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1、10申请公布号CN102002465A43申请公布日20110406CN102002465ACN102002465A21申请号201010566249022申请日20101124CGMCCNO423520101020201010538298320101105CNC12N1/14200601C12N9/42200601C12N15/56200601C12N15/63200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N15/81200601C12R1/68520060171申请人广东溢多利生物科技股份有限公司地址519060广东省珠海市南屏科技工。
2、业园屏北一路8号72发明人张娟吴迪罗长财汪云飞陈丽芝谢建华74专利代理机构北京法思腾知识产权代理有限公司11318代理人高宇杨小蓉54发明名称一种酸性甘露聚糖酶VMAN及其基因和应用57摘要本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明提供一种来源于ASPERGILLUSNIGER保藏编号是CGMCCNO4235的甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，且本发明提供了编码上述甘露聚糖酶的基因，其序列如SEQIDNO2所示。该甘露聚糖酶的最适温度为75，最适PH值为30，是一种酸性的甘露聚糖酶，因此，在动物肠胃的酸性环境中能够更有效的降低甘露聚糖的抗营养作用，促进动物对饲料的利用率。本发明还提供。
3、了该甘露聚糖酶基因高效表达的方法，其表达量可达到11785U/ML，同现有技术相比其表达量更高，因此，可大大降低工业生产成本，使其在饲料、食品、石油化工、酿酒等工业中显示出更大的应用潜力。66本国优先权数据83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图3页CN102002475A1/1页21一种产甘露聚糖酶的黑曲霉ASPERGILLUSNIGER，其保藏号为CGMCCNO4235。2一种酸性甘露聚糖酶VMAN，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。3一种酸性甘露聚糖酶基因VMAN，其特征在于，编码权利要求1所述的甘。
4、露聚糖酶。4如权利要求3所述的酸性甘露聚糖酶基因VMAN，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO2所示。5包含权利要求3或4所述的甘露聚糖酶基因的重组载体。6根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为PPICZAVMAN。7包含权利要求3或4所述甘露聚糖酶基因的重组菌株。8一种高效表达甘露聚糖酶VMAN的方法，其特征在于，包括以下步骤1用权利要求6所述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；2重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组甘露聚糖酶的表达；以及3发酵结束后，回收并纯化所表达的甘露聚糖酶VMAN。9权利要求2所述的甘露聚糖酶VMAN在饲料添加剂、食品、石油化工、酿酒工业中的应。
5、用。权利要求书CN102002465ACN102002475A1/6页3一种酸性甘露聚糖酶VMAN及其基因和应用技术领域0001本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性甘露聚糖酶及其基因和应用。背景技术0002甘露聚糖是豆类、谷类中普遍存在的一种植物半纤维素，是由1，4D甘露糖连接而成的线状多聚体，具有高吸水性。饲料中所含的甘露聚糖在单胃动物的消化道内大量吸水，使食糜粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品豆粕等在饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全。
6、酶解需要甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。0003目前，一般选用大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母作为甘露聚糖酶基因的表达宿主。由于在大肠杆菌中表达产量较低，蛋白易形成包涵体，产业化生产困难。因此采用真核生物，如酿酒酵母和毕赤酵母等作为表达宿主成为当前的主要趋势。如双孢菇TANGCM，ETALTHECEL4GENEOFAGARICUSBISPORUSENEODESAMANNANASEAPPLENVIRONMICROBIOL，2001，67522982303、贻贝XUBINGZE，SELLOSD，JANSONJCCLONINGAND。
7、EXPRESSIONINPICHIAPASTORISOFABLUEMUSSELMYTILUSEDULISMANNANASEGENEEURJBIOCHEM，2002，2691753、芽孢杆菌谭秀华等耐碱性甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达微生物学报，2005，454543544来源的甘露聚糖酶基因分别在毕赤酵母中得到成功表达，表达的酶活力分别为33U/ML、4104U/ML、418U/ML。乔宇等将来自枯草芽抱杆菌的甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中表达，最高酶活可达1102IU/ML，表达量为1MG/ML乔宇，陈小兵，丁宏标，岳明甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究J中国生物工程杂志，2。
8、006，2675256。目前，真菌来源的甘露聚糖酶基因，只有棘孢曲霉CHRISTGAUS，ETALEXPRESSIONCLONING，PURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFABETA1，4MANNANASEFROMASPERGILLUSACULEATUSBIOEHEMMOLBIOLINT1994，335917925和里氏木酶黄生平，汪昌丽，马立新一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达生物技术通讯，2007，182220223的基因序列在酿酒酵母中得到了表达，但酶活较低。总体上来说，目前所报道的甘露聚糖重组酶酶活普遍较低，酶解产物组成不稳定，生产成本较。
9、高。因此筛选高比活酶基因，构建高效产酶微生物，进行基因改良，优化酶的性质，是当前亟待解决的问题。发明内容0004本发明的目的是提供一种产甘露聚糖酶的菌株，ASPERGILLUSNIGER，其保藏号为CGMCCNO4235。0005本发明的再一目的是提供一种来源于上述菌株的酸性甘露聚糖酶。说明书CN102002465ACN102002475A2/6页40006本发明的再一目的是提供上述酸性甘露聚糖酶的基因。0007本发明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重组载体0008本发明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重组菌株。0009本发明的再一目的是提供一种高效表达甘露聚糖酶的方法。001。
10、0本发明的再一目的是提供上述甘露聚糖酶的应用。0011本发明从土壤环境中筛选到一种天然菌株，黑曲霉AN070902ASPERGILLUSNIGER，该菌株于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，其保藏编号是CGMCCNO4235。0012从上述菌株中分离得到一种酸性甘露聚糖酶VMAN，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示0013MKFSSSLLALDSLALANVSTTLTKTSPAPSTSSSAASTSFPSTSGLQFTI0014DGETGYFAGT600015NSYWIGFL。
11、TDSADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQL0016DQDGKSTINT1200017GADGLQRLDYVVSSTEQHDIKLIINFINYWTNYGGMSAYVSAYGGSGETD0018FYTSDTMQSA1800019YQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWVEKASKFLKG0020LDADRMVCIG2400021DEGFGLNIDSDGSYPYKFSEGLNFTMNVGIHTIDFGTLHLYPDSWGTSDD0022WGNGWITAHG3000023ATCKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSV。
12、EGSWQKTALSATRVGADLFWQYGDDL0024STGKSPDDGN3600025TIYYGTSDYQCLVTDHVADIHSA3830026该酶基因编码383个氨基酸，N端前16个氨基酸为信号肽序列，其理论PI/MW为448/4155572。0027经检索表明，本发明获得的甘露聚糖酶与已报道的来源于黑曲霉的甘露聚糖酶氨基酸序列同源性约94CLONING，EXPRESSIONINPICHIAPASTORIS，ANDCHARACTERIZATIONOFATHERMOSTABLEGH5MANNANENDO1，4MANNOSIDASEFROMASPERGILLUSNIGERBK01。本发。
13、明获得的甘露聚糖酶最适温度为65，最适PH值为30，因此本发明的甘露聚糖酶是一种酸性甘露聚糖酶。与已报道的黑曲霉的甘露聚糖酶相比具有更强的耐酸性。该酶在PH2090的条件下酶活稳定，动物消化道全程的各种PH环境均不会显著降低酶活，同时蛋白酶体外水解实验表明本发明获得的甘露聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。此外，该重组酶的热稳定性较好，在70水浴中放置1H酶活力仍能保持75以上，在一定程度上能减少高温制粒时引起的酶活丧失。因此该酶可广泛应用于饲料添加剂中，有效降低动物胃肠道食糜的粘度，促进动物对饲料的利用率。0028本发明还提供了编码上述甘露聚糖酶的基因VMAN，该基因的序列如SEQ。
14、IDNO2所示说明书CN102002465ACN102002475A3/6页50029ATGAAGTTCTCCAGCTCCCTCCTCGCCCTGGATAGCCTGGCGCTGGCCAACGTCTCCACG600030ACTCTGACGAAAACCTCCCCTGCACCGAGCACCAGCAGCAGTGCTGCCTCCACCTCCTTC1200031CCCAGCACCTCCGGCCTCCAATTCACCATTGATGGCGAAACTGGCTACTTCGCCGGAACG1800032AACAGCTACTGGATCGGTTTCCTCACTGACAGCGCGGACGTCGACCTCGTCATGGGC。
15、CAC2400033CTGAAGTCGTCCGGCCTCAAGATCCTCCGCGTGTGGGGCTTCAACGATGTCACCTCGCAG3000034CCCTCCTCCGGCACAGTCTGGTACCAACTGGACCAGGACGGCAAATCGACAATCAACACG3600035GGTGCCGACGGTCTCCAGCGCCTCGACTACGTCGTCTCGTCTACCGAACAACACGACATC4200036AAACTCATCATCAACTTCATCAACTACTGGACCAATTACGGTGGTATGTCTGCGTACGTG4800037AGCGCGTATGGCGGTTCCGGCG。
16、AGACGGATTTCTATACCAGTGATACCATGCAGAGTGCC5400038TATCAGACATATATCAAGACGGTCGTGGAGCGGTACAGTAACTCCTCGGCGGTGTTTGCG6000039TGGGAGTTGGCGAATGAGCCGAGATGTCCGAGTTGCGATACTTCTGTGTTGTATAACTGG6600040GTTGAGAAGGCGAGTAAGTTTCTTAAGGGGTTGGATGCGGATCGTATGGTTTGTATTGGT7200041GATGAGGGCTTCGGTCTCAACATCGACTCGGACGGCAGCTACCCTTATAAATTC。
17、TCCGAG7800042GGCTTGAACTTTACGATGAACGTCGGTATCCATACTATTGACTTTGGTACCCTCCACTTG8400043TACCCTGATAGCTGGGGCACCTCCGACGACTGGGGCAACGGCTGGATCACCGCCCACGGC9000044GCAACCTGCAAAGCGGCCGGCAAGCCATGTCTCCTGGAGGAATACGGAGTCACCTCGAAC9600045CACTGCAGTGTGGAGGGCTCGTGGCAGAAGACAGCGCTCAGCGCAACGCGCGTCGGCGCG10200046GATCTGTTCTGGCAGTAT。
18、GGTGATGATTTGAGTACCGGGAAGTCGCCGGATGATGGGAAT10800047ACTATCTACTATGGGACTAGTGATTATCAGTGCCTGGTGACGGATCATGTTGCTGATATT11400048CATAGCGCCTAA11520049本发明通过同源克隆的方法分离得到上述甘露聚糖酶基因VMAN，该基因全长1152BP，其中148BP为信号肽序列。0050本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因VMAN的重组载体，优选为PPICZAVMAN。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的。
19、一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒PPICZALPHAA上的ECORI和NOTI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒PPICZAVMAN。0051本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因VMAN的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。0052本发明还提供了一种高效表达上述甘露聚糖酶基因VMAN的方法，包括以下步骤00531用上述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；00542重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组甘露聚糖的表达；以及00553发酵结束后，回收并纯化所表达的甘露聚糖酶VMAN。0056其中，重组菌。
20、株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段第一阶段为菌体培养阶段，按10比例接入种子，培养2430小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80以上即表明该阶段结束，为期约3060MIN；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20以上，培养时说明书CN102002465ACN102002475A4/6页6间在180200小时之间。发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的重组甘露聚糖酶，可达到11785U/ML的发酵水平，同目前已有的现有技术相比，本法明的甘露聚糖酶通过高效表达后能够达到更高。
21、的发酵水平。0057本发明是为了解决现有技术的不足，从土壤中筛选、分离得到一种酸性甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达，可达到比现有技术更高的表达水平。因此，本发明的甘露聚糖酶在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、食品、石油化工、酿酒等工业中显示出更大应用潜力。附图说明0058图1重组甘露聚糖酶在50L罐中的发酵过程曲线0059图2重组菌株分泌表达甘露聚糖酶的SDSPAGE图谱，1纯化后的重组甘露聚糖酶；2对照X33；M蛋白标准。0060图3重组甘露聚糖酶的最适反应温度0061图4重组甘露聚糖酶的最适反应PH值0062图5重组甘露聚糖酶的温度耐受性0063图6重组甘露聚糖酶的P。
22、H耐受性0064图7重组甘露聚糖酶在胃蛋白酶，胰蛋白酶处理后剩余酶活0065图8金属离子和EDTA对重组甘露聚糖酶酶活力的影响0066黑曲霉AN070902ASPERGILLUSNIGER，该菌株于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，其保藏编号是CGMCCNO4235。具体实施方式0067以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照分子克隆实验指南第三版J萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径。
23、获得。0068实验材料和试剂00691、菌株与载体0070大肠杆菌菌株TOP10、毕赤酵母X33、载体PPICZALPHAA购自INVITROGEN公司，载体PMD18T购自TAKARA公司。00712、酶与试剂盒0072逆转录酶SUPERSCRIPTTMIII、RNA提取试剂盒购自INVITROGEN公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自FERMENTAS公司。00733、培养基0074基本盐培养基磷酸氢二铵5、磷酸二氢钾05、七水硫酸镁15、硫酸钾195、硫酸钙01、氢氧化钾01、消泡剂003。高压后每升加435毫升PTM10075PT。
24、M1微量盐溶液硫酸铜06、碘化钾0018、一水硫酸锰03、二水钼说明书CN102002465ACN102002475A5/6页7酸钠002、硼酸0002、六水氯化钴005、氯化锌2、七水硫酸铁65、浓硫酸05、生物素0020076实施例1、产甘露聚糖酶菌株ASPERGILLUSNIGER的分离、培养0077从魔芋根附近的天然土壤中分离得到一株具有甘露聚糖酶活性的霉菌，后经鉴定为黑曲霉ASPERGILLUSNIGER保藏编号CGMCCNO42350078实施例2、黑曲霉ASPERGILLUSNIGER甘露聚糖酶基因VMAN的克隆0079运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉ASPERGILLUSNIG。
25、ER总RNA，按照逆转录酶SUPERSCRIPTTMIIIREVERSETRANSCRIPTASE操作说明合成第一链CDNA。以CDNA为模板，设计甘露聚糖酶引物VMAN5ECORI，VMAN3NOTI进行PCR扩增，将PCR产物由ECORI和NOTI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体PPICZALPHAA相连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经抗生素ZEOCIN筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，获得克隆DNA插入片段含有甘露聚糖酶基因完整的开放阅读框。该甘露聚糖酶基因VMAN，全长1152BP，编码383个氨基酸。得。
26、到的重组表达载体命名为PPICZAVMAN。0080VMAN5ECORI00815CTGAAGCTGAATTCAAGTTCTCCAGCTCCCTCCTCACC30082VMAN3NOTI00835AAAGCTGGCGGCCGCTTAGGCGCTATGAATATCAGCAACATG30084实施例3、包含甘露聚糖酶基因VMAN的毕赤酵母工程菌的构建0085将上述重组表达载体PPICZAVMAN用SACI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，得到毕赤酵母重组菌株X33/VMAN。0086实施例4、甘露聚糖酶重组菌株的高效表达0087将上述重组菌X33/VMAN单菌落进行高密度发酵培。
27、养。配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的PH值至48，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30，发酵温度为30。整个发酵过程分3个阶段第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌X33VMANPPIC按照10的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L50的葡萄糖，培养2430小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80以上即表明该阶段结束，为期约3060MIN；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20以上，培养时间在180200小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。在。
28、发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中甘露聚糖酶的表达情况如图1所示，诱导培养192H的发酵液酶活为11785U/ML。0088实施例5、重组甘露聚糖酶的活性分析0089采用DNS法测定水解产生的还原糖。1个酶活单位U定义为在55、PH50的条件下，每分钟分解槐豆胶中的甘露聚糖产生具有还原能力相当于1MOL甘露糖所需的酶量。实验设三次重复，每个样品测定均设三个平行实验，相对误差控制在8以内。0090实施例6、重组甘露聚糖酶VMAN的性质测定00911、甘露聚糖酶VMAN的分子量大小和比活0092将上述发酵液中的甘露聚糖酶通过离子交换柱QSEPHAROSETMFASTFLOW说明书CN1。
29、02002465ACN102002475A6/6页8IONEXCHANGER纯化，采用改良型BRADFORD试剂盒上海SANGON公司测定蛋白浓度，得出该甘露聚糖酶比活为2153U/MG，将纯化后的蛋白液进行12SDSPAGE检测见图2。00932、甘露聚糖酶VMAN的最适反应温度及PH测定0094最适反应温度将酶液稀释适当倍数，在不同温度2580下反应，测定甘露聚糖酶的酶活。以在55的酶活力为基础，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应PH将稀释后的酶液，与不同PH2075的04M磷酸钠醋酸钠硼酸钠缓冲液配制的槐豆胶底物反应，分别测定相对于PH50的相对酶活。结果如。
30、图3和图4所示该重组甘露聚糖酶的最适反应温度为65，最适反应PH为30。00953、甘露聚糖酶VMAN的温度及PH稳定性的测定0096温度稳定性将酶液稀释适当倍数，在不同温度6580下处理酶液5、10、20、30、40、60MIN后，以未处理的酶活力为对照测定甘露聚糖酶的相对酶活。PH稳定性将稀释后的酶液与不同PH的缓冲液混合，室温放置2H，以未处理的酶液为对照，测定甘露聚糖酶的相对酶活。结果如图5和图6所示该重组酶在低于70下稳定性较好，在70水浴中放置1H酶活仍能保持75以上，但在75和80放置10MIN后，酶活分别仅剩47和10；该酶的PH稳定范围较广，在PH2090的环境下室温保持2H。
31、，酶活未见显著下降。00974、甘露聚糖酶VMAN对胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性测定0098取01ML甘露聚糖酶液，分别加入05ML01MG/ML胃蛋白酶PH20浓度80U/ML和05ML01MG/ML胰蛋白酶PH70浓度150U/ML，于37处理2H后测酶活。结果如图7所示，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2H后，甘露聚糖酶酶活分别维持在80和65左右，具有较好的抗胃蛋白酶和抗胰蛋白酶活性。00995、金属离子和EDTA对酶活力的影响0100将含有1MMK、MG2、CA2、ZN2、FE2、FE3、MN2、CO2、CU2和EDTA的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30MIN，以未处理的酶液为对照，。
32、测定甘露聚糖酶的相对酶活。结果如图8所示，在供试的9种金属离子中，1MM的FE3和MN2对该酶的活性有显著抑制作用，而1MMCO2对该酶有激活作用，其余1MM的金属离子和EDTA对该酶酶活影响不显著。说明书CN102002465ACN102002475A1/2页900010002序列表CN102002465ACN102002475A2/2页10序列表CN102002465ACN102002475A1/3页11图1图2说明书附图CN102002465ACN102002475A2/3页12图3图4图5说明书附图CN102002465ACN102002475A3/3页13图6图7图8说明书附图CN102002465A。