《蛇莓多糖及其制备方法和用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛇莓多糖及其制备方法和用途.pdf（21页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101486771 B (45)授权公告日 2011.08.24 CN 101486771 B *CN101486771B* (21)申请号 200910024857.6 (22)申请日 2009.02.27 C08B 37/00(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (73)专利权人 中国药科大学 地址 210009 江苏省南京市童家巷 24 号 (72)发明人 陈建华 王婧 周安 陈楚桥 (74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102 代理人 姚姣阳 KR 2003-0083787 A。
2、,2003.11.01, 摘要 . CN 101120970 A,2008.02.13,说明书实施例 1-3. 吴梧桐 . 生物化学 第四版 . 生物化学 第 四版 . 人民卫生出版社 ,2001,17-18. 袁晓环等 . 中药蛇莓的研究及应用进展 . 中 国林副特产 .2008,( 第 5 期 ),92-93. 许文东等 . 蛇莓的化学成分 .沈阳药科大 学学报 .2007, 第 24 卷 ( 第 7 期 ),402-405. (54) 发明名称 蛇莓多糖及其制备方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及从植物中提取的多糖、 该多糖的 制备方法和用途， 属于生物制药领域。本发明中 多糖的制备是。
3、从蛇莓全草中提取分离出具有明显 抗水痘-带状疱疹病毒活性的总多糖DIP、 总多糖 DIP其中的中性多糖DIP1和酸性多糖DIP2、 以及酸 性多糖 DIP2中两种主要活性单体成分多糖 DIP30 和多糖DIP60。 原料蛇莓全草来源广泛， 易再生 ； 制 备方法便于操作， 重复性高。该多糖对水痘 - 带 状疱疹病毒表现出明显的抑制作用， 并且安全、 无 毒、 稳定， 是优质的抗病毒候选药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 陈洁 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 11 页 CN 101486771 B1/2 页 。
4、2 1. 蛇莓多糖， 是由以下方法制备得到 ： 以中药蛇莓为原料， 水浴 9 12 小时后回收提 取液 ； 将所得提取液在 2000 8000rpm 下离心 8 12min 后去除沉淀， 减压浓缩， 以 75 醇浓度醇沉， 得到蛇莓多糖， 命名为 DIP。 2. 根据权利要求 1 所述的蛇莓多糖中的中性多糖， 是由甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 岩藻糖构成， 命名为 DIP1， 其制备方法包括如下步骤 ： (1) 将所述蛇莓多糖 DIP 用水配成 1 20溶液， 离心去杂质， 按体积比 DIP 溶液 氯仿正丁醇 10 50 5 1 进行萃取， 振摇， 静置分层， 保留水相层，。
5、 重复操作 2 10 次 ； (2) 减压浓缩上层水相溶液， 醇沉， 沉淀干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖 DIP ； (3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖 DIP， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换柱层 析， 恒流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 收集洗脱液 ； (4) 将所述步骤 (3) 中的洗脱液减压浓缩至原来体积的 1/2 1/15， 加入 2 6 倍体 积无水乙醇， 室温静置 2 24h， 倾出上清液， 离心， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 离心， 重复上 述过程 2 次， 加热干燥， 得到中性多糖 DIP1。 3. 根据权利要求 1 所述的蛇莓多糖。
6、中的酸性多糖， 是由甘露糖、 鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半乳糖醛酸、 葡萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 岩藻糖构成， 命名为 DIP2， 其制备方法包括如 下步骤 ： (1) 将所述蛇莓多糖 DIP 用水配成 1 20溶液， 离心去杂质， 按体积比 DIP 溶液 氯仿正丁醇 10 50 5 1 进行萃取， 振摇， 静置分层， 保留水相层， 重复操作 2 10 次 ； (2) 减压浓缩上层水相溶液， 醇沉， 沉淀干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖 DIP ； (3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖 DIP， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换柱 层析， 恒流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚。
7、 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原来体积 的 1/2 1/15， 过滤， 除中性盐后得到洗脱液 ； (4) 将所述步骤 (3) 中的洗脱液减压浓缩至原来体积的 1/2 1/15， 加入 2 6 倍体 积无水乙醇， 室温静置 2 24h， 倾出上清液， 离心， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 离心， 重复上 述过程 2 次， 加热干燥， 得到酸性多糖 DIP2。 4. 根据权利要求 3 所述的酸性多糖 DIP2中的活性单体成分多糖， 其结构为含有甘露 糖、 鼠李糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖、 半乳糖。
8、、 磷酸基和氨基的酸性杂多糖， 命名为DIP30， 分子量 为 198 万， 其制备方法包括如下步骤 ： (1) 称取中药蛇莓， 将其溶于 5 25 倍体积水中， 水浴 3 6 小时后回收提取液， 过滤 后得滤液， 另将滤渣溶于 5 25 倍体积、 pH7 13 的 NaOH 溶液中， 继续加热水浴 3 6 小 时， 过滤后得滤液 ； 混合上述两次滤液得水煮提取液 ； (2)将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/21/15， 冷却后离心去除沉淀， 上清溶液加 入乙醇， 使乙醇终浓度为 0 50， 得到活性单体成分多糖 DIP30粗品 ； (3) 将活性单体成分多糖 DIP30粗品配成 5 20mg。
9、/ml 水溶液， 加入活化后的碱性阴离 子交换树脂脱色， 树脂用量控制在溶液体积的 5 20 倍， 去除色素后水溶液浓缩， 醇沉， 过 夜， 醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3 次， 加热烘干， 得到除色素后的 DIP30； 权 利 要 求 书 CN 101486771 B2/2 页 3 (4) 称取除色素后的 DIP30， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换柱层析， 恒 流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶 液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原体积的 1/2 1/15。
10、， 过滤， 除中性盐 ； (5) 将经过离子交换柱层析的 DIP30进行分子筛柱层析， 分部收集， 用硫酸苯酚法检测， 合并糖峰主要部分， 冷冻干燥， 得到 DIP30精品。 5. 根据权利要求 3 所述的酸性多糖 DIP2的活性单体成分多糖， 其结构为含有鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半乳糖醛酸、 半乳糖、 磷酸基和氨基的酸性杂多糖， 命名为 DIP60， 分子量为 3.4 万， 其制备方法包括如下步骤 ： (1) 称取中药蛇莓， 将其溶于 5 25 倍体积水中， 水浴 3 6 小时后回收提取液， 过滤 后得滤液， 另将滤渣溶于 5 25 倍体积、 pH7 13 的 NaOH 溶液中， 继续加热水。
11、浴 3 6 小 时， 过滤后得滤液 ； 混合上述两次滤液得水煮提取液 ； (2)将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/21/15， 冷却后离心去除沉淀， 上清溶液加 入乙醇， 使乙醇终浓度为 50 90， 得到活性单体成分多糖 DIP60粗品 ； (3) 将活性单体成分多糖 DIP60粗品配成 5 20mg/ml 水溶液， 加入活化后的碱性阴离 子交换树脂脱色， 树脂用量控制在溶液体积的 5 20 倍， 去除色素后水溶液浓缩， 醇沉， 过 夜， 醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3 次， 加热烘干， 得到除色素后的 DIP60； (4) 称取除色素后的 DIP60， 用水配成 0.5 5溶液， 离。
12、心去杂质， 离子交换柱层析， 恒 流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶 液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原体积的 1/2 1/15， 过滤， 除中性盐 ； (5) 将经过离子交换柱层析的 DIP60进行分子筛柱层析， 分部收集， 用硫酸苯酚法检测， 合并糖峰主要部分， 冷冻干燥， 得到 DIP60精品。 6. 根据权利要求 1 所述的蛇莓多糖 DIP、 权利要求 2 所述的中性多糖 DIP1、 权利要求 3 所述的酸性多糖DIP2、 权利要求4所述的活性单体成分多糖DIP30或权利要求。
13、5所述的活性 单体成分多糖 DIP60在制备抗水痘 - 带状疱疹病毒的药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 101486771 B1/7 页 4 蛇莓多糖及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及从植物中提取的多糖， 该多糖的制备方法和用途， 属于生物制药领域。 背景技术 0002 水痘带状疱疹病毒 (Varicella-Zoster Virus， 简称 VZV) 属于疱疹病毒科， 疱 疹病毒亚科， 水痘病毒属， 其基因组序列与同属于 疱疹病毒亚科的单纯疱疹病毒 1 型 (Herpes Simplex Virus 1， HSV-1)及单纯疱疹病毒2型(HerpesSimplex V。
14、irus 2， HSV-2) 极为相近。水痘 - 带状疱疹病毒 (VZV) 为 DNA 双链病毒， 长度约为 125000 个碱基对， 可以 引起水痘和带状疱疹两种疾病。其原发感染为水痘， 潜伏再度激活则引起带状疱疹。水痘 大多见于1-10岁的儿童， 潜伏期在2-3周， 起病较急， 会出现发热、 头痛、 全身倦怠等前驱症 状。水痘病变主要在表皮棘细胞， 个别病例病变可累及肺、 食管、 胃、 小肠、 肝、 肾上腺、 胰等 处， 引起局部充血、 出血、 炎细胞侵润及局灶性坏死。 带状疱疹多发于成年人和老年人， 成因 是水痘 - 带状疱疹病毒 (VZV) 原发感染后病毒进入皮肤的感觉神经末梢， 持久。
15、地潜伏于脊 髓神经后根或脑神经节的神经元中。在多种诱发因素刺激的作用下， 如发热、 恶性肿瘤、 使 用免疫抑制剂、 外伤、 过劳等， 神经节内的病毒可被激活， 沿周围神经波及皮肤， 诱发带状疱 疹 (HerpesZoster， HZ)， 且伴随后遗神经痛 (Postherpetic neuralgia， PHN)。 0003 疱疹净 (Idoxuridine， IDU) 是第一个进行临床治疗带状疱疹 (HZ) 的有效抗病毒 药物， 为胸腺嘧啶核苷的结构类似物， 在细胞内可以置换病毒 DNA 中胸腺嘧啶核苷， 形成异 常核酸而抑制水痘 - 带状疱疹病毒复制。阿糖胞苷 (Cytarabine)、 。
16、阿糖腺苷 (Vidarabine) 也被用于疱疹病毒的治疗。 以上三种 药物早期曾被用于疱疹病毒的治疗， 因受到高毒低活 性的局限， 目前已经被阿昔洛韦 (Aciclovir， ACV) 替代， 阿昔洛韦是治疗此种疾病的首选 药物， 但是它生物利用度低， 长期使用可引起皮炎， 并可造成耐药性。因此， 又陆续发展出 了一系列与阿昔洛韦抗病毒机制相近的药物， 其作用机制均是通过病毒 DNA 编码的胸苷激 酶 (Thymidine kinase， TK) 被磷酸化为含磷酸基的活性分子， 进一步通过宿主细胞内细胞 激酶 (Cellular kinase) 作用而生成二磷酸活性分子及三磷酸活性分子。三磷。
17、酸活性分 子通过与病毒 DNA 聚合酶的底物 dGTP 竞争， 从而终止病毒 DNA 的合成， 可竞争性抑制病毒 DNA 聚合酶， 阻断 DAN 合成、 病毒复制。此类药物中抗带状疱疹病毒的代表药物有 ： 喷昔洛 韦 (Penciclovir， PCV)、 泛昔洛韦 (Famciclovir， FCV)、 昔多福韦 (Cidofovir)。尽管这些 药物作为抗病毒药已广泛应用于临床， 但是受药物副作用的影响以及病毒抗药株的出现， 急需研制新型的、 毒副作用低且高效的抗病毒药物。 发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷， 提供一种从植物中提取的、 具有抗水 痘带状疱疹病毒活性的。
18、多糖， 该多糖安全、 无毒、 对病毒表现出明显的抑制作用， 可以作为 抗水痘带状疱疹病毒的候选药物。 0005 本发明涉及的植物是蛇莓 Duchesnea indica(Andr.)Focke， 为蔷薇科蛇莓属植 说 明 书 CN 101486771 B2/7 页 5 物， 又名地莓、 三叶莓、 野杨梅等， 药用干燥全草， 或鲜用。民间用以治疗带状疱疹、 白喉、 肠 炎、 痢疾、 烫伤等。本草纲目 记载 ：“此物就地引细蔓， 节节生根， 每枝三叶， 叶有齿刻， 四五 月开小黄花， 五出， 结实鲜红， 状似复盆， 而面与蒂则不同也， 其根甚细。 ” 属本草 、本草衍 义 、植物名实图考 等传统医。
19、药书籍中均有记载。蛇莓适应力强， 在我国辽宁以南地区广 泛分布。 蛇莓性耐寒， 喜生于阴湿环境， 常生于沟边潮湿草地。 对土壤要 求不严。 蛇莓全草 多缠绕成团， 被白色毛茸， 具匍匐茎， 叶互生。三出复叶， 基生叶的叶柄长 6-10cm， 小叶多皱 缩， 完整者倒卵形， 长 1.5-4cm， 宽 1-3cm， 基部偏斜， 边缘有钝齿， 表面黄绿色， 上面近无毛， 下面被疏毛。花单生于叶腋， 具长柄。聚合果棕红色， 瘦果小， 花萼宿存。气微， 味微涩。显 微鉴定 ： 叶表面观 ： 上表皮细胞类多角形， 下表皮细胞略波状弯曲， 垂周壁念珠状增厚。下 表皮非腺毛及腺毛较上表皮为多， 非腺毛单细胞，。
20、 长 166-900m， 基部直径 18-38m， 壁厚 6-12m， 表面有螺状纹理 ； 腺毛头部 2 细胞， 直径 25-32m ； 柄部 2-3 细胞。气孔不定式或 不等式， 副卫细胞 4-5 个。叶肉细胞有的含草酸钙簇晶。蛇莓全草外敷或取汁外涂， 治疗 带状疱疹的效果比阿昔洛韦或聚肌胞注射液更为显著 ( 芦启兴 蛇莓治疗带状疱疹疗效观 察 )。 0006 本发明所提供的多糖来源于蛇莓， 以中药蛇莓为原料， 水浴 9-12 小时后回收提取 液 ； 将所得提取液在 2000-8000rpm 下离心 8-12min 后去除沉淀， 减压浓缩， 以 75醇浓度 醇沉， 得到蛇莓多糖， 命名为 D。
21、IP。一种存在于蛇莓多糖 DIP 中的中性多糖， 是由甘露糖、 葡 萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 岩藻糖构成， 命名为 DIP1， 其制备方法包括如下步骤 ： 0007 (1) 将所述蛇莓多糖 DIP 用水配成 1 20溶液， 离心去杂质， 按 DIP 溶液氯 仿正丁醇 (V/V)10 50 5 1 进行萃取， 振摇， 静置分层， 保留水相层， 重复操作 2 10 次 ； 0008 (2) 减压浓缩上层水相溶液， 醇沉， 沉淀干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖 DIP ； 0009 (3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖 DIP， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换 柱层析， 恒流上样， 。
22、结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 收集洗脱液 ； 0010 (4) 将所述步骤 (3) 中的洗脱液减压浓缩至原来体积的 1/2 1/15， 加入 2 6 倍体积无水乙醇， 室温静置 2 24h， 倾出上清液， 离心， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 离心， 重 复上述过程 2 次， 加热干燥， 得到中性多糖 DIP1。 0011 一种存在于蛇莓多糖 DIP 中的酸性多糖， 是由甘露糖、 鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半乳 糖醛酸、 葡萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 岩藻糖构成， 命名为 DIP2， 其制备方法包括如下步 骤 ： 0012 (1) 将所述蛇莓多糖 DIP 用。
23、水配成 1 20溶液， 离心去杂质， 按 DIP 溶液氯 仿正丁醇 (V/V)10 50 5 1 进行萃取， 振摇， 静置分层， 保留水相层， 重复操作 2 10 次 ； 0013 (2) 减压浓缩上层水相溶液， 醇沉， 沉淀干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖 DIP ； 0014 (3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖 DIP， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换 柱层析， 恒流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚-硫酸法检测无阳性反应后， 用02.0mol/ L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原来体 积的 1/2 1/15， 过滤， 除中性盐。
24、后得到洗脱液 ； 0015 (4) 将所述步骤 (3) 中的洗脱液减压浓缩至原来体积的 1/2 1/15， 加入 2 6 说 明 书 CN 101486771 B3/7 页 6 倍体积无水乙醇， 室温静置 2 24h， 倾出上清液， 离心， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 离心， 重 复上述过程 2 次， 加热干燥， 得到酸性多糖 DIP2。 0016 一种存在于酸性多糖 DIP2中的活性单体成分多糖， 其结构为含有甘露糖、 鼠李糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖、 半乳糖、 磷酸基和氨基的酸性杂多糖， 命名 为 DIP30， 分子量为 198 万， 其制备方法包括如下步骤 ： 0017 (1) 称取中药蛇。
25、莓， 将其溶于 5 25 倍体积水中， 水浴 3 6 小时后回收提取液， 过滤后得滤液， 另将滤渣溶于 5 25 倍体积、 pH7 13 的 NaOH 溶液中， 继续加热水浴 3 6 小时， 过滤后得滤液 ； 混合上述两次滤液得水煮提取液 ； 0018 (2)将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/21/15， 冷却后离心去除沉淀， 上清溶 液加入乙醇， 使乙醇终浓度为 0 50， 得到活性单体成分多糖 DIP30粗品 ； 0019 (3) 将活性单体成分多糖 DIP30粗品配成 5 20mg/ml 水溶液， 加入活化后的碱性 阴离子交换树脂脱色， 树脂用量控制在溶液体积的 5 20 倍， 加热振摇。
26、， 去除色素后水溶 液浓缩， 醇沉， 过夜， 醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3 次， 加热烘干， 得到除色素后的 DIP30； 0020 (4) 称取除色素后的 DIP30， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换柱层 析， 恒流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原体积的 1/2 1/15， 过滤， 除中性盐 ； 0021 (5) 将经过离子交换柱层析的 DIP30进行分子筛柱层析， 分部收集， 用硫酸苯酚法 检测， 合并糖峰主要部分， 。
27、冷冻干燥， 得到 DIP30精品。 0022 一种存在于酸性多糖 DIP2中的活性单体成分多糖， 其结构为含有鼠李糖、 葡萄糖 醛酸、 半乳糖醛酸、 半乳糖、 磷酸基和氨基的酸性杂多糖， 命名为 DIP60， 分子量为 3.4 万， 其 制备方法， 包括如下步骤 ： 0023 (1) 称取中药蛇莓， 将其溶于 5 25 倍体积水中， 水浴 3 6 小时后回收提取液， 过滤后得滤液， 另将滤渣溶于 5 25 倍体积、 pH7 13 的 NaOH 溶液中， 继续加热水浴 3 6 小时， 过滤后得滤液 ； 混合上述两次滤液得水煮提取液 ； 0024 (2)将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/21/15。
28、， 冷却后离心去除沉淀， 上清溶 液加入乙醇， 使乙醇终浓度为 50 90， 得到活性单体成分多糖 DIP60粗品 ； 0025 (3) 将活性单体成分多糖 DIP60粗品配成 5 20mg/ml 水溶液， 加入活化后的碱性 阴离子交换树脂脱色， 树脂用量控制在溶液体积的 5 20 倍， 去除色素后水溶液浓缩， 醇 沉， 过夜， 醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3 次， 加热烘干， 得到除色素后的 DIP60； 0026 (4) 称取除色素后的 DIP60， 用水配成 0.5 5溶液， 离心去杂质， 离子交换柱层 析， 恒流上样， 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后，。
29、 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 按洗脱曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原体积的 1/2 1/15， 过滤， 除中性盐 ； 0027 (5) 将经过离子交换柱层析的 DIP60进行分子筛柱层析， 分部收集， 用硫酸苯酚法 检测， 合并糖峰主要部分， 冷冻干燥， 得到 DIP60精品。 0028 同时， 对上述的多糖 DIP30和多糖 DIP60的纯度和分子量采用高效液相色谱 (HPLC) 检测。选取 Agilent 高效液相层析系统， 色谱柱为 Shodex 公司 KS-805 柱， 示差折光检测器 说 明 书 CN 101486771 B4/7 页 7 检。
30、测， 分析软件为 Agilent Data Analysis， 流动相为乐百氏纯净水， 柱温 10 50， 流速 0.1 3.0ml/min， 最大柱压 20 100bar。称取适量标准糖 T10、 T40、 T70、 T500、 T2000， 配 成 0.01 20mg/ml 的样品， 每个样品进 样 20 200ul， 根据标准糖分子量的对数为纵坐 标， 出峰时间为横坐标做标准曲线。称取适量 DIP30、 DIP60， 配成 0.01 20mg/ml 的样品， 每 个样品进样 20 200ul， 根据出峰情况判断待测样品的纯度， 同时将出峰时间带入标准曲 线， 计算分子量。对上述制得的多糖。
31、 DIP1， 多糖 DIP2， 多糖 DIP30和多糖 DIP60结构的鉴定是 应用1-苯基-3-甲基吡唑啉哃(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法、 核磁共振氢谱(1H NMR)、 核磁共振碳谱 (13C NMR)、 红外光谱 (IR)、 紫外 (UV) 及甲基化分析得出。 0029 本发明的另一个目的是提供以上蛇莓多糖在制备抗水痘 - 带状疱疹病毒的药物 中的用途。通过建立水痘 - 带状疱疹病毒 (VZV) 感染人胚肺成纤维细胞 (HELF) 的模型， 由多糖抑制水痘带状疱疹病毒 (VZV) 感染的实验结果表明， 本发明对水痘 - 带状疱疹病毒 (VZV) 活性有明显抑制作用。与传统的抗病毒药。
32、物阿昔洛韦 (ACV) 相比， DIP， DIP1， DIP2， DIP30和 DIP60半效浓度 EC50更低， 抗带状疱疹病毒 (VZV) 活性更强。 0030 本发明的来源是蔷薇科的蛇莓属植物蛇莓， 该植物易繁殖， 适应生长地域广泛， 栽 培技术简单， 因此， 植物来源丰富。 本发明利用生物技术从蛇莓全草中提取分离出具有明显 抗带状疱疹病毒活性的总多糖 DIP、 总多糖 DIP 其中的中性多糖 DIP1和酸性多糖 DIP2、 以 及酸性多糖 DIP2中两种主要活性单体成分多糖 DIP30和多糖 DIP60， 方法便于操作， 安全、 无 毒、 对病毒表现出明显的抑制作用， 可以作为活性成分。
33、添加进抗水痘带状疱疹病毒药物中， 是优质的抗病毒候选药物。 附图说明 0031 图 1 为多糖 DIP30的 HPLC 谱图。 0032 图 2 为多糖 DIP60的 HPLC 谱图。 0033 图 3 为多糖 DIP30的紫外 (UV) 谱图。 0034 图 4 为多糖 DIP60的紫外 (UV) 谱图。 0035 图 5 为多糖 DIP30的红外 (IR) 谱图 0036 图 6 为多糖 DIP30的红外 (IR) 谱图。 0037 图 7 为多糖 DIP30的 1HNMR 谱图。 0038 图 8 为多糖 DIP30的 1HNMR 谱图。 0039 图 9 为多糖 DIP30的 13CN。
34、MR 谱图。 0040 图 10 为多糖 DIP30的 13CNMR 谱图。 0041 图 11 为多糖 DIP1的 PMP 柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 0042 图 12 为多糖 DIP2的 PMP 柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 0043 图 13 为多糖 DIP30的 PMP 柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 0044 图 14 为多糖 DIP30的 PMP 柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 0045 图 15 为多糖 DIP， DIP1， DIP2， DIP30， DIP60与 ACV 比较的 EC50和 TI。 具体实施方式 0046 以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。 。
35、说 明 书 CN 101486771 B5/7 页 8 0047 实施例一 0048 制备并鉴定蛇莓多糖 DIP ： 0049 将干燥并粉碎的蛇莓全草用水溶胀过夜后， 100水浴10小时， 每1h搅拌一次， 回 收提取液， 6000rpm 离心 10min 去除沉淀， 减压浓缩， 75醇浓度醇沉， 得 DIP。细胞病变抑 制实验 ( 详细方法请参照实施例八 ) 证明 DIP 即为抗病毒活性物质。采用 - 萘酚 - 硫酸 显色反应， 鉴定所得溶液呈橙色， 为多糖特征反应， 证明所得的主要成分为多糖。 0050 实施例二 0051 制备蛇莓多糖中的中性多糖 DIP1： 0052 将蛇莓多糖 DIP。
36、 用水配成 1溶液， 离心去杂质， 按 DIP 溶液氯仿正丁醇 (V/ V)25 5 1 进行萃取， 振摇 10min， 静置分层， 保留水相层， 重复操作 5 次。减压浓缩上层 水相溶液， 醇沉。用 DEAE-52 离子交换柱以 10 倍水浸泡溶涨过夜， 换水漂洗 1 2 次， 然后 依次用 0.5mol/L HCl、 0.5mol/L NaOH、 0.5mol/LHCl 活化， 真空脱气， 装柱平衡。称取脱蛋 白后的 DIP， 用水配成 0.5溶液， 离心去杂质， 用恒流泵上样， 上样流速为 1ml/min。上样 结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 收集水洗脱液，。
37、 减压浓缩至原来 体积的 1/10， 加入 3 倍体积无水乙醇， 室温静置 8h。倾出上清液， 液固部分以 8000rpm 离心 10min， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 8000rpm 离心 10min， 重复上述过程 2 次， 60真空干燥 8h， 得到中性多糖 DIP1。 0053 实施例三 0054 制备蛇莓多糖中的酸性多糖 DIP2： 0055 将蛇莓多糖 DIP 用水配成 1溶液， 离心去杂质， 按 DIP 溶液氯仿正丁醇 (V/ V)25 5 1 进行萃取， 振摇 10min， 静置分层， 保留水相层， 重复操作 5 次。减压浓缩上层 水相溶液， 醇沉。用 DEAE-52 离子交换。
38、柱以 10 倍水浸泡溶涨过夜， 换水漂洗 1 2 次， 然后 依次用0.5mol/L HCl、 0.5mol/L NaOH、 0.5mol/LHCl活化， 真空脱气， 装柱平衡。 称取脱蛋白 后的 DIP 适量， 用水配成 0.5溶液， 离心去杂质， 用恒流泵上样， 上样流速为 1ml/min。上 样结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线 性梯度洗脱， 自动部分收集器分管收集， 3ml/ 管， 控制滴速 0.5ml/min。按洗脱曲线收集糖 集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原来体积的 1/10， 过滤， 透析。透析过的溶液减压。
39、浓缩 至原来体积的1/10， 加入3倍体积无水乙醇， 室温静置8h。 倾出上 清液， 液固部分8000rpm 离心10min， 沉淀加无水乙醇洗涤脱水， 8000rpm离心10min， 重复上述过程2次， 60真空干 燥 8h， 得到酸性多糖 DIP2。 0056 实施例四 0057 制备多糖 DIP2中的酸性杂多糖 DIP30： 0058 称取蛇莓全草100g溶于1500ml水中， 85水浴中搅拌加热3h， 纱布过滤， 得滤液。 另精确调 pH9 的 NaOH 溶液 1500ml 继续 85水浴中浸泡搅拌加热 3h， 过滤溶渣最后共得水 煮提取液。将水煮提取液浓缩至 1/10， 冷却后有不溶。
40、物用 4000rpm 离心 10min， 上清溶液加 入乙醇， 使乙醇终浓度为 30， 得 DIP30粗品。DIP30粗品配成 5mg/ml 水溶液， 分别加入活 化后的弱碱性阴离子交换树脂 (D311， D301R， 96C， 330， D318， 900， 717)， 每 100ml 溶液中加 入 8g 树脂， 摇床 220r/m 震摇 8h， 温度为 30。去除色素后水溶液浓缩， 醇沉， 过夜。然后 将脱色后的醇沉产物用无水乙醇洗涤， 8000rpm 离心 10min， 洗涤加离心反复 3 次， 烘箱烘 说 明 书 CN 101486771 B6/7 页 9 干， 得除色素后 DIP30。
41、粗品。用 DEAE-52 离子交换柱以 10 倍水浸泡溶涨过夜， 换水漂洗 1 2 次， 然后依次用 0.5mol/L HCl、 0.5mol/L NaOH、 0.5mol/L HCl 活化处理， 真空脱气， 装柱 平衡。称取 DIP30粗品适量， 用水配成 2.5溶液， 离心去杂质， 用恒流泵上样， 上样流速为 1ml/min。上样结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 自动部分收集器分部收集， 3ml/ 管， 控制滴速 0.5ml/min。按洗脱 曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原来体积的1/10， 。
42、过滤。 浓缩液上SEPHADEX G25 填料， 水洗脱， 流速为 0.5ml/min， 3ml/ 管， 用苯酚硫酸法测定糖峰的起始， 用 AgNO3 溶 液测定 NaCl 的出峰管数， 收集糖峰部分。将分子筛填料 (Sephacryl-300， Sephacryl-400， SEPHADEX G-200， SEPHADEX G-300) 溶涨过夜， 与 pH13 的 NaOH 溶液 (V V)1 1 混合， 搅 匀放置 1h， 用蒸馏水洗至中性， 装柱备用。将经过 DEAE-52 离子交换柱分离的 DIP30进行 分子筛柱层析， 分部收集， 硫酸苯酚法检测， 合并糖峰主要部分， 冷冻干燥， 。
43、得到酸性杂多糖 DIP30精品。 0059 实施例五 0060 制备多糖 DIP2中的酸性杂多糖 DIP60： 0061 称取蛇莓全草100g溶于1500ml水中， 85水浴中搅拌加热3h， 纱布过滤， 得滤液。 另精确调 pH9 的 NaOH 溶液 1500ml 继续 85水浴中浸泡搅拌加热 3h， 过滤溶渣最后共得水 煮提取液。将水煮提取液浓缩至 1/10， 冷却后有不溶物， 4000rpm 离心 10min， 上清溶液依 次加入乙醇， 使乙醇终浓度为 60， 得 DIP60粗品。DIP60粗品配成 5mg/ml 水溶液， 分别加入 活化后的弱碱性阴离子交换树脂 (D311， D301R，。
44、 96C， 330， D318， 900， 717)， 每 100ml 溶液中 加入 8g 树脂， 摇床 220r/m 震摇 8h， 温度为 30。去除色素后水溶液浓缩， 醇沉， 过夜。然 后将脱色后的醇沉产物用无水乙醇洗涤， 8000rpm离心10min， 洗涤加离心反复3次， 烘箱烘 干， 得除色素后 DIP60。DEAE-52 离子交换柱以数十倍水浸泡溶涨过夜， 中途换水漂洗 1 2 次， 然后依次用 0.5mol/L HCl、 0.5mol/L NaOH、 0.5mol/L HCl 活化处理， 真空脱气， 装柱 平衡。称取 DIP60粗品适量， 用水配成 2.5溶液， 离心去杂质， 用。
45、恒流泵上样， 上样流速为 1ml/min。上样结束后， 用水洗脱， 洗至苯酚 - 硫酸法检测无阳性反应后， 用 0 2.0mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 自动部分收集器分部收集， 3ml/ 管， 控制滴速 0.5ml/min。按洗脱 曲线收集糖集中部分， 将收集的组分减压浓缩至原来体积的1/10， 过滤。 浓缩液上SEPHADEX G25 填料， 水洗脱， 流速为 0.5ml/min， 3ml/ 管， 用苯酚硫酸法测定糖峰的起始， 用 AgNO3 溶 液测定 NaCl 的出峰管数， 收集糖峰部分。将分子筛填料 (Sephacryl-300， Sephacryl-400， SEPHAD。
46、EX G-200， SEPHADEX G-300) 溶涨过夜， 与 pH13 的 NaOH 溶液 (V V)1 1 混合， 搅 匀放置 1h， 用蒸馏水洗至中性， 装柱备用。将经过离 子交换柱 (DEAE-52) 分离的 DIP60进 行分子筛柱层析， 分部收集， 硫酸苯酚法检测， 合并糖峰主要部分， 冷冻干燥， 得到酸性杂多 糖 DIP60精品。 0062 实施例六 0063 检测多糖 DIP30和多糖 DIP60的纯度和分子量 ： 0064 对上述的多糖 DIP30和多糖 DIP60的纯度和分子量采用高效液相色谱 (HPLC) 检 测。称取 DIP30、 DIP60， 配成 10mg/ml。
47、 的样品， 每个样品进样 25ul， 选取 Agilent 高效液相层 析系统， 色谱柱为 Shodex 公司 KS-805 柱， 示差折光检测器检测， 分析软件为 Agilent Data Analysis， 流动相为乐百氏纯净水， 柱温 30， 流速 1.0ml/min， 最大柱压 50bar。根据出峰 说 明 书 CN 101486771 B7/7 页 10 情况判断待测样品的纯度， 同时将出峰时间带入标准曲线， 计算分子量。计算后得 DIP30的 分子量为 198 万， 见图 1 ； DIP60的分子量为 3.4 万， 见图 2。 0065 实施例七 0066 检测所得多糖的结构 ： 。
48、0067 取多糖 DIP30， 多糖 DIP60， 各 3ml， 配制成 0.1溶液， 紫外下全波长扫描 ( 见图 3， 图 4)。取多糖 DIP30， 多糖 DIP60， 各 3mg， 加溴化钾压片， Nicolet Impact410 红外光谱仪下 扫描， 见图 5 和图 6。吸取 100ul 的浓度为 4 5mg/ml 的多糖 DIP1、 多糖 DIP2、 多糖 DIP30 和多糖 DIP60样品溶液于具塞刻度试管中， 通过 1- 苯基 -3- 甲基吡唑啉哃 (PMP) 柱前衍生， 采用反相高效液相色谱 / 紫外检测器分离检测。取多糖 DIP30， 多糖 DIP60， 各 50mg， 溶。
49、于氘 代水 (D2O)， 30于 Varian300 兆核磁共振仪上分析。DIP30的核磁共振氢谱 (1H NMR)、 核磁 共振碳谱(13C NMR)见图7和图8 ； DIP60的核磁共振氢谱(1H NMR)、 核磁共振碳谱(13C NMR) 见图 9 和图 10。检测结果 ： 多糖 DIP1为含甘露糖、 核糖、 葡萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖的 中性多糖， 见图11。 多糖DIP2为含甘露糖、 鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半 乳糖醛酸、 葡萄糖、 半乳 糖、 木糖、 阿拉伯糖、 岩藻糖的酸性多糖， 见图 12。DIP30的结构为含甘露糖、 鼠李糖、 半乳糖 醛酸、 葡萄糖、 半乳糖和磷酸基、 氨基的酸性杂多糖， 见图13。 DIP60的结构为含鼠李糖、 葡萄 糖醛酸、 半乳糖醛酸、 半乳糖和磷酸基、 氨基的酸性杂多糖， 见图 14。 0068 实施例八 0069 待 96 孔板中的人胚肺成纤维细胞 (Human Emb。