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1、10申请公布号CN102002504A43申请公布日20110406CN102002504ACN102002504A21申请号201010506900522申请日20101014C12N15/29200601C12N15/82200601C12N15/6620060171申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号72发明人朱月林盖钧镒陈罡杨立飞74专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218代理人徐冬涛54发明名称野生茄子耐盐基因STBADH基因及其植物表达载体57摘要本发明属于分子生物学领域，涉及野生茄子耐盐基因STBADH及其植物表达载体。本发明所述的野生茄子耐盐基。
2、因STBADH序列为SEQIDNO1。该基因的植物表达载体是将该STBADH插入到由PBI220中的小片段与PCAMBIA1301中的大片段连接得到中间载体PCAMBIA1301BI220的SMAI/SACI酶切位点间得到的。将该植物表达载体用于农作物遗传转化，大量合成甜菜碱生物合成的关键酶，将会提高其耐盐碱能力。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图3页CN102002515A1/1页21野生茄子耐盐基因STBADH，其特征在于该基因的序列为SEQIDNO1。2野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的野生茄子耐。
3、盐基因STBADH与植物表达载体构成。3根据权利要求2所述的野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为分别用HINDIII/ECORI双酶切植物载体PBI220和PCAMBIA1301，回收PBI220中的1250BP的小片段与PCAMBIA1301中的11787BP的大片段，连接得到的中间载体PCAMBIA1301BI220。4权利要求2所述的野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤1）野生茄子耐盐基因STBADH的克隆选用野生茄子作为试验材料，取幼嫩叶片，提取总RNA，取其2G反转录CDNA，用RNASE消化CDNA产物，根据。
4、NCBI上公布的番茄（SOLANUMLYCOPERSICUM）AMADH2序列信息设计特异引物，进行高保真聚合酶链式PCR反应，在合成的野生茄子叶片CDNA中扩增含SMAI和SACI两个酶切位点的STBADH，PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化；2）STBADH加多聚腺苷酸POLYA尾反应按照DNAATAILING试剂盒说明，以步骤1）得到的PCR纯化产物为反应底物，在STBADH基因3端加上多聚腺苷酸POLYA尾；STBADH加POLYA尾反应的产物连入PMD19T载体中，转化TOP10感受态细胞，测序验证，得到PMDSTBADH；3）中间载体PCAMBIA1301BI220的构建植物载体P。
5、BI220与PCAMBIA1301分别HINDIII/ECORI双酶切，回收PBI220中1250BP的小片段与PCAMBIA1301中11787BP的大片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒提取纯化，HINDIII/ECORI双酶切验证，得到构建成功的中间载体PCAMBIA1301BI220；4）STBADH植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220的构建含SMAI和SACI两个酶切位点的PMDSTBADH与中间载体PCAMBIA1301BI220分别SMAI/SACI双酶切，回收PMDSTBADH中1526BP。
6、的小片段与PCAMBIA1301BI220中13029BP的大片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒提取纯化，SMAI/SACI双酶切验证，得到构建成功的植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220。权利要求书CN102002504ACN102002515A1/5页3野生茄子耐盐基因STBADH基因及其植物表达载体技术领域0001本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及了一个野生茄子耐盐基因STBADH基因及其植物表达载体。背景技术0002土壤盐渍化对农业生产的威胁是一个全球性的热点问题，也是当前我国农业经济发展所面。
7、临的生态危机之一。而且由于受全球气候变暖、工业污染加剧和化肥施用不当等因素影响，每年盐渍化和次生盐渍化都在不断加重，农作物的产量和品质受到严重影响。如何提高农作物耐盐性，增加农作物的产量和提高农作物的品质，已经成为一个世界性的热点问题。0003在盐等渗透胁迫条件下，许多植物如甜菜、菠菜，都积累甜菜碱（BETAINE）。甜菜碱被认为是植物抗渗透胁迫最有效的渗透调节剂（参考文献TARCZYNSKIMC,JENSENRGSTRESSPROTECTIONOFTRANSGENICTOBACCOBYPRODUCTIONOFTHEOSMOLYTEMANNITOLSCIENCE1993,259508510）。。
8、作为渗透调节物质，甜菜碱在植物体内由胆碱经两步不可逆的氧化合成，催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶CHOLINEMONOOXYGENASE，CMO和甜菜碱醛脱氢酶BETAINEALDEHYDEDEHYDROGENASE，BADH；其中BADH是合成甜菜碱的关键酶，催化甜菜碱醛氧化为甜菜碱（参考文献RHODESD,HANSONADQUARTERNARYAMMONIUMANDTERTIARYSULFONIUMCOMPOUNDSINHIGHERPLANTSANNUALREVIEWOFPLANTPHYSIOLOGYANDPLANTMOLECULARBIOLOGY1993,44357384）。由于植。
9、物体内甜菜碱的合成途径相对简单，进行遗传操作方便，在诸多耐盐基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有应用价值的耐盐基因之一（参考文献NAKAMURAT,NOMURAM,MORIH,JAGENDORFAT,UEDAA,TAKABETANISOZYMEOFBETAINEALDEHYDEDEHYDROGENASEINBARLEYPLANTCELLPHYSIOLOGY2001,421010881092）。植物中导入耐盐基因BADH，其耐盐性得到明显提高已有诸多报道ZHANG等（2009）从菠菜中克隆了BADH基因（GENBANK登录号AY156694），构建了组成型启动子CAMV35S启动的BADH基因植物。
10、表达载体转化马铃薯，结果显示BADH酶活性增强，对植株细胞膜通透性的保护能力增强，转基因植株耐盐性比对照植株显著增强（参考文献ZHANGN,SIHJ,LIL,YANGT,ZHANGCF,WANGDDROUGHTANDSALINITYTOLERANCEINTRANSGENICPOTATOEXPRESSINGTHEBETAINEALDEHYDEDEHYDROGENASEGENEACTAAGRONOMICASINICA2009,35611461150）。JIA等（2002）构建了含山菠菜甜菜碱醛脱氢酶BADH基因的重组双元植物表达载体PBIN438，由农杆菌介导对番茄进行遗传转化，120MMOLL1。
11、NACL培养条件下，获得转基因番茄中的甜菜碱脱氢酶活性和BADHMRNA积累量显著高于野生型品种，转基因番茄对于高浓度盐胁迫表现出较强的耐受性（参考文献JIAGX,ZHUZQ,CHANGFQ,LIYXTRANSFORMATIONOFTOMATOWITHTHEBADHGENEFROMATRIPLEXIMPROVESSALTTOLERANCEPLANTCELLREPORTS2002,21141146）。0004目前应用于植物的遗传转化方法中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，说明书CN102002504ACN102002515A2/5页4其中选择合适的植物表达载体至关重要。克隆耐盐基因并连接到。
12、适宜的植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的农作物遗传转化，提高转基因农作物的耐盐性，创造农作物耐盐新种质，对于进一步培育耐盐新品系提供重要理论基础。野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体的构建方法在提高农作物耐盐性育种方面具有广阔的应用前景。发明内容0005本发明为解决提高农作物耐盐性的问题，提供一种新的野生茄子耐盐基因STBADH。0006本发明还提供该耐盐基因STBADH的植物表达载体及其构建方法。构建的野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作物遗传转化，创制耐盐新种质，提高盐敏感农作物的耐盐性，可用于农作物品种改良。0007本发明的技术问题可通过如下技术。
13、方案解决野生茄子耐盐基因STBADH，该基因的序列为SEQIDNO1。0008野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体，由本发明所述的野生茄子耐盐基因STBADH与植物表达载体构成。0009其中，所述的植物表达载体优选中间载体PCAMBIA1301BI220，该载体是通过分别用HINDIII/ECORI双酶切植物载体PBI220和PCAMBIA1301，回收PBI220中1250BP的小片段与PCAMBIA1301中11787BP的大片段，连接所述两个片段得到的。0010野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体的构建方法，包括如下步骤1）野生茄子耐盐基因STBADH的克隆选用野生茄子作为试验材。
14、料，取幼嫩叶片，提取总RNA，取其2G反转录CDNA，用RNASE消化CDNA产物，根据NCBI上公布的番茄（SOLANUMLYCOPERSICUM）AMADH2序列信息设计特异引物，进行高保真聚合酶链式PCR反应，在合成的野生茄子叶片CDNA中扩增含SMAI和SACI两个酶切位点的STBADH，PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化；2）STBADH加多聚腺苷酸POLYA尾反应按照DNAATAILING试剂盒说明，以步骤1）得到的PCR纯化产物为反应底物，在STBADH基因3端加上多聚腺苷酸POLYA尾；STBADH加POLYA尾反应的产物连入PMD19T载体中，转化TOP10感受态细胞，测序验。
15、证，得到PMDSTBADH；3）中间载体PCAMBIA1301BI220的构建植物载体PBI220与PCAMBIA1301分别HINDIII（PROMEGA）/ECORI（PROMEGA）双酶切，回收PBI220中1250BP的小片段与PCAMBIA1301中11787BP的大片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒提取纯化，HINDIII（PROMEGA）/ECORI（PROMEGA）双酶切验证，得到构建成功的中间载体PCAMBIA1301BI220；4）STBADH植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220的构建。
16、含SMAI和SACI两个酶切位点的PMDSTBADH与中间载体PCAMBIA1301BI220分别SMAI（PROMEGA）/SACI（PROMEGA）双酶切，回收PMDSTBADH中1526BP的小片段与PCAMBIA1301BI220中13029BP的大片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒提取纯化，SMAI（PROMEGA）/SACI（PROMEGA）说明书CN102002504ACN102002515A3/5页5双酶切验证，得到构建成功的植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220。0011有益效果1本发明提。
17、供的野生茄子耐盐基因STBADH是一种新的耐盐基因，该基因提高农作物耐盐性。00122本发明构建的野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体为野生茄子中首次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作物遗传转化，创制耐盐新种质，提高盐敏感农作物的耐盐性，可进行农作物品种改良。00133本发明构建的野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体，使得生物体能快速有效的产生相应的表型性状，从而可确定对应基因的功能，且具有特异性、高效性和广泛性的优势。0014四、附图说明图1质粒PBI220HINDIII/ECORI双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析1PBI220/HINDIII/ECORI2PBI220质粒31KBP。
18、DNAMARKER（TAKARA）图2质粒PCAMBIA1301HINDIII/ECORI双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析11KBPDNAMARKER（TAKARA）2PCAMBIA1301/HINDIII/ECORI3PCAMBIA1301/HINDIII/ECORI4PCAMBIA1301质粒图3质粒PMDSTBADH及其PCAMBIA1301BI220SMAI/SACI双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析1DL2000DNAMARKER（TAKARA）2PMDSTBADH/SMAI/SACI3PMDSTBADH/SMAI/SACI4PMDSTBADH/SMAI/SACI5PMDSTBADH/SMAI。
19、/SACI6PMDSTBADH质粒71KBPDNAMARKER（TAKARA）8PCAMBIA1301BI220/SMAI/SACI9PCAMBIA1301BI220/SMAI/SACI10PCAMBIA1301BI220质粒图4野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体质粒图谱。0015五、具体实施方式1野生茄子耐盐基因STBADH植物表达载体的构建1）野生茄子耐盐基因STBADH的克隆选用野生茄子（SOLANUMTORVUMSWARTZ）TORVUMVIGOR（为日本砧木品种，购自日本TAKII种苗株式会社）作为试验材料，幼苗长至45片真叶时，进行100MMOLL1NACL胁迫处理，连续处理。
20、5天，取幼嫩叶片，按照TOTALRNA提取试剂盒（TAKARA）说明提取总RNA，按说明书CN102002504ACN102002515A4/5页6照东洋纺（上海）生物技术有限公司CDNA合成试剂盒REVERTRAACETM说明取2G总RNA反转录成CDNA，用RNASE（TAKARA）消化CDNA产物。根据NCBI上公布的番茄AMADH2的序列信息（GENBANK登录号FJ2284821），经PRIMERPREMIER5软件（加拿大PREMIER公司）分析设计特异引物，上游引物序列为SEQIDNO2，下游引物序列为SEQIDNO3，进行高保真PCR反应，在野生茄子叶片CDNA中扩增含SMAI。
21、和SACI两个酶切位点的STBADH。0016高保真PCR扩增体系CDNA模板10L（60NG），5PRIMESTARTMBUFFER40L（MG2PLUS,5MG2浓度为5MMOLL1），DNTPMIXTURE16L（各25MMOLL1），M110L（10MOLL1），M210L（10MOLL1），PRIMESTARTMHSENZYME04L，DDH2O11L；高保真PCR扩增程序95预变性5MIN，98变性10S，550退火15S，72延伸1MIN40S，30个循环后，72总延伸5MIN；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收纯化；2）STBADH加多聚腺苷酸POLY（A）尾反应按。
22、照DNAATAILING试剂盒（TAKARA）说明，以步骤1）回收纯化得到的PCR产物为反应底物，反应体系10ATAILINGBUFFER2L，DNTPMIXTURE16L（各25MMOLL1），ATAILINGENZYME02L，STBADH回收液10L（2G），DDH2O62L；反应程序为72反应20MIN，冰中静置2MIN；STBADH加POLY（A）尾反应的产物连入PMD19T载体（TAKARA）中，连接反应体系（10L）PMD19T载体1L，STBADH加POLY（A）尾反应的产物4L，SOLUTIONI5L；16过夜反应，取10L连接产物转化TOP10感受态细胞（南京天为生物技术有。
23、限公司），在含有5溴4氯3吲哚D硫代半乳糖苷（XGAL）、异丙基硫代D半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（AMP）的LB琼脂平板培养基（南京基天生物技术有限责任公司）上37过夜培养，挑取阳性单克隆（白色菌落），在含有氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基（南京基天生物技术有限责任公司）中37过夜扩大培养后，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒（AXYGEN）提取纯化，测序验证，得到PMDSTBADH；3）中间载体PCAMBIA1301BI220的构建。0017植物载体PBI220（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）与PCAMBIA1301（澳大利亚国际农业分子生物学应用中心）分别HINDIII。
24、（PROMEGA）/ECORI（PROMEGA）双酶切，回收PBI220中的小片段（1250BP）与PCAMBIA1301中的大片段（11787BP），按41的比例用T4DNA连接酶（TAKARA）连接，连接产物转化TOP10感受态细胞（南京天为生物技术有限公司），质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒（AXYGEN）提取纯化，进行双酶切验证取植物载体PBI220与PCAMBIA1301各15L，分别用HIND（PROMEGA）和ECOR（PROMEGA）双酶切，50L酶切反应体系10EBUFFER5L，100BSA05L，质粒PBI220或PCAMBIA130115L（1G），HINDII。
25、I125L，ECORI125L，补DDH2O至50L，37反应3H；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（图12），用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收PBI220中的小片段与PCAMBIA1301中的大片段；用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收PBI220中的小片段（1250BP）与PCAMBIA1301中的大片段（11787BP），按41的比例用T4DNA连接酶（TAKARA）连接，连接反应体系（25L）说明书CN102002504ACN102002515A5/5页710T4LIGASEBUFFER25L，PBI220小片段8L，PCAMBIA1301大片段2L，T4DNA连接酶1L，DDH2O。
26、115L；16过夜连接反应，取10L连接产物转化TOP10感受态细胞（南京天为生物技术有限公司），在含有5溴4氯3吲哚D硫代半乳糖苷（XGAL）、异丙基硫代D半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（AMP）的LB琼脂平板培养基（南京基天生物技术有限责任公司）上37过夜培养，挑取阳性单克隆（白色菌落），在含有氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基（南京基天生物技术有限责任公司）中37过夜扩大培养后，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒（AXYGEN）提取纯化，HINDIII（PROMEGA）/ECORI（PROMEGA）双酶切验证，得到构建成功的中间载体PCAMBIA1301BI220；4）植物表达。
27、载体PCAMBIA1301STBADHBI220的构建含SMAI和SACI两个酶切位点的PMDSTBADH与中间载体PCAMBIA1301BI220分别SMAI（PROMEGA）/SACI（PROMEGA）双酶切，回收PMDSTBADH中的小片段（1526BP）与PCAMBIA1301BI220中的大片段（13029BP），按41的比例用T4DNA连接酶（TAKARA）连接，连接产物转化TOP10感受态细胞（南京天为生物技术有限公司），质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒（AXYGEN）提取纯化，进行双酶切验证取质粒PMDSTBADH与PCAMBIA1301BI220各15L，分别用SMA。
28、I（PROMEGA）/SACI（PROMEGA）双酶切，50L酶切反应体系MULTICOREBUFFER5L，100BSA05L，质粒PMDSTBADH或PCAMBIA1301BI22015L1G，SMAI125L，补DDH2O至50L，25反应3H；65保温10MIN，待冷却后再加入SACI125L，37反应3H；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（图3），用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收PMDSTBADH中的小片段与PCAMBIA1301BI220中的大片段；用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收PMDSTBADH中的小片段（1526BP）与PCAMBIA1301BI220中的大片段（130。
29、29BP），按41的比例用T4DNA连接酶（TAKARA）连接，连接反应体系（25L）10T4LIGASEBUFFER25L，PMDSTBADH小片段8L，PCAMBIA1301BI220大片段2L，T4DNA连接酶1L，DDH2O115L；16过夜连接反应，取10L连接产物转化TOP10感受态细胞（南京天为生物技术有限公司），在含有5溴4氯3吲哚D硫代半乳糖苷（XGAL）、异丙基硫代D半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（AMP）的LB琼脂平板培养基（南京基天生物技术有限责任公司）上37过夜培养，挑取阳性单克隆（白色菌落），在含有氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基（南京基天生物技术有限责任公司。
30、）中37过夜扩大培养后，质粒用AXYPREP质粒DNA小量试剂盒（AXYGEN）提取纯化，SMAI（PROMEGA）/SACI（PROMEGA）双酶切验证，得到构建成功的植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220，图谱见图4。0018综上所述，本发明构建的野生茄子耐盐基因STBADH基因及该基因的植物表达载体PCAMBIA1301STBADHBI220为野生茄子中首次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作物遗传转化，提高盐敏感农作物耐盐性，消除盐碱地逆境对盐敏感农作物的危害，可进行农作物品种改良。说明书CN102002504ACN102002515A1/3页8图1说明书附图CN102002504ACN102002515A2/3页9图2图3说明书附图CN102002504ACN102002515A3/3页10图4说明书附图CN102002504A。