一种喜树碱与青蒿琥酯偶联物及其制备方法与应用.pdf

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1、10申请公布号CN104163823A43申请公布日20141126CN104163823A21申请号201410181237422申请日20140430C07D519/00200601A61K31/4745200601A61P35/00200601A61P35/0220060171申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市下城区潮王路18号浙江工业大学科技处72发明人李庆勇王文超74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟王兵54发明名称一种喜树碱与青蒿琥酯偶联物及其制备方法与应用57摘要本发明公开了一种式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物，其制备方法为将式II所示喜树碱。

2、和式III所示青蒿琥酯溶于有机溶剂中，在1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐和4二甲氨基吡啶的作用下，于1550搅拌反应，TLC跟踪监测至反应不再进行，反应液后处理，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物可用于制备抗肿瘤药物；51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN104163823ACN104163823A1/2页21一种式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物2一种如权利要求1所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的制备方法为将式II所示喜树碱和式II。

3、I所示青蒿琥酯溶于有机溶剂A中，在1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐和4二甲氨基吡啶的作用下，于1550搅拌反应，TLC跟踪监测至反应不再进行，反应液后处理，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；3如权利要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂A为氯仿或二氯甲烷。4如权利要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂A的体积用量以喜树碱的摩尔量计为110ML/MMOL。5如权利要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的喜树碱与青蒿琥酯的投料物质的量之比为1110；所述的喜树碱与1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的投料。

4、物质的量之比为115。6如权利要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述4二甲氨基吡啶的质量用量以喜树碱的摩尔量计为120MG/MMOL。7如权利要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的后处理方法为反应结束后，向反应液中加入有机溶剂B，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；所述的有机溶剂B为氯仿或二氯甲烷，其体积用量为有机溶剂A体积的2倍。8如权利。

5、要求2所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其特征在于所述的制权利要求书CN104163823A2/2页3备方法为室温下，将青蒿琥酯溶于有机溶剂A中，溶解完全后加入1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌30分钟，再加入4二甲氨基吡啶，继续搅拌30分钟，最后加入喜树碱，于25下搅拌反应3小时，反应结束后，向反应液中加入有机溶剂B，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；其中，所述的有机。

6、溶剂A为氯仿，并且所述有机溶剂A的体积用量以喜树碱的摩尔量计为35ML/MMOL；所述喜树碱与青蒿琥酯的投料物质的量之比为13；所述喜树碱与1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的投料物质的量之比为13；所述4二甲氨基吡啶的质量用量以喜树碱的摩尔量计为510MG/MMOL；后处理过程中，所述有机溶剂B为氯仿或二氯甲烷，其体积用量为有机溶剂A体积的2倍。9如权利要求1所述的喜树碱与青蒿琥酯偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为脑肿瘤、口腔癌、咽喉癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、白血病、肉瘤、直肠癌、胶质瘤或人类免疫缺陷病。

7、毒。权利要求书CN104163823A1/6页4一种喜树碱与青蒿琥酯偶联物及其制备方法与应用一技术领域0001本发明涉及一种喜树碱与青蒿琥酯偶联物及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。二背景技术0002喜树碱来源于中国植物喜树，由于它独特的作用机制，在抗癌药物研究领域里，大量的喜树碱衍生物被合成与研究。喜树碱极其衍生物对于各种癌细胞都起到了良好的抑制效果，例如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤等。然而喜树碱并没有应用于临床，因为其自身极高的毒性和较差的溶解性。另一种从菊科蒿属植物青蒿中提取出的青蒿素一直作为抗疟疾药物使用了2000多年，青蒿素极其衍生物一直被认。

8、为是安全有效的。研究发现，青蒿素在生物体内会与转铁蛋白结合，其自身化学结构包含了一个过氧桥，当与铁离子结合时会形成一个自由基，从而起到抑制作用。转铁蛋白为生物体内负责转运铁离子的功能性蛋白，相对于正常细胞，癌细胞对铁离子的需求量更高，这以至于青蒿素能对癌细胞起到更好的作用效果。例如乳腺癌细胞表面的转铁蛋白含量为正常细胞的515倍，转铁蛋白在乳腺癌细胞上表达，乳腺癌细胞吸收了大量铁离子，而正常细胞则没有。因此青蒿素对癌细胞的选择作用是因为该化合物在生物体内会与转铁蛋白结合，而转铁蛋白会向铁离子含量高的部位运输。0003故利用青蒿素可以与转铁蛋白结合的机制，将青蒿素当作载体使用，而喜树碱具有对于各。

9、种癌细胞较高的抑制作用，但其自身毒性大的特点，我们将喜树碱与青蒿素衍生物青蒿琥酯偶联，使其对癌细胞具有较好抑制效果的同时，降低自身毒性。三发明内容0004本发明目的是提供一种喜树碱与青蒿琥酯偶联物及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物对肝癌细胞SMMC7721、人乳腺癌细胞MCF7等均具有不同程度的增殖抑制作用。0005为实现上述目的，本发明采用的技术方案是0006一种式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物00070008一种本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，所述的制备方法为将式II说明书CN104163823A2/6页5所示喜树碱和式III所示青蒿琥酯溶于有。

10、机溶剂A中，在1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐EDCI和4二甲氨基吡啶DMAP的作用下，于1550搅拌反应，TLC跟踪监测至反应不再进行，反应液后处理，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物。00090010本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其中所述的有机溶剂A为可溶解反应底物并不与之发生副反应的溶剂，如氯仿或二氯甲烷等，优选为氯仿；所述的有机溶剂A的体积用量以喜树碱的摩尔量计可以为110ML/MMOL，优选为35ML/MMOL。0011本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，其中所述的喜树碱与青蒿琥酯的投料物质的量之比可以为1110，优选为13；0012所述的喜树碱与1乙基3二甲基氨。

11、基丙基碳二亚胺盐酸盐的投料物质的量之比可以为115，优选为13；0013所述4二甲氨基吡啶的质量用量以喜树碱的摩尔量计可以为120MG/MMOL，优选为510MG/MMOL。0014本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，推荐投料方法如下室温下，先将青蒿琥酯溶于氯仿中，溶解完全后加入EDCI，搅拌30分钟，再加入DMAP，继续搅拌30分钟，最后加入喜树碱，搅拌反应；并且，优选在25下搅拌反应3小时。0015本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法，所述的后处理方法为0016反应结束后，向反应液中加入有机溶剂B，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤。

12、液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；所述的有机溶剂B为氯仿或二氯甲烷，其体积用量为有机溶剂A体积的2倍。0017具体的，推荐本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备方法为室温下，将青蒿琥酯溶于有机溶剂A中，溶解完全后加入1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌30分钟，再加入4二甲氨基吡啶，继续搅拌30分钟，最后加入喜树碱，于25下搅拌反应3小时，反应结束后，向反应液中加入有机溶剂B，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减。

13、压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥，即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物；其中，所述的有机溶剂A为氯仿，并且所述有机溶剂A的体积用量以喜树碱的摩尔量计为35ML/MMOL；所述喜树碱与青蒿琥酯的投料物质的量之比为13；所述喜树碱与1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的投料物质的量之比为13；所述4二甲氨基吡啶的质量用量以喜树碱的摩尔量计为510MG/MMOL；后处理过程中，所述有机溶剂B为氯仿或二氯甲烷，其体积用量为有机溶剂说明书CN104163823A3/6页6A体积的2倍。0018本发明中有机溶剂A和有机溶。

14、剂B均是指有机溶剂，其中，标号A、B只是用于区别不同操作步骤中所用到的有机溶剂。0019本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物可用于制备抗肿瘤药物，所述喜树碱与青蒿琥酯偶联物作为抗肿瘤抑制剂对普通小鼠的质量用量为1060MG/KG体重。0020所述肿瘤如脑肿瘤、口腔癌、咽喉癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、白血病、肉瘤、直肠癌、胶质瘤及人体免疫缺陷病毒HIV，但不仅局限于此。0021本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物还可以与人体可接受的药用辅料组合制成各种剂型，包括溶液剂、注射剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、凝胶剂等。本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物能够与常规。

15、药用辅料一起，以药物组合物的形式通过口服，鼻吸入、肠胃或者肠胃外给药的方式施用于患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂；皮肤给药用的外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、糊剂、贴剂；粘膜给药用的含漱剂、舌下片剂、栓剂、膜剂；直肠给药用的灌肠剂、栓剂、直肠用胶囊栓等。0022与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种新颖的喜树碱与青蒿琥酯偶联物，且该偶联物具有抗肿瘤活性，能够用于制备抗肿瘤药物，本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物对肝癌细胞SMMC7721、人乳腺癌细胞MCF7具有不同程度的增殖抑制作用详见。

16、实施例3，该偶联物的IC50基本与喜树碱持平。而且通过动物实验显示，该偶联物对机体的伤害相对于喜树碱在很大程度上降低了实施例4。四附图说明0023图1是喜树碱与青蒿琥酯偶联物对肿瘤细胞增殖活性抑制的情况；0024图2是喜树碱与青蒿琥酯偶联物对小鼠体重的影响；0025图中，各标号的含义为CPT喜树碱组，ART青蒿琥酯组，CQ偶联物组，CONTROL对照组。五具体实施方式0026下面通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。0027实施例1喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备10028在25ML圆底烧瓶中加入青蒿琥酯15MMOL和二氯甲烷10ML，25搅拌溶解，再加入EDCI1。

17、5MMOL，25搅拌05H，接着加入DMAP50MG，25搅拌05H，最后加入喜树碱5MMOL，25搅拌反应3H，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入二氯甲烷20ML，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物，产率80。0029MP194819531HNMR500MHZ,CDCL383742S,1H,82587D,J说明书CN104163823A4/6页785HZ,2H,79331D,。

18、J815HZ,1H,78157T,J75HZ,1H,76525T,J74HZ,1H,72865D,J55HZ,1H,5679,M,J985HZ,2H,54117,D,J1715HZ,1H,52991S,1H,52606D,J375HZ,1H,51177S,1H,28763M,J6,85HZ,2H,28623M,J969HZ,2H,24341M,J355HZ,2H,23180M,J72125HZ,2H,19937M,J98152HZ,3H,18264M,J3258HZ,1H,16931M,J42625HZ,1H,16159D,J533HZ,1H,15121M,J448HZ,1H,13301M,J。

19、745HZ,4H,09940M,J7475HZ,3H,09353M,J72375HZ,5H,07791D,J71HZ,3H；13CNMR1711203,1706127ARTCO,1673167CPT16A,1573081CPT21,1524506CPT6,1488204CPT15,1462229CPT8,1457012CPT13,1310144CPT12,1304693CPT3,1297100CPT2,1286331CPT7,1281745CPT11,1281107CPT10,1278704CPT16,1202405CPT9,1042652ART12,963067ART4,922332ART5。

20、,912771ART6,798964CPT20,761379CPT14,514200ART1,499400CPT5,451595ART7,370777ART10,360987ART3,339923ART9,318131CPT19,316769ART11,288540,285795ARTOCCCO,257284ART15,244896ART2,218608ART8,201093ART14,119571ART13,75473CPT18,IRARH292903,287563CO175098,166372HRMSM/ZMH7152840CALCDFORC39H43N2O1171528670030实施例。

21、2喜树碱与青蒿琥酯偶联物的制备20031在25ML圆底烧瓶中加入青蒿琥酯10MMOL和氯仿20ML，30搅拌溶解，再加入EDCI10MMOL，30搅拌05H，接着加入DMAP50MG，25搅拌05H，最后加入喜树碱3MMOL，30搅拌反应3H，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入二氯甲烷40ML，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比1001的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后即得式I所示的喜树碱与青蒿琥酯偶联物，产率85。0032实施例3式I所示化合物对肿瘤细。

22、胞增殖抑制活性00331试验材料0034肝癌细胞SMMC7721、人乳腺癌细胞MCF7，均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。0035喜树碱与青蒿琥酯标准品购自百灵威生物科技有限公司。0036细胞维持液为2血清浓度培养基，SMMC7721是用RPMI1640培养基，MCF7是用DMEM培养基。0037将实施例1制备的喜树碱与青蒿琥酯偶联物、喜树碱、青蒿琥酯、二甲基亚砜DMSO分别用细胞维持液稀释，每种样品做6个浓度梯度0032、016、08、4、20、100MOL/L，每个浓度梯度做4个复孔。00382检测方法0039将处于呈对数生长期的人肝癌细胞SMMC7721、人乳腺癌细胞MCF7，。

23、用相应的培养液配置成单细胞悬液，以105个/孔的密度接种于96孔板，CO2细胞培养箱中37培养24H后，弃掉细胞培养液，分成5组组1为实验组用细胞维持液稀释实施例1制备说明书CN104163823A5/6页8的偶联物，浓度为0032、016、08、4、20、100MOL/L；组2为空白对照组只加细胞维持液；组3为阴性对照组加细胞维持液稀释的等浓度的DMSO；组4为阳性对照组加细胞维持液稀释的等浓度的喜树碱标准品，组5也为阳性对照组加细胞维持液稀释的等浓度的青蒿琥酯标准品。每孔加入100L的对照品或者药品，CO2培养箱中37孵育48H后，每孔加入20L的5MG/ML的MTT溶液，继续孵育4H后，。

24、弃掉孔中液体，加入100LDMSO，振荡至紫色沉淀充分溶解后，用酶标仪测定波长为492NM时各孔的光吸收值OD值。计算出复孔的平均OD值，根据平均OD值计算化合物对细胞的生长抑制率抑制率1实验组OD值空白对照组OD值/阴性对照组OD值空白对照组OD值100。结果见图1所示。0040用MTT法测定了式I所示化合物对两种肿瘤细胞肝癌细胞SMMC7721、人乳腺癌细胞MCF7的细胞增殖抑制活性，对肿瘤细胞生长抑制活性见图1。由图可知，式I所示化合物对两种肿瘤细胞均表现了不同程度的抑制生长活性。通过对检测结果的分析，本发明喜树碱与青蒿琥酯偶联物对肿瘤细胞的抑制率与喜树碱相近，比青蒿琥酯抑制效果高。而且。

25、实验结果显示，随着浓度的增高，偶联物的抑制效果逐步高于喜树碱。0041实施例4式I所示化合物体内活性评价00421试验材料0043药品实施例1制备的喜树碱与青蒿琥酯偶联物、喜树碱、青蒿琥酯、盐酸拓扑替康。所述药品先分别用DMSO和乙醇溶解，再分别用生理盐水稀释，稀释所得各药品溶液中DMSO的体积浓度为5，乙醇的体积浓度为5，药物浓度根据小鼠的体重调节注射体积均为200L，给药剂量为0023MMOL/KG/2DAYS。0044试验用裸鼠从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买。00452检测方法0046本实验选取了四至五周龄的雌性BALB/C裸鼠，待裸鼠体重达到182G时候，将人乳腺癌细胞MCF7细。

26、胞接种于裸鼠腋下接种肿瘤的细胞浓度为1107个细胞每只老鼠。当裸鼠肿瘤的体积长至200MM3左右时，取35只肿瘤接种成功的老鼠，随机分成5组，分别是喜树碱与青蒿琥酯偶联物组、喜树碱组、青蒿琥酯组、盐酸拓扑替康组，每组7只老鼠。禁食过夜后，腹腔给药，给药组按照0023MMOL/KG/2DAYS剂量给药，注射体积均为200L根据小鼠体重调节注射药品浓度，对照组注射生理盐水200L，均为隔天给药，一共给药四次，第八天处死并取肿瘤称重。抑瘤率结果如下0047表1不同药物对人乳腺癌细胞的抑瘤率0048盐酸拓扑替康喜树碱青蒿琥酯偶联物抑瘤率70211324531134402103450191310049从表中抑瘤实验结果我们可以得出偶联物的抑瘤率高于青蒿琥酯和喜树碱，不及临床药物盐酸拓扑替康，这与化合物的溶解性有一定的关系。0050通过对小鼠体重进行监测如图2所示，我们可以看出喜树碱对小鼠体重的影响最大，小鼠平均体重由开始给喜树碱的178G，8天后下降到119G，毒性很大；而给青蒿琥酯组小鼠体重与对照组基本相同17G，毒性基本可以忽略；给偶联物组的小鼠体重8天后下说明书CN104163823A6/6页9降到158G，说明偶联物毒性介于青蒿琥酯和喜树碱之间，远低于喜树碱。说明书CN104163823A1/1页10图1图2说明书附图CN104163823A10。