本发明涉及单一单元纯化抗体的方法以及可以用在该方法中的装置。
用于医药应用的由细胞培养物生产的单克隆抗体的纯化是包含大量步骤的过程。这种抗体必然要摆脱所有潜在有害的污染物，诸如源自生产这些抗体的细胞的蛋白质和DNA、例如胰岛素的培养基组分、PEG醚类和消泡剂以及任何可能的感染试剂如病毒和朊病毒(prion)。
从生产这些蛋白质的细胞的培养物中纯化抗体的典型过程在BioPharmInternationalJun1，2005，DownstreamProcessingofMonoclonalAntibodies：fromHighDilutiontoHighPurity中有所描述。
因为抗体由诸如为杂交瘤细胞或转化宿主细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤衍生的NS0细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、人类视网膜衍生的PER.C6细胞)的细胞生产，所以必须从细胞浆液中优选在纯化过程初期去除颗粒状细胞材料。该过程的这个部分在本文中被称为“澄清”。随后或者作为澄清步骤的一部分，抗体被粗略纯化至至少约80％，通常是通过“结合加洗脱”色谱步骤(在IgG的情况下通常使用固定的蛋白质A)。这个在本文中被称为“捕集“的步骤不仅导致抗体的初期大幅纯化，还可以导致体积大幅下降，因而产品浓缩。用于捕集的其他替代方法例如为膨胀床吸附(EBA)、2-相液体分离(利用例如聚乙二醇)或采用易溶盐(lyotropicsalt，诸如硫酸铵)的分级沉淀。
澄清和捕集之后，对抗体进行进一步纯化。通常，为了充分地去除残余杂质，在捕集之后的至少两个色谱步骤是必需的。捕集之后的色谱步骤通常被称为中间纯化步骤，而最终的色谱步骤通常被称为精提纯(polishing)步骤。这些步骤中的每一个通常以间歇模式作为单一单元操作进行，并且这些步骤中的至少一个以“结合加洗脱”模式进行。此外，每一个色谱步骤都需要特定的负载条件，例如pH、传导性等等。因此，为了将负载调节至所需要的条件，在每个色谱步骤之前必须进行额外的处理。上述所有这些使得该过程是耗时耗力的。在这些步骤中通常被大体去除的杂质都是过程衍生污染物，诸如宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、培养基组分(如果存在)、蛋白质A(如果存在)、内毒素(如果存在)和微生物(如果存在)。
现有技术中已经描述了许多这样纯化抗体的方法。
-WO2007/076032描述了纯化抗体(CTLA4-Ig及其变体)的方法，该方法中，亲合色谱之后获得的细胞培养物上层清液或其部分进行阴离子交换色谱以获得经洗脱的蛋白质产物，并且使经洗脱的蛋白质产物进行疏水作用色谱以获得富集的蛋白质产物。在这个方法中，经洗脱的蛋白质产物通过如下方法得到，该方法中，抗体首先被阴离子交换色谱材料捕获，随后采用洗涤缓冲液洗涤交换色谱材料，此后通过改变工艺条件(例如采用洗脱缓冲液洗脱)从中洗脱抗体。
-US2008/016450涉及一种通过如下纯化含Fc蛋白质(诸如抗体)的方法：使该蛋白质结合到蛋白质A柱上，并且采用pH梯度洗脱体系洗脱。该文献描述了以流过模式应用疏水作用色谱和阴离子交换色谱的愿望(第0058段至0064段)。
-WO2008/025747涉及在如下工艺中纯化Fc-融合蛋白质，所述工艺包括蛋白质A或G色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和羟基磷灰石色谱，特别是以这个顺序使用。在这个工艺中，阴离子交换色谱和羟基磷灰石色谱以流过模式应用。
-US2007/0167612关注蛋白质(诸如抗体)的纯化，其首先被捕集到亲合柱，如蛋白质A柱。来自亲合柱的洗脱物随后与阴离子交换材料接触，从而抗体结合到其上，随后被洗脱。为了进一步纯化，可以使用额外的色谱柱和纯化步骤，包括额外的阳离子-交换色谱、阴离子-交换色谱、尺寸排斥色谱、亲合色谱、羟基磷灰石色谱和疏水作用色谱。
-WO2001/072769描述了高度阴离子化的蛋白质例如硫酸化的蛋白质的纯化。为了这个目的，随后使用“结合-洗脱”模式的阴离子交换色谱和疏水作用色谱。
-WO2009/058769涉及从抗体制剂中去除杂质的方法。具体的，该专利申请涉及纯化抗体(含有疏水变体)的方法。为了这个目的，样品被加载在蛋白质A柱上；采用适当的洗脱液从蛋白质A柱上洗脱，加载在阳离子和/或阴离子交换柱上；从这个离子交换柱上洗脱，加载在疏水作用色谱(HIC)柱上，其中HIC柱为流过模式；此后收集经纯化的材料。需注意，仅HIC柱以流过模式应用。
-EP1614694关注免疫球蛋白的纯化和分离。具体地，其关注以按顺序的蛋白质A柱、阴离子交换柱和阳离子交换柱步骤以及可选的疏水作用柱步骤从细胞培养物中纯化抗体。这些步骤中，阴离子交换色谱步骤以流过模式操作，而其他所有步骤以“结合-洗脱”模式操作。
-WO2008/051448涉及减少利用蛋白质A亲合色谱法纯化的抗体制剂中的蛋白质A。业已暗示这种蛋白质污染可以利用电荷修饰的深层过滤器去除。这个去除步骤可以在常规用于抗体制剂的纯化步骤之前或之后进行。
-EP0530447描述了通过组合阴离子、阳离子和疏水作用色谱和特定的杀菌步骤的抗体纯化。色谱步骤的顺序可以变化。每个色谱步骤都是以“结合-洗脱”模式操作的。
-Kuczewski，M.等人(2009)[Biotechn.Bioengn.105，296-305].描述了使用疏水作用膜吸收器用于抗体的精提纯。
-Chen，J.等人(2008)[J.Chrom.A1177，272-281].比较了抗体纯化中的常规的和新一代的疏水作用色谱树脂(如混合模式)。
-Zhou，J.X.等人(2006)[J.Chrom.A113466-73].描述了使用疏水作用膜吸收器作为疏水作用柱色谱的替代方案。
-Gottschalk，U.(2008)[Biotechnol.Prog.24，496-503].讨论了在抗体纯化中柱色谱与膜吸收器的使用相比的不足。
-Wang，C.等人(2007)[J.Chrom.A1155，74-84].在流过工艺中使用装核的阴离子交换色谱用于从抗体材料中去除痕量污染物(精提纯)。与未经装核的阴离子材料相比。
-Azevedo，A.等人(2008年)[J.Chrom.A.1213，154-161].组合水性两相提取、疏水作用色谱和尺寸排斥色谱进行抗体纯化的集成工艺。
-Boi，C.(2007)[J.Chrom.B.848，19-27].这篇综述认为使用膜吸收器作为用于单克隆抗体的纯化的捕集和精提纯步骤的替代技术。
上述方法的缺点在于：操作时间长、可变成本高(例如由于结合-洗脱步骤本身所必然需要的高柱容量，因此需要大量昂贵的树脂)和固定成本高(由于劳动力成本)。
根据本发明，可以通过使用串联的顺次连接(in-line)的阴离子交换色谱(AEX)和疏水作用色谱(HIC)二者以流过模式、优选以一个单个单元操作方式操作来实现从细胞培养物生产的抗体中非常有效地去除残余杂质。在AEX之后和HIC之前可以在线混合(in-linemixing)易溶盐以调节用于疏水作用色谱的恰当条件。
这个方法使用分离的、串联连接的、顺次连接的AEX和HIC装置(二者均以流过模式使用)所带来的优点是：相当大程度地降低了操作时间以及劳动和操作成本。此外，需要较小的(因而成本较低的)色谱单元，这是因为所有单元以流过模式操作，从而仅需要足够的结合杂质而非结合产物的能力。
因此，本发明可被定义为一种从生物反应器中生产的细胞浆液(cellbroth)中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中新颖的纯化步骤包括串联的、顺次连接的阴离子交换色谱(AEX)处理和疏水作用色谱(HIC)处理，所述阴离子交换色谱产生流过级份形式的分离混合物，所述疏水作用色谱产生流过级份形式的经纯化的抗体制剂，并且其中所述经纯化的抗体制剂进行至少一个进一步的纯化步骤。
在本发明的上下文中，“分离混合物”是指从本发明的第一离子交换步骤中得到的溶液，“经纯化的抗体制剂”是指从本发明的第二离子交换步骤中得到的溶液。本申请通篇采用这个术语。
“串联顺次连接的AEX和HIC”是指，AEX和HIC以AEX装置的流出物直接进入HIC装置而没有中间存储的方式串联连接。
“流过模式”在本文中是指待纯化的抗体通过色谱装置。这与通常在抗体纯化中使用的“捕集模式”相反，在捕集模式中，抗体首先被结合到色谱材料上，并且在随后的步骤中被洗脱(即通过改变介质条件或组成而被释放)。
在具体的实施方式中，本发明的方法包括作为单一单元操作的AEX和HIC的处理。
“单一单元操作”在本文中是指，两个串联连接的色谱装置(AEX和HIC)在单一操作步骤中使用。
在第一离子交换色谱步骤之前，通常对在生物反应器中生产的细胞浆液进行澄清(即除去所有细胞材料，诸如全细胞和细胞碎片)。
而且，在第一离子交换色谱步骤之前，可以添加调节溶液(添加到细胞浆液中或已经与细胞材料分离的含抗体溶液中)从而确保用于这个第一离子交换步骤的最佳的pH和传导性条件。
“流过级份”在本文中是指，被加载的含抗体级份的至少一部分，其以基本上没有被结合的方式离开色谱柱，并且/或者以与洗脱流体基本上相同的速度离开色谱柱。优选地，这个级份在洗脱期间基本上未保留在柱上。因此，选择条件，结果使得杂质而非抗体被结合到阴离子交换材料上并且结合到疏水作用材料上。
WO2006/020622已经公开了采用阴离子交换色谱和疏水作用色谱顺序处理蛋白质混合物来分离蛋白质。但是，在这篇专利申请中，(AEX和HIC)色谱柱二者都以“结合-洗脱”模式使用。此外，这个处理被描述为在通过2D电泳分析蛋白质混合物之前的预纯化。因此，其是(非常)小规模的分离。
我们已经发现，为了大规模生产的目的，本发明的方法(采用流过模式)与采用结合并洗脱所需抗体的现有公开方法相比提供远远更快的分离。
有利地，在HIC处理之前，用适当量的易溶盐/亲液(kosmotropic)盐补充含有抗体的分离混合物。该盐的阴离子可以优选选自由磷酸根离子、硫酸根离子、乙酸根离子、氯离子、溴离子、硝酸根离子、氯酸根离子、碘离子和硫代氰酸根离子组成的组。该盐的阳离子可以优选选自由铵离子、铷离子、钾离子、钠离子、锂离子、镁离子、钙离子和钡离子组成的组。优选的盐是硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾和氯化钠。
优选地，用适当量的易溶盐补充分离混合物是单一单元操作的一部分，例如在HIC步骤之前在工艺流中(例如在混合室中)在线混合该盐。
“适当量的易溶盐”在本文中是指，足以使大部分的相关杂质吸附到疏水作用材料上的易溶盐，但该用量足够低不会导致产物的结合或沉淀。对于每个纯化工艺来说，需要确定盐的最佳用量和优选类型。在使用硫酸铵的情况下，在线混合之后的浓度最可能介于0.1和1.0M之间。
根据本发明的AEX处理可以在AEX单元中进行，这可以通过经典的含有树脂的填充床柱子、含有整体材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有起阴离子交换剂作用的适当介质和配体的任何其他色谱装置来实现。在AEX柱中，色谱材料可以是其上附有或强或弱的阳离子配体的颗粒支撑材料形式。膜形式的阴离子交换剂由其上附有或强或弱的阳离子配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以包括有机材料、或无极材料、或有机和无机材料的混合物。适当的有机材料是琼脂糖基介质和甲基丙烯酸酯。适当的无极材料是硅石、陶瓷和金属。膜形式阴离子交换剂可由含有阳离子配体的亲水聚醚砜构成。适当的强阳离子配体例如基于季胺基团。适当的弱阳离子配体例如基于伯、仲或叔胺基团或本领域已知的任意其他适当配体。
根据本发明的HIC处理可以在HIC单元中进行，这可以通过经典的含有树脂的柱子、基于整体材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有适当起疏水作用材料作用的配体的任何其他色谱装置来实现。在HIC柱中，色谱材料可以是其上附有疏水配体的颗粒支撑材料形式。膜状色谱装置由其上附有疏水配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以包括有机材料、或无极材料、或有机和无机材料的混合物。适当的有机材料包括例如亲水性碳水化合物(例如交联的琼脂糖、纤维素或右旋糖苷)或合成共聚物材料(诸如聚(烷基天冬酰胺)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯和亚乙基二甲基丙烯酸酯的共聚物、或酰基化聚胺)。适当的无机支撑材料例如为硅石、硅石、陶瓷、和金属。膜形式HIC可由含有疏水配体的亲水聚醚砜构成。疏水配体的适当例子是直链或支链烷烃(诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基)，芳族基团(诸如苯基)，醚或聚醚诸如聚丙二醇。
可以根据本发明的方法纯化的抗体是等电pH为6.0或更高、优选7.0或更高、更有选7.5或更高的抗体。这些抗体可以是G类、A类或M类的免疫球蛋白。所述抗体可以是人类的或非人类的(诸如啮齿动物)或嵌合(例如人类化的)抗体，或者可以是上述免疫球蛋白的亚基，或者可以是由免疫球蛋白部分和衍生自或等同于另一蛋白质(非免疫球蛋白)的部分组成的杂交蛋白质。
令人惊讶地，由组合的AEX和HIC处理得到的抗体材料通常具有至少98％、优选至少99％、更有选至少99.9％、甚至更有选至少99.99％的非常高的纯度(指蛋白质含量)。
根据本发明的阴离子交换色谱步骤优选在中性或弱碱性pH下实施。其将去除带负电荷的杂质，如DNA、宿主细胞蛋白质、蛋白质A(如果存在)、病毒(如果存在)、蛋白质类培养基组分诸如胰岛素和胰岛素类生长因子(如果存在)。
在随后的疏水作用色谱步骤中，将去除大部分剩余的大分子杂质(大部分产物聚集体)，该步骤利用大分子杂质比单体型产物更疏水的性质并且设定条件使得它们结合到色谱装置上，与此同时产物流过。
随后，该高度纯化的材料通常不得不通过超滤和渗滤(diafiltration)进行处理，从而除去所有残余的低分子量杂质，用最终的制剂缓冲液替代该缓冲液，并且调节所需要的最终产物浓度。这个步骤也确保了所添加的易溶盐的去除。
此外，该高度纯化的材料通常还不得不进行处理以确保可能存在的感染性试剂(诸如病毒和/或朊病毒)的完全去除。
本发明还涉及含有阴离子交换色谱部分(AEX)和疏水作用色谱部分(HIC)二者的单一操作单元，这两个部分串联连接。这个单一操作单元还包括在阴离子交换色谱部分的上游端的入口和在疏水作用色谱部分的下游端的出口。这个单一操作单元还包括位于阴离子交换色谱部分和疏水作用色谱部分之间的连接部，该连接部进一步包括用于将易溶盐溶液供应到后一部分、从而供应到分离混合物的入口。
在根据本发明的工艺过程中，液体流可以通过任何商用双泵色谱系统例如explorer(GE)、BIOPROCESS(GE)、任意双泵HPLC系统、或者任何符合图1的定制的装置(符合图1)来确定。这些色谱装置中的大部分被设计成操作单一色谱单元(即柱或膜)。采用简单适配，可以进行额外连接以将阴离子交换器放置在泵A之后、混合室之前。
图1表示基本结构。以图1所标明的位置进行的两个色谱装置加上可选预过滤器的串联顺次连接可能导致不希望的压力累积。因此，在一些条件下，额外的技术适配(例如在AEX单元之后的额外的泵和在AEX单元之前的减压装置)可能必须包含在该图中。
附图说明
图1：包含阴离子交换色谱部分和疏水作用色谱部分二者的单一操作单元。缓冲液A是适用于AEX步骤的最佳操作的调节和冲洗缓冲液。缓冲液B包含易溶盐，并且以为了获得操作HIC步骤的最佳条件所必需的比率与负载/缓冲液A混合。该混合比可以利用固定的体积混合流来实现或者可以基于例如传导率输出结果通过物料反馈回路自动控制。MC是可选的混合室，其可以包含任何类型的静态混合器。
L＝负载
PA＝泵A
PB＝泵B
AEX＝阴离子交换单元
HIC＝疏水作用色谱单元
pH＝pH传感器
σ＝传导率传感器
PF＝可选的预过滤器
实施例
材料和方法
所有试验都利用通过人细胞系PER.C6的克隆P419生产的IgG1进行。
利用化学上确定的培养基以分批补料形式进行培养，此后通过三步深层过滤用过滤器序列ZetaPlus10M02P、ZetaPlus60ZA05和SterAssurePSA020(都来自Cuno(3M))除去细胞。
这样澄清后的收获物包含7.5g/LIgG并被储存在2-8℃。
首先，通过标准蛋白质A色谱的初步纯化利用MabSelect(GE)采用标准过程(加载经澄清的收获物、用20mMTris+150mMNaCl的头次冲洗、用pH5.5的缓冲液的二次冲洗、以及用缓冲液pH3.0洗脱)进行。为了找到用于随后纯化的最佳缓冲条件，二次冲洗和洗脱采用100mM乙酸缓冲液或采用100mM柠檬酸缓冲液进行。
在MabSelect洗脱之后，收集被洗脱的峰，并将其保持在pH3.5下1小时。此后，用2MTrispH9.0将样品中和至pH7.4，并用去矿物水对其进行稀释，以将传导率设定为5.0mS，然后将样品通过0.22μm过滤。
由此可得到的材料是在乙酸Tris缓冲液中的或者在柠檬酸Tris缓冲液中的经预纯化的IgG。采用这个材料，进行3个系列的实验：1.确定流过模式的AEX色谱的最佳条件(实验1)；2.确定流过模式的HI-色谱的最佳条件(实验2)；3.在一个单一单元操作实验中组合最佳的AEX和HIC条件(实验1)。
HCP通过ELIZA采用多克隆抗-PER.C6HCP进行测量。
单体型IgG和聚集体浓度通过尺寸排斥色谱(HP-SEC)根据标准过程测定。
实验1.
确定流过模式的阴离子交换色谱的最佳条件
流过模式的AEX色谱分离利用上述在乙酸Tris缓冲液中的或者在柠檬酸Tris缓冲液中的预纯化的IgG进行。测试如下AEX介质：MustangQcoins(0.35ml)(Pall)、SartobindQcapsule(1ml)、ChromaSorbcapsule(0.08ml)(Millipore)(均为膜吸附器)，和采用利用Poros50HQ树脂的填充床柱(appliedBiosystems)(1ml填充床)。
所有AEX介质利用explorer以40床体积/hr的流过方式运行。调节和洗涤缓冲液是100mM乙酸TrispH7.4(对于在乙酸缓冲液中的产物运行)或者是100mM柠檬酸TrispH7.4(对于在柠檬酸缓冲液中的产物运行)。每个AEX介质中加载的产物量为1.5g/ml膜或柱床体积。
在色谱分离步骤之前和之后测量HCP。对于AEX色谱分离性能来说，HCP去除被认为是最重要的。对于前述阴离子交换剂来说(均为单一实验)，HCP的log下降分别为1.9、1.7、1.8和2.1。利用柠檬酸媒介，所有AEX介质进行得相当糟糕，MustangQ、Chromasorb和Poros50HQ的HCPlog下降分别为1.2、0.2和1.3。这些结果表明，所有被测AEX色谱介质都适于利用乙酸缓冲液进行HCP的大体去除，并且表明在这些条件下HCPlog下降几乎是相当的。
实验2
确定流过模式的疏水作用色谱的最佳条件
对于HIC步骤，测试4种树脂：PhenylSepharoseFFlowsub(GE)，ToyopearlPPG600(Tosoh)，Toyopearlphenyl600(Tosoh)，Toyopearlbutyl600(Tosoh)。
对于这些实验，经预纯化的IgG处于pH为7.4、传导率为5.0mS的100mM乙酸Tris缓冲液中。此外，为了使聚集体的量增加至约20％，将经MabSelect预纯化的含IgG的材料在pH4和50℃下培养40min。
为了调节和洗涤，使用pH7.4、传导率5.0mS的100mM乙酸Tris缓冲液(缓冲液A)，其与一定体积百分比的缓冲液B在线混合。缓冲液B包含在pH7.4的100mM乙酸Tris缓冲液中的2M硫酸铵。所有树脂在产品加载期间利用与缓冲液B在线混合(以体积基础)进行测试。对于每种树脂，测试负载/缓冲液A和缓冲液B的若干百分率比。所有的柱体积为1ml，流速为100ml/hr，负载中的IgG量为0.29g/l，加载100ml。
对负载和流过物二者进行取样和分析。
在0％B时，Toyopearlphenyl600，Toyopearlbutyl600二者都已经结合了IgG以及聚集体的大部分。因此，得出这样的结论：这些树脂不适于在所应用的条件下利用P419IgG以流过模式进行聚集体的去除。
PhenylSepharoseFFlowsub(未示出)，ToyopearlPPG600(参见表1)二者在一定比率下利用在线混合含硫酸铵的缓冲液B以流过方式获得了良好的聚集体净化。
表1.使用ToyopearlPPG600以不同体积比在线混合含硫酸铵的缓冲液B的聚集体净化。
实施例1
在一个单一单元操作中以最佳AEX和HIC条件的IgG的纯化。
AEX单元和HIC单元以图1示意图所示顺次串联偶合。对于AEX，使用MustangQcoin，对于HIC，使用含有3mlToyopearlPPG600树脂的柱子。
对于产品加载前的树脂调节，使用pH7.4、传导率5.0mS的100mM乙酸Tris缓冲液(缓冲液A)。与此同时，以22％体积比在线混合缓冲液B。缓冲液B包含在pH7.4的100mM乙酸Tris缓冲液中的2M硫酸铵。
以与缓冲液A类似的流速泵入IgG来启动经预纯化的IgG的加载，同时停止缓冲液A的泵入。加载362ml含有4.37gIgG的溶液。加载完成后，为了从该系统回收所有产品，将泵转换回缓冲液A。此后，停止在线混合缓冲液B、因而使用100％缓冲液A(单独收集)来脱附(strip)HIC单元。在整个运行期间，通过HIC的流速为185ml/hr。整个时间(包括调节、洗涤和剥离)为3.5小时。分析负载和流过物的IgG聚集体比、DNA含量、HCP含量和蛋白质(产物)含量(A280)。HCP下降＞log2.3(流过物中HCP的量低于LoD)。聚集体的量在负载中为5.8％，在流过物中为1.2％。基于A280，产物的总回收率在没有脱附的情况下为86.7％，在包含脱附的情况下为90.1％。
使用的缩写：