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1、(10)授权公告号 CN 102690370 B (45)授权公告日 2013.12.25 CN 102690370 B *CN102690370B* (21)申请号 201110427728.9 (22)申请日 2011.12.20 C07K 1/36(2006.01) C08B 37/08(2006.01) C12P 21/06(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 14/78(2006.01) (73)专利权人 浙江省海洋开发研究院 地址 316100 浙江省舟山市普陀区东海西路 2119 号 (72)发明人 付万冬 廖妙飞 钟明杰 郑斌 周宇芳 (74)专利。
2、代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 CN 101711591 A,2010.05.26, 全文 . 王燕等 . 酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白 . 食品科 技 .2011, 第 36 卷 ( 第 6 期 ), 第 150-155 页 . 张虹等 . 鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质 研究 . 中国食品学报 .2009, 第 9 卷 ( 第 6 期 ), 第 34-39 页 . (54) 发明名称 一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺 (57) 摘要 本发明涉及水产动物加工副产物来源的海洋 活性物质制备领域， 目的在于提供一种简便、 快 速、 提取率高的海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺。
3、。 本 发明包括原料处理、 鱼骨粉碎、 硫酸软骨素提取、 滤液酶解除蛋白、 高温灭酶活、 硫酸软骨素沉淀、 滤渣去除脂肪、 胶原蛋白提取、 胶原蛋白盐析、 胶 原蛋白收集和胶原蛋白透析和冻干等工艺步骤。 本发明简便、 快速、 提取率高， 达到硫酸软骨素和 胶原蛋白联产目的。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵雪 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 102690370 B CN 102690370 B *CN102690370B* 1/2 页 2 1. 一种海洋鱼类鱼骨。
4、的综合利用工艺， 其特征在于 ： 所述的综合利用工艺包括如下步 骤 ： （1） 原料处理 ： 将新鲜海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净， 在 40-50热水中清洗干净 ； （2） 鱼骨粉碎 ： 在步骤 （1） 处理得到的鱼骨中加入 NaOH 溶液， 同时加入 NaCl 溶液， 用粉 碎机将鱼骨粉碎， 形成粉碎液 ； 所述的 NaOH 溶液加入量为步骤 （1） 处理得到的鱼骨重量的 10%-15%， NaOH 溶液的浓度为 0.5-1.0 mol/L ； 所述的 NaCl 溶液加入量为步骤 （1） 处理得到 的鱼骨重量的 200%-300%， NaCl 溶液的质量浓度为 10%-15% ； （3） 硫酸软。
5、骨素提取 ： 将步骤 （2） 处理得到的粉碎液， 在 50-58下搅拌浸提 6-8 h， 过 滤， 所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤， 合并两次过滤的滤液得浸提滤液， 同时收集 第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白 ； （4） 滤液酶解除蛋白 ： 将步骤 （3） 所得浸提滤液用 3-4 mol/L 的盐酸调 pH 至 7.0-7.5， 加入浸提滤液重量 0.5%-1% 的中性蛋白酶， 在 45-55下保温搅拌 2-3 h 得酶解液 ； （5） 高温灭酶活 ： 将步骤 （4） 所得酶解液加热至 95-100， 保温 5-10 min 灭酶活 ； （6） 硫酸软骨素沉淀 ： 搅拌条件下向。
6、步骤 （5） 处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系 中乙醇体积分数为60-65%， 在0-4静置18-24 h， 离心15-20 min收集沉淀， 沉淀用无水乙 醇洗涤， 真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品 ； （7） 滤渣去除脂肪 ： 向步骤 （3） 第二次过滤得到的滤渣以重量比 1:20-30 的比例加入 质量浓度 10%-15% 的丁醇溶液， 搅拌条件下浸泡 18-24 h， 浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁 醇 ； （8） 胶原蛋白提取 ： 向步骤 （7） 处理所得滤渣以重量比 1:10-15 的比例加入蒸馏水， 调 节 pH 至 7.0-7.5， 加入滤渣重量 1%-2% 的中性蛋白酶， 在 4。
7、5-55下保温搅拌 4-5 h 得酶解 液， 然后将酶解液加热至 95-100保温 5-10min 灭酶活 ； （9） 胶原蛋白盐析 ： 将步骤 （8） 处理得到的酶解液在温度 0-4下离心 15-20 min， 收集 上清液， 向上清液中缓慢加入 NaCl 盐析， 在温度 0-4下， 搅拌过夜得盐析液 ； NaCl 的加入 量为至上清液中 NaCl 的浓度为 0.8-1.2mol/L ； （10） 胶原蛋白收集 ： 将步骤 （9） 处理得到的盐析液在 0-4下离心 15-20 min， 去除上 清液， 所得沉淀物为胶原蛋白粗品 ； （11） 胶原蛋白透析和冻干 ： 向步骤 （10） 所得胶原。
8、蛋白粗品中加入浓度 0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶， 然后先使用浓度0.1-0.2 mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析24-36 h， 再使用蒸馏水作为透析外液透析 24-36 h， 冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。 2.根据权利要求1所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所 述的海洋鱼类鱼骨选自 A 或 B 方案 ： A、 海洋软骨鱼的鱼骨 ： 鲨科、 鳐科、 魟科、 鲼科和银鲛科鱼类的鱼骨中的一种 ； B、 部分含有软骨的硬骨鱼类的鱼骨 ： 鮟鱇鱼、 鳗鱼中的一种。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 其特征。
9、在于 ： 步骤 （3） 中所述的过滤采用 150-200 目的滤布过滤。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 其特征在于 ： 步骤 （6） 所述的离心的离心力为 6000-8000g。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 其特征在于 ： 步骤 权 利 要 求 书 CN 102690370 B 2 2/2 页 3 （9） 所述的离心的离心力为 3000-4000g。 6. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 其特征在于 ： 步骤 （10） 所述的离心的离心力为 5000-6000g。 权 利 要。
10、 求 书 CN 102690370 B 3 1/5 页 4 一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺 技术领域 0001 本发明涉及水产动物加工副产物来源的海洋活性物质制备领域， 特别涉及一种海 洋鱼类鱼骨的综合利用工艺。 背景技术 0002 硫酸软骨素 （Chondroitin Sulfate, CS） 是一类糖胺聚糖， 它是由 D- 葡糖醛酸和 N- 乙酰 -D- 氨基半乳糖以 1,3 糖苷键结合的双糖为基本单位聚合而成的大分子多糖。CS 资源丰富， 广泛存在于人和动物的骨骼、 软骨、 肌腱、 韧带等组织中。CS 作为一种药物， 主要 用来治疗关节炎和冠心病， 对神经痛、 偏头痛、 动脉粥样硬化等也。
11、有一定疗效。硫酸软骨素 传统上主要从猪、 牛、 羊等畜类软骨组织中提取获得， 来源和工艺较为单一。 0003 胶原蛋白是动物来源最丰富的蛋白， 大概占动物总蛋白的30%。 广泛存在于脊椎动 物的皮、 骨、 软骨、 韧带、 肌腱、 血管、 牙齿、 角膜及其它器官。 胶原蛋白在皮革、 化妆品、 食品、 膜工业、 制药业、 生物医学材料等方面应用广泛。牛和猪的皮、 骨头通常是胶原蛋白的主要 来源， 然而， 牛海绵状脑病 （BSE） 、 传染性海绵状脑病 （TSE） 和口蹄疫 （FMD） 的爆发使得人 们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生恐慌。 另外， 由于宗教因素， 从猪 来源提取的胶。
12、原蛋白作为食物的组分， 其应用受到限制。因此寻找可替代的新的来源的胶 原蛋白就显得非常迫切。 0004 水产品加工副产物约有 30% 为鱼皮和鱼骨， 其中鱼骨含有较为丰富的胶原蛋白和 硫酸软骨素， 利用这些副产物来提取胶原蛋白和硫酸软骨素， 不仅能提高水产品的附加 值， 充分有效地利用生物资源， 而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。 0005 CN1563098A 的发明公开了一种制备硫酸软骨素的方法， 该方法包括以下步骤 ： A、 将卡拉胶分解为分子量为1-4万， 优选2-3万的卡拉胶寡糖 ； B、 将鱿鱼骨用15%到饱和的强 碱液处理， 然后用酸中和， 收集胶体 ； C、 将。
13、步骤A制得的卡拉胶寡糖、 步骤B制得的胶体和氨 基葡萄糖在酸性条件下反应， 再纯化， 获得硫酸软骨素。 该方法利用海洋鱼类加工副产物鱼 骨 （鱿鱼骨） 单一地提取硫酸软骨素， 但未综合利用海洋鱼类鱼骨， 并且硫酸软骨素提取效 率不高， 工艺较为复杂。因此， 开发综合利用海洋鱼类鱼骨的工艺显得非常迫切。 发明内容 0006 本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题， 提供一种简便、 快速、 提取率高 的海洋鱼类鱼骨综合利用工艺， 达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的。 0007 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 0008 一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺， 所述的综合利用工艺包括如下步骤 。
14、： 0009 （1） 原料处理 ： 将新鲜海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净， 在 40-50热水中清洗干净 ； 用 40-50热水清洗便于清洗鱼骨表面的脂肪 ； 0010 （2） 鱼骨粉碎 ： 在步骤 （1） 处理得到的鱼骨中加入 NaOH 溶液， 同时加入 NaCl 溶液， 用粉碎机将鱼骨粉碎， 形成粉碎液 ； 加入 NaOH 溶液用于水解硫酸软骨素， 加入氯化钠， 以使 说 明 书 CN 102690370 B 4 2/5 页 5 硫酸软骨素等糖胺聚糖与蛋白分离 ； 鱼骨粉碎能更好、 更高效地提取硫酸软骨素， 鱼骨粉碎 标准在 20-30 目 ； 0011 （3） 硫酸软骨素提取 ： 将步骤 （2。
15、） 处理得到的粉碎液， 在 50-58下搅拌浸提 6-8 h， 过滤， 所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤， 合并两次过滤的滤液得浸提滤液， 同时 收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白 ； 搅拌浸提， 这样更利于硫酸软骨素 的提取， 提高提取率， 进行二次提取， 使得鱼骨能够充分的提取利用， 提高硫酸软骨素产率， 增加经济效益 ； 50-58下提取， 温度过高会破坏硫酸软骨素和胶原蛋白的结构， 温度过低 提取效率太低 ； 0012 （4）滤液酶解除蛋白 ： 将步骤 （3）所得浸提滤液用 3-4 mol/L 的盐酸调 pH 至 7.0-7.5， 加入浸提滤液重量 0.5%-1% 的中。
16、性蛋白酶， 在 45-55下保温搅拌 2-3 h 得酶解 液 ； 控制 pH 至 7.0-7.5， 适合酶解， 提高硫酸软骨素的纯度和产率 ； 0.5%-1% 的中性蛋白酶 酶解， 能去除混合在硫酸软骨素中的杂蛋白， 得到较高纯度的硫酸软骨素 ； 0013 （5） 高温灭酶活 ： 将步骤 （4） 所得酶解液加热至 95-100， 保温 5-10 min 灭酶活 ； 0014 （6） 硫酸软骨素沉淀 ： 搅拌条件下向步骤 （5） 处理得到的酶解液中加无水乙醇至 体系中乙醇体积分数为60-65%， 在0-4静置18-24 h， 离心15-20 min收集沉淀， 沉淀用无 水乙醇洗涤， 真空冷冻干燥。
17、得硫酸软骨素产品 ； 0015 （7） 滤渣去除脂肪 ： 向步骤 （3） 第二次过滤得到的滤渣以重量比 1:20-30 的比例加 入质量浓度 10%-15% 的丁醇溶液， 搅拌条件下浸泡 18-24 h， 浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽 丁醇 ； 搅拌条件下浸泡有利于脂肪的溶出， 以去除脂肪， 去除脂肪利于胶原蛋白提取， 提高 胶原蛋白的产率 ； 0016 （8） 胶原蛋白提取 ： 向步骤 （7） 处理所得滤渣以重量比 1:10-15 的比例加入蒸馏 水， 调节 pH 至 7.0-7.5， 加入滤渣重量 1%-2% 的中性蛋白酶， 在 45-55下保温搅拌 4-5 h 得酶解液， 然后将酶解液加热。
18、至 95-100保温 5-10min 灭酶活 ； 0017 （9） 胶原蛋白盐析 ： 将步骤 （8） 处理得到的酶解液在温度 0-4下离心 15-20 min， 收集上清液， 向上清液中缓慢加入 NaCl 盐析， 在温度 0-4下， 搅拌过夜得盐析液 ； 加入 NaCl盐析NaCl要研磨粉碎后加入， 这样盐析效果好， NaCl的粒度在100-200目 ； 搅拌过夜， 指搅拌时间在 12 小时以上 ； 0018 （10） 胶原蛋白收集 ： 将步骤 （9） 处理得到的盐析液在 0-4下离心 15-20 min， 去 除上清液， 所得沉淀物为胶原蛋白粗品 ； 0019 （11） 胶原蛋白透析和冻干 。
19、： 向步骤 （10） 所得胶原蛋白粗品中加入浓度 0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶， 然后先使用浓度 0.1-0.2 mol/L 的醋酸溶液作为透析外液进行透 析 24-36 h， 再使用蒸馏水作为透析外液透析 24-36 h， 冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。加 入浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶， 浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液加入量为溶解胶 原蛋白粗品的量为标准， 复溶目的是为了进一步除去小分子杂蛋白， 提高胶原蛋白提取的 纯度。透析外液每 4 小时更换一次， 透析效果更好。 0020 本发明能够简便、 快速、 高效的从海洋鱼类鱼骨中提取活性物质， 达到硫。
20、酸软骨素 和胶原蛋白联产目的， 提高了鱼骨的利用效益， 增加了经济效益。 0021 作为优选， 步骤 （1） 所述的海洋鱼类鱼骨选自 A 或 B 方案 ： 0022 A、 海洋软骨鱼的鱼骨 ： 鲨科、 鳐科、 魟科、 鲼科和银鲛科鱼类的鱼骨中的一种 ； 说 明 书 CN 102690370 B 5 3/5 页 6 0023 B、 部分含有软骨的硬骨鱼类的鱼骨 ： 鮟鱇鱼、 鳗鱼中的一种。 0024 本发明鱼骨的原料优选鮟鱇鱼、 鲨科鱼类、 魟科鱼类的鱼骨中的一种。 鲨科、 鳐科、 魟科、 鲼科和银鲛科鱼类， 如姥鲨 （鲨科） 、 华鳐 （鳐科） 、 中国魟 （魟科） 、 鸢鲼 （鲼科） 、 黑。
21、线银鲛 （银鲛科） 。 0025 作为优选， 步骤 （2） 中所述的 NaOH 溶液加入量为步骤 （1） 处理得到的鱼骨重量的 10%-15%， NaOH 溶液的浓度为 0.5-1.0 mol/L。控制 NaOH 溶液的加入量和浓度， 以利于硫酸 软骨素的提取， 提高提取率。 0026 作为优选， 步骤 （2） 中所述的 NaCl 溶液加入量为步骤 （1） 处理得到的鱼骨重量的 200%-300%， NaCl 溶液的质量浓度为 10%-15%。 0027 作为优选， 步骤 （3） 中所述的过滤采用 150-200 目的滤布过滤。 0028 作为优选， 步骤 （9） 中 NaCl 的加入量为至上。
22、清液中 NaCl 的浓度为 0.8-1.2mol/L。 控制 NaCl 的浓度为 0.8-1.2mol/L， 盐析效果好， 利于胶原蛋白的提取。 0029 作为优选， 步骤 （6） 所述的离心的离心力为 6000-8000g。利于分离。 0030 作为优选， 步骤 （9） 所述的离心的离心力为 3000-4000g。利于分离。 0031 作为优选， 步骤 （10） 所述的离心的离心力为 5000-6000g。利于分离。 0032 本发明的有益效果是 ： 能够简便、 快速、 高效的从海洋鱼类鱼骨中提取活性物 质， 达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的， 提高了鱼骨的利用效益， 增加了经济效益。 具体。
23、实施方式 0033 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 0034 实施例 1 0035 （1） 原料处理 ： 将新鲜鮟鱇鱼鱼骨上的残肉剔净， 在 40热水中清洗干净 ； 0036 （2） 鱼骨粉碎 ： 在步骤 （1） 处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量 15% 的 NaOH 溶液， NaOH 溶液的浓度为 0.5mol/L， 同时加入鱼骨重量 200% 的 NaCl 溶液， NaCl 溶液的质量浓度 为 15% ； 用粉碎机将鱼骨粉碎， 形成粉碎液 ； 0037 （3） 硫酸软骨素提取 ： 将步骤 （2） 处理得到的粉碎液， 在 50下搅拌浸提 8 h， 150 目的滤布。
24、过滤， 所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤， 合并两次过滤的滤液得浸提滤 液， 同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白 ； 0038 （4） 滤液酶解除蛋白 ： 将步骤 （3） 所得浸提滤液用 3mol/L 的盐酸调 pH 至 7.0， 加 入浸提滤液重量 1% 的中性蛋白酶， 在 45下保温搅拌 3 h 得酶解液 ； 0039 （5） 高温灭酶活 ： 将步骤 （4） 所得酶解液加热至 95， 保温 10 min 灭酶活 ； 0040 （6） 硫酸软骨素沉淀 ： 搅拌条件下向步骤 （5） 处理得到的酶解液中加无水乙醇至 体系中乙醇体积分数为 60%， 在 0静置 18h， 在离心。
25、力为 6000g 下， 离心 20 min 收集沉 淀， 沉淀用无水乙醇洗涤 2 次， 真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品 ； 0041 （7） 滤渣去除脂肪 ： 向步骤 （3） 第二次过滤得到的滤渣以重量比 1:20 的比例加入 质量浓度 15% 的丁醇溶液， 搅拌条件下浸泡 18h， 浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇 ； 0042 （8） 胶原蛋白提取 ： 向步骤 （7） 处理所得滤渣以重量比 1:10 的比例加入蒸馏水， 调 节 pH 至 7.0， 加入滤渣重量 2% 的中性蛋白酶， 在 45下保温搅拌 5 h 得酶解液， 然后将酶 解液加热至 95保温 10min 灭酶活 ； 说 明 书 CN。
26、 102690370 B 6 4/5 页 7 0043 （9） 胶原蛋白盐析 ： 将步骤 （8） 处理得到的酶解液在温度 0下， 离心力为 4000g 下离心 15 min， 收集上清液， 向上清液中缓慢加入 NaCl 盐析， NaCl 的加入量为至上清液中 NaCl 的浓度为 0.8mol/L， 在温度 4下， 搅拌过夜得盐析液 ； 0044 （10） 胶原蛋白收集 ： 将步骤 （9） 处理得到的盐析液在 0下， 离心力为 6000g 下 离心 15 min， 去除上清液， 所得沉淀物为胶原蛋白粗品 ； 0045 （11） 胶原蛋白透析和冻干 ： 向步骤 （10） 所得胶原蛋白粗品中加入浓度。
27、 0.3 mol/L 的醋酸溶液复溶， 然后先使用浓度 0.1mol/L 的醋酸溶液作为透析外液进行透析 36 h， 再使 用蒸馏水作为透析外液透析 24h， 冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。 0046 实施例 2 0047 （1） 原料处理 ： 将新鲜鳐鱼鱼骨上的残肉剔净， 在 50热水中清洗干净 ； 0048 （2） 鱼骨粉碎 ： 在步骤 （1） 处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量 10% 的 NaOH 溶液， NaOH 溶液的浓度为 1.0 mol/L， 同时加入鱼骨重量 300% 的 NaCl 溶液， NaCl 溶液的质量浓 度为 10% ； 用粉碎机将鱼骨粉碎， 形成粉碎液 ； 0049 （。
28、3） 硫酸软骨素提取 ： 将步骤 （2） 处理得到的粉碎液， 在58下搅拌浸提6h， 200目 的滤布过滤， 所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤， 合并两次过滤的滤液得浸提滤液， 同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白 ； 0050 （4） 滤液酶解除蛋白 ： 将步骤 （3） 所得浸提滤液用 4 mol/L 的盐酸调 pH 至 7.5， 加 入浸提滤液重量 0.5% 的中性蛋白酶， 在 55下保温搅拌 2h 得酶解液 ； 0051 （5） 高温灭酶活 ： 将步骤 （4） 所得酶解液加热至 100， 保温 5min 灭酶活 ； 0052 （6） 硫酸软骨素沉淀 ： 搅拌条件下向步骤。
29、 （5） 处理得到的酶解液中加无水乙醇至 体系中乙醇体积分数为 65%， 在 4静置 24 h， 在离心力为 8000g 下， 离心 15 min 收集沉 淀， 沉淀用无水乙醇洗涤 2 次， 真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品 ； 0053 （7） 滤渣去除脂肪 ： 向步骤 （3） 第二次过滤得到的滤渣以重量比 1:30 的比例加入 质量浓度 10% 的丁醇溶液， 搅拌条件下浸泡 24 h， 浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇 ； 0054 （8） 胶原蛋白提取 ： 向步骤 （7） 处理所得滤渣以重量比 1:15 的比例加入蒸馏水， 调 节 pH 至 7.5， 加入滤渣重量 1% 的中性蛋白酶， 在 5。
30、5下保温搅拌 4h 得酶解液， 然后将酶解 液加热至 100保温 5min 灭酶活 ； 0055 （9） 胶原蛋白盐析 ： 将步骤 （8） 处理得到的酶解液在温度 4下， 离心力为 3000g 下离心 20 min， 收集上清液， 向上清液中缓慢加入 NaCl 盐析， NaCl 的加入量为至上清液中 NaCl 的浓度为 1.2mol/L， 在温度 0下， 搅拌过夜得盐析液 ； 0056 （10） 胶原蛋白收集 ： 将步骤 （9） 处理得到的盐析液在 4下， 离心力为 5000g 下 离心 20 min， 去除上清液， 所得沉淀物为胶原蛋白粗品 ； 0057 （11） 胶原蛋白透析和冻干 ： 向。
31、步骤 （10） 所得胶原蛋白粗品中加入浓度 0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶， 然后先使用浓度 0.2 mol/L 的醋酸溶液作为透析外液进行透析 24h， 再使 用蒸馏水作为透析外液透析 36 h， 冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。 0058 实施例 3 0059 （1） 原料处理 ： 将新鲜中国魟鱼骨上的残肉剔净， 在 45热水中清洗干净 ； 0060 （2） 鱼骨粉碎 ： 在步骤 （1） 处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量 12% 的 NaOH 溶液， NaOH 溶液的浓度为 0.8 mol/L， 同时加入鱼骨重量 250% 的 NaCl 溶液， NaCl 溶液的质量浓 说 明 书 CN 10。
32、2690370 B 7 5/5 页 8 度为 12% ； 用粉碎机将鱼骨粉碎， 形成粉碎液 ； 0061 （3） 硫酸软骨素提取 ： 将步骤 （2） 处理得到的粉碎液， 在 55下搅拌浸提 7 h， 180 目的滤布过滤， 所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤， 合并两次过滤的滤液得浸提滤 液， 同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白 ； 0062 （4） 滤液酶解除蛋白 ： 将步骤 （3） 所得浸提滤液用 3.5 mol/L 的盐酸调 pH 至 7.2， 加入浸提滤液重量 0.8% 的中性蛋白酶， 在 50下保温搅拌 2.5 h 得酶解液 ； 0063 （5） 高温灭酶活 ： 将。
33、步骤 （4） 所得酶解液加热至 100， 保温 8 min 灭酶活 ； 0064 （6） 硫酸软骨素沉淀 ： 搅拌条件下向步骤 （5） 处理得到的酶解液中加无水乙醇至 体系中乙醇体积分数为 62%， 在 2静置 20 h， 在离心力为 7000g 下， 离心 18 min 收集沉 淀， 沉淀用无水乙醇洗涤 2 次， 真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品 ； 0065 （7） 滤渣去除脂肪 ： 向步骤 （3） 第二次过滤得到的滤渣以重量比 1:25 的比例加入 质量浓度 12% 的丁醇溶液， 搅拌条件下浸泡 20 h， 浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇 ； 0066 （8） 胶原蛋白提取 ： 向步骤 （7。
34、） 处理所得滤渣以重量比 1:12 的比例加入蒸馏水， 调 节 pH 至 7.2， 加入滤渣重量 1.5% 的中性蛋白酶， 在 50下保温搅拌 4.5 h 得酶解液， 然后 将酶解液加热至 100保温 8min 灭酶活 ； 0067 （9） 胶原蛋白盐析 ： 将步骤 （8） 处理得到的酶解液在温度 4下， 离心力为 3500g 下离心 18 min， 收集上清液， 向上清液中缓慢加入 NaCl 盐析， NaCl 的加入量为至上清液中 NaCl 的浓度为 1.0mol/L， 在温度 2下， 搅拌过夜得盐析液 ； 0068 （10） 胶原蛋白收集 ： 将步骤 （9） 处理得到的盐析液在 2下， 离。
35、心力为 5500g 下 离心 18 min， 去除上清液， 所得沉淀物为胶原蛋白粗品 ； 0069 （11） 胶原蛋白透析和冻干 ： 向步骤 （10） 所得胶原蛋白粗品中加入浓度 0.4 mol/L 的醋酸溶液复溶， 然后先使用浓度 0.15 mol/L 的醋酸溶液作为透析外液进行透析 30 h， 再 使用蒸馏水作为透析外液透析 30 h， 冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。 0070 本发明提取的硫酸软骨素产品为白色粉末， 得率为 4.5%-6.7%（鱼骨干品重 量计） ， 纯度为 92.0%-97.4%。对提取的硫酸软骨素的理化性质研究表明， 其水分含量 为 8.5%-10.5%， 氮含量为 2。
36、.7%-3.2%， 氨基己糖含量为 30.1%-32.6%， 葡萄糖醛酸含量为 30.8%-34.5%。提取出的硫酸软骨素产品电泳实验显示为单点， 表明其为单一糖胺聚糖。 0071 本发明提取的胶原蛋白产品为白色粉末， 无腥味， 得率为 14.3%-17.8%（鱼骨干 品重量计） ， 纯度为 94.2-98.3%。对提取的胶原蛋白的理化性质研究表明， 其水分含量为 7.3%-9.7%， 热变性温度 35.7-42.7， 甘氨酸含量占所有氨基酸总数的 36.4%-42.7%， 亚 氨酸含量为 18.9% -23.4%， 电泳显示提取的胶原蛋白为典型的型胶原蛋白。 0072 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说 明 书 CN 102690370 B 8 。