分钟。在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。0178217结果判定将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌100凝集的最高稀释倍数为血凝效价。017922血凝抑制HI试验0180221根据HA试验测定的效价，计算配制4个血凝单位4HAU抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如，HA效价为1256，则4HAU抗原的稀释倍数应是164256除以4。说明书CN102004。

38、151ACN102004164A12/12页140181222第111孔加入0025ML生理盐水，第12孔加入005ML生理盐水。0182223第1孔加入0025ML血清，充分混匀后吸0025ML于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0025ML弃去。0183224第111孔均加入0025ML的4HAU抗原，在室温2025下静置30分钟或2850分钟。0184225每孔加入0025ML1V/V的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温2025下静置2030分钟或284560分钟，对照红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。01853结果判定以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当。

39、阳性对照血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于2LOG2时，试验方可成立。被检血清HI效价3LOG2判为阴性；4LOG2判为可疑可疑样品应重检，重检效价4LOG2判为阳性，3LOG2判为阴性；5LOG2判为阳性。0186附录20187禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原毒种标准01881红细胞凝集价对1鸡红细胞凝集价应8LOG2。01892病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取106、107、1083个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚01ML。置37继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，2472小时内死亡的鸡胚随时取出并于28冷藏保存。至。

40、72小时，测定所有鸡胚液的红细胞凝集价，凝集价4LOG2者判为感染，计算EID50，每ML病毒含量应1075EID50。01903特异性用微量法进行红细胞凝集抑制试验，对禽流感病毒H9亚型抗血清应为阳性反应，对H5和H7亚型禽流感、鸡新城疫和减蛋综合征病毒阳性血清均应为阴性反应。01914对鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种45周龄SPF鸡10只，每只01ML。另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察14日，感染鸡和对照鸡均不应出现任何异常反应。01925纯净按中国兽药典进行，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。01936基础种子代数5代以内。01947毒种保存在70以下，保存期为60个月。说明书CN102004151A。