本申请是申请日为2008年1月23日、申请号为200810004736.0、 发明名称为“具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用”的 申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种具有免疫刺激活性的 硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用。
背景技术
上世纪八十年代日本学者发现卡介苗(BCG)中的DNA组分在 人和动物体内具有抗肿瘤活性，后来研究反义核酸治疗的科学家又发 现人工合成的硫代寡聚脱氧核苷酸存在非特异的免疫刺激活性。 Krieg AM等在《Nature》1995，第374卷、第546-549页中揭示了这 些现象的本质，发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化 5′-CpG-3′二核苷酸的六核苷酸序列，特征为5’-PuPuCpGPyPy-3’(Pu 代表嘌呤A或G；Py代表嘧啶C或T)，如5’-GACGTT-3’等。其中， 核心核苷酸C和G为其活性所必需，两端各两个核苷酸也与其活性 紧密相关。上述六核苷酸特征序列称作CpG基元(CpG motif)，含 有CpG基元的寡聚脱氧核苷酸统称为CpG寡聚脱氧核苷酸 (CpG-ODN)。含有上述特征的CpG-ODN对小鼠具有良好的免疫刺 激活性，动物实验结果显示了CpG-ODN在疫苗佐剂、肿瘤预防和治 疗、感染预防和治疗以及过敏预防和治疗等领域具有良好的应用前 景。但是进一步研究发现其免疫刺激活性具有种属特异性，因此阐明 活化人免疫细胞的CpG基元和CpG-ODN是将CpG-ODN应用于人体 临床的必要前提。Krieg AM等在《The Journal of Immunology 2000， 第164卷、第1617-1624页中报道了第一个能够活化人免疫细胞的 CpG基元5’-GTCGTT-3’。由此衍生的CpG-ODN(如CpG-ODN 2006) 在体外对人免疫细胞具有良好的免疫刺激活性，而且目前多个人体临 床研究也证实了CpG-ODN 2006在疫苗佐剂、肿瘤治疗以及感染治疗 等领域的免疫效果。根据Krieg AM等研究结果，上述CpG-ODN是 人特异的，对小鼠没有活性，因此只能用猴子等灵长类动物作为动物 模型来评价这些序列在体内的免疫刺激活性，这增加了实验的难度， 例如成本增加、动物来源难于获得等。因此，发现一种非种属特异性 的广谱CpG-ODN是十分有必要的。
对于有关CpG-ODN的研究在文献《中华微生物学和免疫学杂志》 2001，21(5)，第471-475页、《动物医学进展》2004，25(4)， 第25-28页、《Gene Therapy》1996，第6卷，第893-903页中有所 描述。另外，专利文献CN 1271733A、CN 1526718A、US 2005/0267057 A1或WO 99/56755中也公开了一些CpG-ODN及其相关的应用，但 是在上述文献中，均未公开有关具有两个或两个以上拷贝的 5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)的核苷酸，也未公开任何有 关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激 活性的技术启示。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非种属特异性的、具有免疫刺激活性 的硫代寡聚脱氧核苷酸。更具体地说，本发明提供了一种对人和小鼠 具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。
本发明的目的还在于提供该具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧 核苷酸在制备疫苗佐剂以及在制备预防或治疗肿瘤、感染和过敏的药 物中的应用。
本发明人在现有技术的基础上进行研究，发现：(1)活化人免 疫细胞的CpG基元为5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T， Py代表嘧啶C或T)；(2)活化小鼠免疫细胞的CpG基元为 5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、G、C或T)。在此研究基础上， 发现出含有5’-NTCGTT-3’基元(包括5’-ATCGTT-3’、5’-GTCGTT-3’、 5’-CTCGTT-3’和5’-TTCGTT-3’)的CpG-ODN对人和小鼠具有交叉 免疫刺激活性。发明人进一步研究表明，核苷酸序列中具有两个或两 个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)是本发明所述 的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的关键。
鉴于此，本发明提供了一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核 苷酸，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元，所 述N不代表A或G，优选为T或C。所述硫代寡聚脱氧核苷酸的长 度为15～35个核苷酸，优选为20～30个核苷酸。所述CpG是非甲 基化的。
当N为T时，所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为：
5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、
5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、
5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、
5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、
5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、
5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’、
5’-TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、
5’-TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、
5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’或
5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’。
当所述N为C时，所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为：
5’-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’或
5’-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’。
本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸的制备方法是本领域技术人 员所熟知的，例如可以采用固相亚磷酰胺三酯法化学合成，此法具有 高效和快速偶联等优点，已广泛应用于DNA化学合成领域中。目前 对于寡聚脱氧核苷酸人工合成多委托专业的基因合成公司来处理，例 如国内可委托上海生工生物技术公司合成。
固相亚磷酰胺三酯法由3’端开始，具体反应步骤如下：
1.脱保护基：用三氯乙酸脱去连接在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游 离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；
2.活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并 进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’端已被活化，但5’ 端仍受DMT保护)，此中间体与CPG上已脱保护基的核苷酸发生 缩合反应；
3.连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核 苷酸时，将与其5’羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时寡核 苷酸链向前延长一个碱基；
4.氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上 的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫 代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核 苷酸；
5.封闭：缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5’ 羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸 上。重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一 个DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基、纯化(常用的有 PAGE法、HPLC法、C18法和OPC法等方法)、定量等合成后处理 即可得到符合本发明要求的硫代寡聚脱氧核苷酸。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗肿瘤的 药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗感染的 药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗过敏的 药物中的应用。
所述硫代寡聚脱氧核苷酸在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好 的免疫刺激活性，可以从对小鼠中的免疫刺激活性结果来评价其在人 体中的免疫刺激活性。作为疫苗佐剂，其能够显著增强小鼠对基因工 程乙肝疫苗的免疫应答，而且能够使免疫应答偏向TH1方向。由于本 发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸能够诱生出很强的TH1类免疫应答， 表明其也可用于过敏和感染的预防和治疗。同时，本发明所述的硫代 寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内也具有良好的抑制肿瘤生长的活性。
附图说明
图1为示出具有5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T， Py代表嘧啶C或T)基元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性的图。
图2为示出具有5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、G、C或T) 基元的寡聚脱氧核苷酸的小鼠免疫刺激活性的图。
图3a为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T1～T6、C1和C2)以及 对照序列1826的人免疫刺激活性的图。
图3b为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T7～T14)的人免疫刺激活 性的图。
图3c为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T15～T22)的人免疫刺激 活性的图。
图4a为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T1～T6、C1和C2)以及 对照序列1826和T7C的小鼠免疫刺激活性的图。
图4b为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T7～T14)的小鼠免疫刺激 活性的图。
图4c为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T15～T22)的小鼠免疫刺 激活性的图。
图5为示出本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基 因工程乙肝表面抗原的免疫应答的图。
图6为示出本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小 鼠对基因工程乙肝表面抗原的免疫应答的图。
图7为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内诱生TH1类免疫 应答的图。
图8为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内抑制肿瘤生长的 图。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明， 但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思 想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想， 均在本发明的范围之内。
实施例1.具有5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T， Py代表嘧啶C或T)基元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性
为了阐明活化人免疫细胞的CpG基元，本发明人对CpG基元中 除核心核苷酸CpG以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。为此， 发明人设计了一组CpG-ODN，如表1所示，每条序列长度为12个 核苷酸，均含有两个相同拷贝的CpG基元。用这些CpG-ODN刺激 体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)，通过测定培养上清中的 IgM含量，即可评价它们对人免疫细胞的活性。
本实施例中所使用的CpG-ODN由本发明人设计，委托上海生工 生物技术公司进行人工合成，并进行全链硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶 电泳(PAGE)纯化，溶于生理盐水，-20℃冰箱中保存备用。
表1
序号 编号 序列 1 1444 5’-ATCGTT ATCGTT-3’ 2 2444 5’-GTCGTT GTCGTT-3’ 3 3444 5’-CTCGTT CTCGTT-3’ 4 4444 5’-TTCGTT TTCGTT-3’ 5 2144 5’-GACGTT GACGTT-3’ 6 2244 5’-GGCGTT GGCGTT-3’ 7 2344 5’-GCCGTT GCCGTT-3’ 8 2444 5’-GTCGTT GTCGTT-3’ 9 2414 5’-GTCGAT GTCGAT-3’ 10 2424 5’-GTCGGT GTCGGT-3’ 11 2434 5’-GTCGCT GTCGCT-3’ 12 2444 5’-GTCGTT GTCGTT-3’ 13 2441 5’-GTCGTA GTCGTA-3’ 14 2442 5’-GTCGTG GTCGTG-3’ 15 2443 5’-GTCGTC GTCGTC-3’ 16 2444 5’-GTCGTT GTCGTT-3’
无菌条件下取健康人静脉血，肝素抗凝后用人淋巴细胞分离液 (购自北方同正生物技术公司)分离PBMC；计数后用RPMI 1640 培养基(购自美国Gibco公司)将细胞浓度调整至1×106/ml，接种至 96孔细胞板中，每孔200μl；加入CpG-ODN至终浓度为2μM，5％CO2条件下37℃培养8天。用羊抗人IgM(购自美国SIGMA公司)包被 96孔酶标板，每孔200ng，4℃过夜；洗板3次后加入上述PBMC培 养上清，每孔100μl，37℃作用1小时；洗板3次后加入1∶10000稀 释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM(购自美国SIGMA公司)， 每孔100μl，37℃作用1小时；洗板3次后用邻苯二胺(OPD)显色， 2M硫酸终止反应，用分光光度计测定490nm处吸光度值OD490。所 测得OD490值越大，表明该CpG-ODN对人免疫细胞的活性越强。
结果详见图1，其中“对照”为不加CpG-ODN的细胞对照。序 号为1～4的四个序列，仅在CpG基元的第一位核苷酸不同，结果显 示它们对人免疫细胞的活性相当，表明活化人免疫细胞的CpG基元 的第一位核苷酸为N(其中N代表A、G、C或T)；序号为5～8 的四个序列，仅在CpG基元的第二位核苷酸不同，结果显示该位置 必须为T，否则对人免疫细胞的活性很弱；序号为9～12的四个序列， 仅在CpG基元的第五位核苷酸不同，结果显示该位置也必须为T， 否则对人免疫细胞的活性很弱；序号为13～16的四个序列，仅在CpG 基元的第六位核苷酸不同，结果显示该位置为C或T时具有较好的 免疫刺激活性。综上所述，活化人免疫细胞的CpG基元为 5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或T)。
实施例2.具有5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、G、C或T) 基元的寡聚脱氧核苷酸对小鼠的免疫刺激活性
为了阐明活化小鼠免疫细胞的CpG基元，本发明人对CpG基元 中除核心核苷酸CpG以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。本实 施例中使用的CpG-ODN序列见表1。用这些CpG-ODN刺激小鼠脾 脏单个核细胞(SMMC)，通过测定培养上清中的IgM含量，即可 评价它们对小鼠免疫细胞的活性。所使用的为Balb/c小鼠，雌性，6～ 8周，购自中国医学科学院实验动物中心。
无菌条件下取Balb/c小鼠脾脏，用RPMI 1640培养基制备 SMMC悬液；计数后用RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至 1×106/ml，接种至96孔细胞板中，每孔200μl；加入CpG-ODN至终 浓度为2μM，5％CO2条件下37℃培养3天。用羊抗小鼠IgM(购自 美国SIGMA公司)包被96孔酶标板，每孔200ng，4℃过夜；洗板 3次后加入上述SMMC培养上清，每孔100μl，37℃作用1小时；洗 板3次后加1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM (购自美国SIGMA公司)，每孔100μ1，37℃作用1小时；洗板3 次后用OPD显色，2M硫酸终止反应，用分光光度计测定490nm处 吸光度值OD490。所测得OD490值越大，表明该CpG-ODN对小鼠 免疫细胞的活性越强。
结果详见图2，其中“对照”为不加CpG-ODN的细胞对照。序 号为1～4的四个序列，仅在CpG基元的第一位核苷酸不同，结果显 示它们对小鼠免疫细胞的活性相当，表明活化小鼠免疫细胞的CpG 基元的第一位核苷酸为N(其中N代表A、G、C或T)；序号为5～ 8的四个序列，仅在CpG基元的第二位核苷酸不同，结果显示该位 置必须为A或T，否则对小鼠免疫细胞的活性很弱；序号为9～12 的四个序列，仅在CpG基元的第五位核苷酸不同，结果显示该位置 必须为T，否则对小鼠免疫细胞的活性很弱；序号为13～16的四个 序列，仅在CpG基元的第六位核苷酸不同，结果显示该位置也必须 为T，否则对小鼠免疫细胞的活性很弱。综上所述，活化小鼠免疫细 胞的CpG基元为5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、G、C或T)。
由实施例1和2的研究结果可知，活化人免疫细胞的CpG基元 为5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或T)； 活化小鼠免疫细胞的CpG基元为5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、 G、C或T)。综合上述研究结果，可以看出对人和小鼠具有交叉免 疫刺激活性的CpG基元为5’-NTCGTT-3’(其中N代表A、G、C或 T)。
实施例3.本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞的免疫刺激活 性
根据实施例1和2中发现的对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性 的CpG基元，发明人设计合成了一组CpG-ODN，如表2所示，长度 为15～35个核苷酸，分别含有两个或多于两个拷贝的5’-TTCGTT-3’ 基元(编号为T1～T22)和5’-CTCGTT-3’基元(编号为C1和C2)。
表2中的CpG-ODN除了对照序列T7C和1826分别引自文献《中 华微生物学和免疫学杂志》2001，21(5)，第471-475页、《The Journal of Immunology》1998，第160卷，第870-876页，其余均由本发明 人设计。本实施例中所用对照序列以及发明人自行设计的序列均委托 上海生工生物技术公司进行合成，全链硫代修饰，PAGE纯化，溶于 生理盐水，-20℃冰箱中保存备用。
表2
编号 序列 T1 5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T2 5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T3 5’-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T4 5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ T5 5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ T6 5’-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ T7 5’-TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ T8 5’-TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ T9 5’-TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ T10 5’-TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ T11 5’-TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ T12 5’-TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ T13 5’-TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ T14 5’-TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ T15 5’-TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ T16 5’-TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ T17 5’-TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ T18 5’-TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ T19 5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T20 5’-TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T21 5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ T22 5’-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ C1 5’-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ C2 5’-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ T7C 5’-TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’ 1826 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’
根据实施例1所述的方法测定本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫 细胞的免疫刺激活性，不同之处在于在96孔细胞板中加入本发明寡 聚脱氧核苷酸至终浓度为4nM、8nM、16nM和32nM。结果见表3、 图3a、3b和3c。
表3
由表3、图3a、3b和3c可见，本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫 细胞具有高度的免疫刺激活性，在4～32nM浓度范围内就有很强的活 性。对照序列1826含有两拷贝5’-GACGTT-3’基元，为小鼠特异性 CpG-ODN，因此对人免疫细胞的活性较弱。
实施例4.本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞的免疫刺激 活性
根据实施例2所述的方法，测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠 免疫细胞的免疫刺激活性，不同之处在于在96孔细胞板中加入本发 明寡聚脱氧核苷酸至终浓度为12.5nM、25nM、50nM、100nM和 200nM。结果见表4、图4a、4b和4c。
表4
由表4、图4a、4b和4c可见，本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免 疫细胞具有高度的免疫刺激活性，在12.5～200nM浓度范围内就有很 强的活性。对照序列1826含有两拷贝5’-GACGTT-3’基元，为小鼠 特异性CpG-ODN，因此对小鼠免疫细胞具有最强的活性。对照序列 T7C含有多拷贝5’-GTCGTC-3’基元，为人特异性CpG-ODN，因此 对小鼠免疫细胞的活性很弱。
由实施例3和4中的实验结果可以看出，可以根据对人和小鼠 具有交叉免疫刺激活性的CpG基元5’-NTCGTT-3’(其中N不代表A 或G)来设计对人和小鼠具有高度交叉免疫刺激活性的寡聚脱氧核苷 酸，同时也提示可以用小鼠作为动物模型来评价这类寡聚脱氧核苷酸 的潜在人体临床应用价值。
实施例5.本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基 因工程乙肝表面抗原的免疫应答
本实施例中使用CpG-ODN T1～T6和C1～C2。基因工程乙肝 表面抗原(HBsAg)由中国预防医学科学院病毒学研究所病毒遗传与 免疫室提供，CHO细胞表达，纯度大于95％。Balb/c小鼠，雌性，6～ 8周，购自中国医学科学院实验动物中心。
将HBsAg吸附于1mg/ml的Al(OH)3，最终蛋白浓度为10μg/ml。 经左后肢腓肠肌免疫Balb/c小鼠，总体积为100μl，每组6只小鼠。 实验组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg和10μg本发明所 述的寡聚脱氧核苷酸，对照组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的 HBsAg。免疫后4周采血并分离出血清，按照常规方法对该血清进行 2倍系列稀释，用于检测抗原特异性IgG总抗体。
用HBsAg包被96孔酶标板，每孔200ng，4℃过夜；洗板3次 后用1％牛血清白蛋白37℃封闭1小时；洗板3次后加入上述2倍系 列稀释的待检血清，37℃作用1小时；洗板3次后加入1∶10000稀释 的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(购自美国SIGMA公司)， 每孔100μl，37℃作用1小时；洗板3次后用OPD显色，2M硫酸终 止反应，用分光光度计测定490nm处吸光度值OD490并确定终点滴 度(临界值设为0.10)。
图5中“对照”表示Al(OH)3作为佐剂免疫后诱生的HBsAg特 异性IgG抗体滴度。免疫时加入本发明的CpG-ODN即可显著增强对 HBsAg的免疫应答，特异性抗体滴度(对数值)可增强10倍以上， 表明它们具有极好的疫苗佐剂活性。由于这些CpG-ODN对人和小鼠 具有交叉免疫刺激活性，提示它们也可作为人用疫苗佐剂。
实施例6.本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小 鼠对基因工程乙肝表面抗原的免疫应答
本实施例中使用CpG-ODN T1。基因工程HBsAg由中国预防医 学科学院病毒学研究所病毒遗传与免疫室提供，CHO细胞表达，纯 度大于95％。Balb/c小鼠，雌性，6～8周，购自中国医学科学院实 验动物中心。
将HBsAg直接用生理盐水稀释或吸附于1mg/ml的Al(OH)3上， 最终蛋白浓度为10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫Balb/c小鼠，总体积 为100μl，每组6只小鼠。HBsAg组每只小鼠注射1μg不含任何佐剂 的HBsAg，HBsAg+Al组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg， HBsAg+CpG组每只小鼠注射1μg的HBsAg和10μg的CpG-ODN T1， HBsAg+Al+CpG组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg和 10μg的CpG-ODN T1。免疫后4周采血，并根据实施例5所述的方 法检测抗原特异性IgG总抗体。
由图6可见，不使用佐剂的HBsAg组免疫效果最差，特异性抗 体滴度仅为2.7个对数值，用Al(OH)3或CpG-ODN T1作为佐剂可显 著增强HBsAg的免疫效果，特异性抗体滴度(对数值)均可增加5 倍左右。Al(OH)3和CpG-ODN T1具有协同作用，联合使用具有最强 的佐剂活性，可使特异性抗体滴度增加10倍以上。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂既可单独使用，也可与其它疫苗 佐剂如Al(OH)3联合使用。
实施例7.本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠中增强TH1类免疫应答
根据实施例5所述的方法，测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠 TH1类免疫应答的影响，不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣 根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG2a(购自美国SBA公司)。结果 显示在图7中。
抗原特异性免疫应答分为TH1和TH2两种类型，其中TH1类应 答与高水平的抗原特异性IgG2a抗体滴度相对应。Al(OH)3是一种极 强的TH2类疫苗佐剂，能够抑制TH1类免疫应答，表现为免疫后诱 生极低水平的特异性IgG2a抗体。在本实施例中，Al(OH)3作为HBsAg 佐剂诱生的特异性IgG2a抗体滴度仅为2.3个对数值，如图7中“对 照”所示。免疫时加入本发明的CpG-ODN即使免疫应答偏向TH1方向，表现为特异性IgG2a抗体滴度增加2～3个对数值，即100～ 1000倍。上述结果表明，本发明寡聚脱氧核苷酸是一类极强的TH1类免疫刺激剂。当代免疫学研究表明，过敏是一种TH2类免疫应答 相关的疾病，如果能够将免疫应答类型逆转为TH1类，即可预防和 治疗过敏。此外，肿瘤和感染的预防和治疗均需要诱生较强的TH1类免疫应答。基于本发明的CpG-ODN能够诱生很强的TH1类免疫应 答，因此本发明的CpG-ODN除了能够作为疫苗佐剂，也可应用于过 敏、肿瘤和感染的预防和治疗等其它领域。
实施例8.本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内能够抑制肿瘤生 长
将C-26实体瘤(由中国医学科学院医药生物技术研究所提供) 用铜网磨碎，用pH为7.2的磷酸盐缓冲液将细胞浓度调整至 1×106/ml，经左后肢腹侧皮下接种Balb/c小鼠，每只小鼠100μl，每 组8只小鼠。从接种后第二天开始，每两天向肿瘤接种部位注射 CpG-ODN T1，每只小鼠10μg，体积为100μl，对照组小鼠仅注射100μl 生理盐水，总共注射6次。末次注射5天后处死小鼠，摘除肿瘤并称 重。计算每组动物的平均瘤重，并按以下公式计算抑瘤率：(对照组 平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。结果显示在图 8中。
由图8可见，对照组小鼠的平均瘤重为1.43克，经过注射6次 CpG-ODN T1治疗后，治疗组小鼠的平均瘤重为0.59克，抑瘤率达到 58.7％。上述结果表明，本发明寡聚脱氧核苷酸具有良好的抗肿瘤效果， 可在临床上用于肿瘤的免疫治疗。