一种基于CD117的嵌合抗原受体及其应用.pdf

本发明涉及一种基于CD117的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD117为基础的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD117。本发明的嵌合抗原受体通过对CD117肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原‑抗体结合力更强，不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR‑T细胞的免疫效果增强，增强了CAR‑T细胞的治疗效果。

1.一种基于CD117嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD117。 2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD117嵌合抗原受体的单链抗体氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；优选地，所述肿瘤表面抗原CD117还包括肿瘤表面抗原CD117的突变体的单链抗体；优选的，所述肿瘤表面抗原CD117的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。 3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；优选地，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域或CD27信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域的组合。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括可诱导自杀融合结构域；优选地，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域；优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成；优选地，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD117抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和/或CD27信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成。 6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9；优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。 7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达；优选地，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞；优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。 8.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；优选地，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。 9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求8所述的重组慢病毒。 10.如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病；优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD117的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD117为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragment variable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。

大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acute lymphocytic leukemia,leukemia,B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

CD19分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热点，CD19的表达局限于正常和恶性B细胞，是广泛接受的用来安全测试的CAR靶标。靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CD19CAR-T)在治疗多发性、难治性的急性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

CN 104788573A公开了了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种嵌合抗原受体能够解决CD19存在的易突变和表达量降低的问题显得尤为重要。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于CD117的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将CD117靶点进行基因改造，从而提高了靶点的免疫效果，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于CD117的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD117。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD117，再通过对CD117嵌合抗原受体进行特定的人源基因码优化改造，从而使得肿瘤表面抗原CD117能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR-T细胞的免疫效果增强。

根据本发明，所述CD117嵌合抗原受体的单链抗体(ScFv)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD117嵌合抗原受体的单链抗体(ScFv)氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK。

本发明中，所述CD117嵌合抗原受体的单链抗体(ScFv)的氨基酸进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的抗体的抗原-抗体结合力更强。

根据本发明，所述肿瘤表面抗原CD117还包括肿瘤表面抗原CD117的突变体的单链抗体，所述肿瘤表面抗原CD117的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域和CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域的组合，所述CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和/或CD27信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请优选采用CD28-CD137-CD27的顺序组合。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括可诱导自杀融合结构域，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联，所述2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因的信号肽，本发明所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

优选地，所述Secretory信号肽为CD8a基因的信号肽，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列如下：MALPVTALLLPLALLLHAARP.

优选地，所述Secretory信号肽为GMCSFR基因的信号肽，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列如下:MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP.

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD117抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：

Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9。

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下：

ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGCCGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGATTCACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGAGACAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGGCGACAGCGACACCAGATACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGGCAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGACACGGCAGAGGCTACAACGGCTACGAGGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCAGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGCCATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAGCGCCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAGCCTGGAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTTCAACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGCCGCCGCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGACCCGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCGCCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGAGAAGAAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCCGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACAGAAAGCCCGAGCCCGCCTGCAGCCCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAACCAGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCAGAGACAGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTACGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCCCCCCACGCCACCCTGGTGTTCGACGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGCCATGGTGGGCGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGACCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGCGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGAGAACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGAAGAAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCAGACAGGACCACGGCGCCCTGGACTGCTGCGTGGTGGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGCGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGCCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTCATCCAGGCCTGCGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCCGAGGACGAGAGCCCCGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGAGAACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTCCCCGGCTTCGTGAGCTGGAGAGACCCCAAGAGCGGCAGCTGGTACGTGGAGACCCTGGACGACATCTTCGAGCAGTGGGCCCACAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGAGAAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCAGCTGA.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a、CMV-TAR或CMV中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病或淋巴瘤。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体通过对CD117肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原-抗体结合力更强；

(2)本发明的CD117嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD117，CD117在白血病及淋巴瘤中表达量高，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果；

(3)本发明的嵌合抗原受体在进行CAR-T细胞回输后，肿瘤表面CD117的表达量不会降低，不容易逃过免疫机制，能够更好的进行治疗。

附图说明

图1为CD117在急性T细胞白血病患者样本中表达量的流式细胞分析结果图，其中，图1(a)为急性T细胞白血病患者样本的流式细胞分析结果图，图1(b)为CD117在急性T细胞白血病细胞表达量；

图2为CD117在急性髓系白血病患者样本中表达量的流式细胞分析结果图，其中，图2(a)为急性髓系白血病患者样本的流式细胞分析结果图，图2(b)为CD117在急性髓系白血病细胞表达量；

图3为肿瘤细胞和CAR-T细胞混合培养的流式细胞分析结果图，其中，图3(a)肿瘤细胞与T细胞混合培养，图3(b)肿瘤细胞与Mesothelin CAR-T细胞混合培养，图3(c)肿瘤细胞与本申请的CAR-T细胞混合培养。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成Secretory信号肽、CD117抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和/或CD27信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域，即Secretory-CD117-CD28-CD137-CD27-CD3ζ-2A-iCasp9；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列SEQ ID NO.3如下：

ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGCCGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGATTCACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGAGACAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGGCGACAGCGACACCAGATACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGGCAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGACACGGCAGAGGCTACAACGGCTACGAGGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCAGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGCCATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAGCGCCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAGCCTGGAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTTCAACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGCCGCCGCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGACCCGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCGCCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGAGAAGAAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCCGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACAGAAAGCCCGAGCCCGCCTGCAGCCCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAACCAGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCAGAGACAGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTACGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCCCCCCACGCCACCCTGGTGTTCGACGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGCCATGGTGGGCGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGACCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGCGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGAGAACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGAAGAAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCAGACAGGACCACGGCGCCCTGGACTGCTGCGTGGTGGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGCGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGCCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTCATCCAGGCCTGCGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCCGAGGACGAGAGCCCCGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGAGAACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTCCCCGGCTTCGTGAGCTGGAGAGACCCCAAGAGCGGCAGCTGGTACGTGGAGACCCTGGACGACATCTTCGAGCAGTGGGCCCACAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGAGAAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCAGCTGA。

实施例2：慢病毒包装

(1)用六孔板分别培养293T细胞，1×106个细胞/孔，培养17-18小时；

(2)加入600μL/孔的新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取75μL的DMEM的上清液，2.7μg的辅助DNA混合液(1.8μg pNHP，0.5μg pHEF-VSV-G，0.2μg pHEF-GFP)以及0.8μg的pTYF DNA载体，漩涡振荡；

(4)从每孔板中央吸取7μL的Superfect加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；

(6)37℃3％CO2培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用1.5mL AIM-V冲洗培养基，并加入1.5mL的AIM-V继续培养；

(8)将培养基放回3％CO2培养箱中培养过夜，第2-3天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3：慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心(1000g，5分钟)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生106到107转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用Centricon过滤器浓缩慢病毒载体

(1)在生物安全柜中，取Centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用无菌PBS清洗3次；

(2)每个Centricon P-20过滤管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g下离心30分钟或者直到病毒体积减小到0.5ml；

(3)震荡过滤管，然后在400g下，离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4：CAR-T细胞的转染

将活化后的T细胞以5×106接种到24孔板，加入50μl的浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，室温离心100分钟后，置于37℃培养24h，加入1ml的含有2％人血清与细胞培养因子的AIM-V基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，以1×107接种到12孔板，培养2-3天，用慢病毒载体携带GFP感染靶细胞并用annexinV/PI染色法观察细胞毒杀效果。

结果如图1-2所示，如图1(a)-图1(b)所示，在急性T细胞白血病患者中有73％的肿瘤细胞高度表达CD117；如图2(a)-图2(b)所示，在急性髓系白血病患者中，有49.2％的肿瘤细胞高度表达CD117。可得，本发明选用的CD117作为嵌合抗原受体的靶点具有强的特异性，能够快速、准确的识别并毒杀淋巴白血病细胞。

实施例5 CAR-T细胞的体外肿瘤杀伤

(1)将对照T细胞、Mesothelin CAR T和制备的CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养，置于37度5％CO2培养箱共培养18h；

(2)体外评估CAR-T细胞对癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP；

结果如图3(a)-图3(b)所示，从图3(a)可以看出，肿瘤细胞与T细胞共培养后，所示肿瘤细胞的比例为52.7％，从图3(b)可以看出，肿瘤细胞与Mesothelin CAR T细胞共培养后，所示肿瘤细胞的比例略有降低，为35.5％，从图3(c)可以看出，肿瘤细胞与制备的CAR-T细胞共培养后，所示肿瘤细胞的比例减少为16.7％，可见本申请制备的CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果最好。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体的CD117肿瘤表面抗原不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市免疫基因治疗研究院

<120> 一种基于CD117的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly

115 120 125

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Ala Ile Gln

130 135 140

Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala

180 185 190

Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245

<210> 2

<211> 1058

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

35 40 45

Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr

65 70 75 80

Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys

85 90 95

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp

100 105 110

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr

115 120 125

Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser

145 150 155 160

Thr Lys Gly Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

165 170 175

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile

180 185 190

Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser

245 250 255

Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala

260 265 270

Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

275 280 285

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

290 295 300

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

305 310 315 320

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

325 330 335

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

340 345 350

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

355 360 365

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn

385 390 395 400

Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys

405 410 415

Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg

420 425 430

Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Val

450 455 460

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

465 470 475 480

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

485 490 495

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly

500 505 510

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

515 520 525

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

530 535 540

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

545 550 555 560

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

565 570 575

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

580 585 590

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

595 600 605

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

610 615 620

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly Ala Thr

625 630 635 640

Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

645 650 655

Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr

660 665 670

Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu

675 680 685

Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe

690 695 700

Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly

705 710 715 720

Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro

725 730 735

Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His

740 745 750

Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly

755 760 765

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly Ala Leu Glu Ser

770 775 780

Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys

785 790 795 800

Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly

805 810 815

Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg

820 825 830

Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr

835 840 845

Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His

850 855 860

Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln

865 870 875 880

Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys

885 890 895

Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys

900 905 910

Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly

915 920 925

Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu

930 935 940

Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln

945 950 955 960

Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro

965 970 975

Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val

980 985 990

Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp

995 1000 1005

Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu

1010 1015 1020

Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys

1025 1030 1035

Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe

1040 1045 1050

Lys Thr Ser Ala Ser

1055

<210> 3

<211> 3177

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atcccccagg tgcagctggt gcagagcggc gccgccgtga agaagcccgg cgagagcctg 120

aagatcagct gcaagggcag cggctacaga ttcaccagct actggatcgg ctgggtgaga 180

cagatgcccg gcaagggcct ggagtggatg ggcatcatct accccggcga cagcgacacc 240

agatacagcc ccagcttcca gggccaggtg accatcagcg ccggcaagag catcagcacc 300

gcctacctgc agtggagcag cctgaaggcc agcgacaccg ccatgtacta ctgcgccaga 360

cacggcagag gctacaacgg ctacgagggc gccttcgaca tctggggcca gggcaccatg 420

gtgaccgtga gcagcggcag caccagcggc agcggcaagc ccggcagcag cgagggcagc 480

accaagggcg ccatccagct gacccagagc cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac 540

agagtgacca tcacctgcag agccagccag ggcatcagca gcgccctggc ctggtaccag 600

cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg atctacgacg ccagcagcct ggagagcggc 660

gtgcccagca gattcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 720

ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt tcaacagcta ccccctgacc 780

ttcggcggcg gcaccaaggt ggagatcaag gccgccgcca tcgaggtgat gtaccccccc 840

ccctacctgg acaacgagaa gagcaacggc accatcatcc acgtgaaggg caagcacctg 900

tgccccagcc ccctgttccc cggccccagc aagcccttct gggtgctggt ggtggtgggc 960

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgaga 1020

agcaagagaa gcagactgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag aagacccggc 1080

cccaccagaa agcactacca gccctacgcc ccccccagag acttcgccgc ctacagaagc 1140

gccagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagccaga gaagaaagta cagaagcaac 1200

aagggcgaga gccccgtgga gcccgccgag ccctgccact acagctgccc cagagaggag 1260

gagggcagca ccatccccat ccaggaggac tacagaaagc ccgagcccgc ctgcagcccc 1320

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc accagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1380

ggcagcgtgg tgaagagagg cagaaagaag ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1440

agacccgtgc agaccaccca ggaggaggac ggctgcagct gcagattccc cgaggaggag 1500

gagggcggct gcgagctggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1560

agcagagtga agttcagcag aagcgccgac gcccccgcct accagcaggg ccagaaccag 1620

ctgtacaacg agctgaacct gggcagaaga gaggagtacg acgtgctgga caagagaaga 1680

ggcagagacc ccgagatggg cggcaagccc agaagaaaga acccccagga gggcctgtac 1740

aacgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1800

agaagaagag gcaagggcca cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1860

acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccccagaa ccagcggcag cggcgccacc 1920

aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaggaga accccggccc catgggcgtg 1980

caggtggaga ccatcagccc cggcgacggc agaaccttcc ccaagagagg ccagacctgc 2040

gtggtgcact acaccggcat gctggaggac ggcaagaagg tggacagcag cagagacaga 2100

aacaagccct tcaagttcat gctgggcaag caggaggtga tcagaggctg ggaggagggc 2160

gtggcccaga tgagcgtggg ccagagagcc aagctgacca tcagccccga ctacgcctac 2220

ggcgccaccg gccaccccgg catcatcccc ccccacgcca ccctggtgtt cgacgtggag 2280

ctgctgaagc tggagggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgc catggtgggc 2340

gccctggaga gcctgagagg caacgccgac ctggcctaca tcctgagcat ggagccctgc 2400

ggccactgcc tgatcatcaa caacgtgaac ttctgcagag agagcggcct gagaaccaga 2460

accggcagca acatcgactg cgagaagctg agaagaagat tcagcagcct gcacttcatg 2520

gtggaggtga agggcgacct gaccgccaag aagatggtgc tggccctgct ggagctggcc 2580

agacaggacc acggcgccct ggactgctgc gtggtggtga tcctgagcca cggctgccag 2640

gccagccacc tgcagttccc cggcgccgtg tacggcaccg acggctgccc cgtgagcgtg 2700

gagaagatcg tgaacatctt caacggcacc agctgcccca gcctgggcgg caagcccaag 2760

ctgttcttca tccaggcctg cggcggcgag cagaaggacc acggcttcga ggtggccagc 2820

accagccccg aggacgagag ccccggcagc aaccccgagc ccgacgccac ccccttccag 2880

gagggcctga gaaccttcga ccagctggac gccatcagca gcctgcccac ccccagcgac 2940

atcttcgtga gctacagcac cttccccggc ttcgtgagct ggagagaccc caagagcggc 3000

agctggtacg tggagaccct ggacgacatc ttcgagcagt gggcccacag cgaggacctg 3060

cagagcctgc tgctgagagt ggccaacgcc gtgagcgtga agggcatcta caagcagatg 3120

cccggctgct tcaacttcct gagaaagaag ctgttcttca agaccagcgc cagctga 3177

<210> 4

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro

20 25 30

Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His

35 40 45

Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp

50 55 60

Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg

65 70 75 80

Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly

100 105 110

Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys

115 120 125

Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val

130 135 140

Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe

165 170 175

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys

180 185 190

Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val

195 200 205

Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu

210 215 220

Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu

225 230 235 240

Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr

245 250 255

Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe

275 280 285

Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala

290 295 300

Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp

305 310 315 320

Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala

325 330 335

Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr

340 345 350

Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr

355 360 365

Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp

370 375 380

Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly

385 390 395 400

Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu

405 410 415

Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

420

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20