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1、(10)授权公告号 CN 102676445 B (45)授权公告日 2014.05.07 CN 102676445 B (21)申请号 201210151677.6 (22)申请日 2012.05.16 C12N 3/00(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (73)专利权人 甘肃农业大学 地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村 1 号 (72)发明人 徐秉良 古丽君 郭景致 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 夏晏平 (54) 发明名称 木霉菌剂的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了木霉菌剂的制备方法， 其特征 在于 。
2、： 包括以下步骤 ： 1） 木霉菌种的种子培养 ； 2） 将步骤 1） 得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木 霉孢子悬浮液 ； 3） 将步骤 2） 得到的木霉孢子悬 浮液进行液态发酵， 得到木霉液态发酵液 ； 4） 将 步骤 3） 得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃 薯渣固体培养基中进行固态培养。本发明的有益 效果为 ： 1、 本发明提供的技术方案采用易得且廉 价的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂， 解决了成 本高、 配方复杂等问题， 同时解决了马铃薯渣造成 的环境污染、 以及不能充分回收利用的问题 ； 2、 本发明提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量 可以高达 3.21012cfu/g 底物， 产孢。
3、量是现有技 术的 100 倍， 提高了产出率、 更大程度的节约了成 本。 (51)Int.Cl. 审查员 蔡玉品 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 102676445 B CN 102676445 B 1/1 页 2 1. 木霉菌剂的制备方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： 1） 木霉菌种的种子培养 ： 所述木霉菌种为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum Rifai）； 将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中， 培养温度为 25-30， 光照条件为 。
4、光照 8-16 小时、 黑暗 8-16 小时交替， 培养时间为 4 天 ； 2）将步骤 1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液， 稀释浓度为 1103cfu/ml-1108cfu/ml， 稀释方法为血球计数板计数， 并调节 pH 为 4-7 ； 3） 将步骤 2） 得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵， 发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培 养液， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:55-1:70， 培养条件 为 25 -28， 摇床培养 140r/min-160r/min， 连续培养 5-7 天， 得到木霉液态发酵液 ； 4） 将步骤 3） 得到的木霉液态发酵液。
5、置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培 养， 所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蓬松剂， 按质量比去淀粉马 铃薯渣 ： 蓬松剂为 5 ： 1， 按质量比固体培养基 : 发酵液为 1:1-1:2， 搅拌均匀， 培养条件为 25-30， 静态培养 8-10 天， 得到木霉菌剂， 其中， 产孢量为每克培养底物产出 3.21012cfu 单位木霉孢子， 所述蓬松剂为珍珠岩、 蛭石和 / 或麦麸的混合物。 2. 根据权利要求 1 所述的木霉菌剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1） 中， 培养温 度为 27， 光照条件为光照 12 小时、 黑暗 12 小时交替。 3. 根据权利要。
6、求 1 所述的木霉菌剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 2） 中， 稀释浓 度为 1106cfu/ml， 调节 pH 为 5。 4. 根据权利要求 1 所述的木霉菌剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中， 接种量 为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:60 ； 培养条件为 25， 摇床速度 为 150r/min， 连续培养时间为 6 天。 5. 根据权利要求 1 所述的木霉菌剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 4） 中的去淀粉 马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和 / 或麦麸 ； 所述去淀粉马铃薯渣的制 备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干。
7、后粉碎至 20 目得到的。 权 利 要 求 书 CN 102676445 B 2 1/5 页 3 木霉菌剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物菌剂的制备方法， 具体涉及木霉菌剂的制备方法。 背景技术 0002 目前生产上常用的木霉菌剂多为分生孢子制剂， 国外已有商品化的木霉制剂问 世， 如美国的 Topshield( 哈茨木霉 T-22) 和以色列的 Trichodex( 哈茨木霉 T39)。国内也 有少量的报道， 如北京中美陆公司生产的木霉厚垣孢子制剂迈可键。 0003 木霉菌剂的制备要经过一级种子培养、 二级液体扩大培养、 三级固体培养。 自从木 霉菌的生防效果得到广泛的认同以。
8、来， 许多研究者就对其培养基质进行了大量的摸索。 0004 (1) 液体扩大培养 0005 Jackson 和 whips 等发现在丙氨酸一葡萄糖培养产生的菌丝干重比糖蜜一酵母粉 培养生物量要高。Lewis 和 PaPavizas 等研究发现糖蜜玉米培养基在支持木霉生长和产 孢方面优于蔗糖硝酸盐培养基和葡萄糖酒石酸培养基。 目前国内在木霉液体培养以获 得高的生物量方面文献比较少， 仅有陈卫辉等木霉的浅层液体培养条件进行过初步研究， 他们用虫草头孢废液添加几种中草药 ( 青篙、 黄芩、 贯众和板蓝根 ) 作为培养基， 接种哈茨 木霉的分生孢子进行培养， 可获得 1.67x108个孢子 / 皿， 。
9、应用虫草头孢废液组合培养液培 养哈茨产孢量比 PD 培养液、 查氏培养液和理查德培养液都高。 0006 (2) 固体发酵 0007 Lewis 和 Papaviazs 等研究了木霉在各种固体培养基上产生孢子量的情况。以 石英砂加松锯末、 可可壳粉、 咖啡壳粉、 花生壳粉、 玉米芯或麦麸皮等为原料， 研究表明麦 麸皮的效果最好， 玉米粉和花生壳粉在刺激木霉产生孢子方面与麸皮的效果是相同的。 朱辉等用城市垃圾加 30% 麦麸皮， 接种量 30%， 8-10 天得到孢子量 109个 /g。王永东等 用麸皮、 玉米粉 3:1 配比， 蔗糖 1.5%， 蛋白胨 1.5%， 硝酸 1.0%， 磷酸二氢钾 。
10、0.05%， 缓冲盐 NaH2P04-Na2HP04(0.50%-0.50%)接种量90%， 温度22-25， 9d产孢量达1.0 x1010个/g。 田连 生 （2006） 等利用玉米秸秆制备木霉生物杀菌剂。张双玺 （2008） 等利用植物农药残渣生产 绿色木霉 ( Trichoderma viride) 菌制剂。武宽等 (2007) 利用甘蔗渣， 麦麸， 米糠组成的 固体发酵培养基培养木霉， 在相对湿度60-80%， 温度25-28条件下， 培养4-5天后， 在12 以下低温培养 2-3 天。固体发酵产物在 40-50温度下干燥 12-24 小时， 加入由硅藻土， 麦 麸， 硫磺组成的促进。
11、剂。混合均匀， 粉碎后过 40 目筛， 即得木霉粉剂和粉粒剂。文献报道的 作为生防剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。 另外有些文献报道的作为生防 剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。如中国专利 ( 公开号 :CN1554242A) 中 公开了一种木霉菌的生产方法， 其培养基主要是颗粒直径在 1-5 毫米之间的小米、 稻米、 玉 米、 大麦、 小麦或高梁。中国专利 ( 公开号 :CN1422946A) 中公开了一种木霉菌的生产方法， 其生产原料主要是大麦、 鼓皮、 筱麦等。 杨合同利用玉米粉、 麦麸等成分， 采用液固两相发 酵技术生产木霉分生孢子取得成功。 0008 固体发酵是。
12、生产木霉制剂中最为关键的技术之一。 直接决定制剂的防病效果和制 说 明 书 CN 102676445 B 3 2/5 页 4 剂生产成本。而固体发酵中最重要的是培养基质的选择， 选择适宜的培养基质可以简化操 作、 降低成本、 保证制剂性能， 同时可以利用残渣废料以减少环境污染。 0009 张双玺 , 张兴在 利用植物农药残渣生产绿色木霉孢子的研究 中描述了以下制 备方法 ： 0010 1、 加工原料 ： 植物农药沙地柏残渣 ； 0011 2、 液体发酵 ： 利用 PDA 培养基平板培养绿色木霉菌， 待菌丝长满培养皿并变为绿 色后， 每皿加入 10ml 灭菌水， 用接种环搅拌使孢子悬浮在水中， 。
13、用移液管吸出悬浮液移入 灭菌三角瓶中， 孢子数量用血球计数板计数， 然后用灭菌水将孢子浓度调整为 1108/ml ； 0012 3、 固体发酵 ： 沙地柏残渣在 75条件下用酒精提取 4h， 滤渣自然风干， 麸皮在 120烘干粉碎， 鸡粪在 150烘干粉碎， 沙地柏 ： 麦麸 ： 鸡粪 ： 硫酸铵比例为 12 ： 4 ： 3 ： 1， 准 确称取5 g， 121灭菌30 min， 摇匀， 接1108/mL绿色木霉孢子悬浮液0.5ml， 28培养箱 培养， 绿色木霉菌孢子培养的最佳时间为 8-12d， 其产孢量达到 7.4109/g。 0013 上述技术及培养基质有以下缺点 0014 1、 材料。
14、稀少 ： 0015 该技术所用原料为植物农药沙地柏残渣， 沙地柏产于我国新疆天山至阿尔泰山、 宁夏、 内蒙古、 青海东北部、 甘肃祁连山北坡、 陕西榆林， 海拔 1100-2800m 地带多石山地及 沙丘上。北京、 西安等地有引种。沙地柏常用于改善干旱、 半干旱地区的环境和防止沙漠化 进程， 用于生物农药的提取报道较少。原材料难以获取， 不适合大规模生产使用。 0016 2、 配方复杂 ： 0017 该技术所用配方较为复杂， 所用材料为沙地柏、 麦麸、 鸡粪、 硫酸铵四种， 操作繁 琐。 0018 3、 产孢量低 ： 0019 培养 8-12d， 其产孢量才达到 7.4109/g。 发明内容 。
15、0020 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷， 提供了培养基原材料容易获取、 配方简单， 产孢量高的木霉菌剂的制备方法。 0021 为了实现上述目的， 本发明提供的技术方案为 ： 木霉菌剂的制备方法， 包括以下步 骤 ： 0022 1）木 霉 菌 种 的 种 子 培 养 ： 所 述 木 霉 菌 种 为 长 枝 木 霉（Trichoderma longibrachiatum Rifai）； 将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中， 培养温度为 25-30， 光照条件为光照 8-16 小时、 黑暗 8-16 小时交替， 培养时间为 4 天 ； 0023 2） 将步骤 1） 得到的木霉菌种子。
16、用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液， 稀释浓度为 1103cfu/ml-1108cfu/ml， 稀释方法为血球计数板计数， 并调节 PH 为 4-7 ； 0024 3） 将步骤 2） 得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵， 发酵培养基质为去淀粉马铃薯 渣培养液， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:55-1:70 培养 条件为 25 -28， 摇床培养 140r/min-160r/min， 连续培养 5-7 天， 得到木霉液态发酵液 ； 0025 4） 将步骤 3） 得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态 培养， 所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马。
17、铃薯渣和蓬松剂， 按质量比去淀粉 说 明 书 CN 102676445 B 4 3/5 页 5 马铃薯渣 ： 蓬松剂为5 ： 1， 按质量比固体培养基: 发酵液为1:1-1:2， 搅拌均匀， 培养条件为 25-30， 静态培养 8-10 天， 得到木霉菌剂， 其中， 产孢量为每克培养底物产出 3.21012cfu 单位木霉孢子。 0026 上述的木霉菌剂的制备方法， 所述步骤 1） 中， 培养温度为 27， 光照条件为光照 12 小时、 黑暗 12 小时交替。 0027 上述的木霉菌剂的制备方法， 所述步骤 2） 中， 稀释浓度为 1106cfu/ml， 调节 PH 为 5。 0028 上述的。
18、木霉菌剂的制备方法， 所述步骤 3） 中， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为1:60 ； 培养条件为25， 摇床速度为150r/min， 连续培养时间为6 天。 0029 上述的木霉菌剂的制备方法， 所述步骤 4） 中， 蓬松剂为珍珠岩、 蛭石和 / 或麦麸的 混合物。 0030 上述的木霉菌剂的制备方法， 所述步骤 4） 中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有 去淀粉马铃薯渣和蛭石和 / 或麦麸 ； 所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马 铃薯残渣烘干后粉碎至 20 目得到的。 0031 本发明的有益效果为 ： 0032 1、 本发明提供的技术方案采用易得且廉价。
19、的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂， 解 决了成本高、 配方复杂等问题， 同时解决了马铃薯渣造成的环境污染、 以及不能充分回收利 用的问题 ； 0033 2、 本发明提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量可以高达 3.21012cfu/g 底 物， 产孢量是现有技术的 100 倍， 提高了产出率、 更大程度的节约了成本。 具体实施方式 0034 所用长枝木霉为保藏于 accc（中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所） 的 菌株， 保藏编号为 31960。 0035 实施例 1 ： 0036 木霉菌剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 0037 1） 木霉菌种的种子培养 ： 木霉菌种为长枝木霉 ； 将木。
20、霉种子接种于马铃薯葡萄糖 琼脂培养基中， 培养温度为 25， 光照条件为光照 8 小时、 黑暗 8 小时交替， 培养时间为 4 天 ； 0038 2） 将步骤 1） 得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液， 稀释浓度为 1103cfu/ml， 稀释方法为血球计数板计数， 并调节 PH 为 4 ； 0039 3） 将步骤 2） 得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵， 发酵培养基质为去淀粉马铃薯 渣培养液， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:55 培养条件为 25， 摇床培养 140r/min， 连续培养 5 天， 得到木霉液态发酵液 ； 0040 4） 将步骤 3。
21、） 得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固 态培养， 所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和珍珠岩， 按质量比去淀 粉马铃薯渣 ： 珍珠岩为 5 ： 1， 按质量比固体培养基 : 发酵液为 1:1， 搅拌均匀， 培养条件为 25， 静态培养8天， 得到木霉菌剂， 其中， 产孢量为每克培养底物产出3.21012cfu单位木 说 明 书 CN 102676445 B 5 4/5 页 6 霉孢子。 0041 步骤 4） 中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和 / 或麦 麸 ； 所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至 20 目。
22、得 到的。 0042 实施例 2 ： 0043 木霉菌剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 0044 1） 木霉菌种的种子培养 ： 木霉菌种为长枝木霉 ； 将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖 琼脂培养基中， 培养温度为 30， 光照条件为光照 16 小时、 黑暗 16 小时交替， 培养时间为 4 天 ； 0045 2） 将步骤 1） 得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液， 稀释浓度为 1108cfu/ml， 稀释方法为血球计数板计数， 并调节 PH 为 7 ； 0046 3） 将步骤 2） 得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵， 发酵培养基质为去淀粉马铃薯 渣培养液， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液。
23、 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:70 培养条件为 28， 摇床培养 160r/min， 连续培养 7 天， 得到木霉液态发酵液 ； 0047 4） 将步骤 3） 得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态 培养， 所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石， 按质量比去淀粉马 铃薯渣 ： 蛭石为 5 ： 1， 按质量比固体培养基 : 发酵液为 1:2， 搅拌均匀， 培养条件为 30， 静 态培养 10 天， 得到木霉菌剂， 其中， 产孢量为每克培养底物产出 3.21012cfu 单位木霉孢 子。 0048 步骤 4） 中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯。
24、渣和蛭石和 / 或麦 麸 ； 所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至 20 目得 到的。 0049 实施例 3 ： 0050 木霉菌剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 0051 1） 木霉菌种的种子培养 ： 木霉菌种为长枝木霉 ； 将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖 琼脂培养基中， 培养温度为 27， 光照条件为光照 12 小时、 黑暗 12 小时交替， 培养时间为 4 天 ； 0052 2） 将步骤 1） 得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液， 稀释浓度为 1106cfu/ml， 稀释方法为血球计数板计数， 并调节 PH 为 5 ； 0053 3） 将步骤 2） 。
25、得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵， 发酵培养基质为去淀粉马铃薯 渣培养液， 接种量为按体积比木霉孢子悬浮液 ： 去淀粉马铃薯渣培养液为 1:60， 培养条件 为 27， 摇床培养 150r/min， 连续培养 6 天， 得到木霉液态发酵液 ； 0054 4） 将步骤 3） 得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态 培养， 所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和麦麸， 按质量比去淀粉马 铃薯渣 ： 麦麸为 5 ： 1， 按质量比固体培养基 : 发酵液为 1:1.5， 搅拌均匀， 培养条件为 27， 静态培养 9 天， 得到木霉菌剂， 其中， 产孢量为每克培养底物产出。
26、 3.21012cfu 单位木霉孢 子。 0055 步骤 4） 中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和 / 或麦 麸 ； 所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至 20 目得 说 明 书 CN 102676445 B 6 5/5 页 7 到的。 0056 最后应说明的是 ： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的 保护范围之内。 说 明 书 CN 102676445 B 7 。