《乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510834328.8 (22)申请日 2015.11.25 C12N 15/87(2006.01) (71)申请人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路 35 号 (72)发明人 万迎朗 包文龙 王强 王君雅 (74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11491 代理人 郭伟红 (54) 发明名称 乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物 活性分子导入植物细胞的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种乳酸根插层的类水滑石 超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的 方法， 合成乳酸根插层的类水滑石。
2、纳米材料， 在 水中剥离获得二维纳米片 ； 对 LDH-lactate-NS 进行 XRD 等表征分析鉴定 ； 用含有不同浓度 LDH-lactate-NS 的培养基处理模式植物材料 BY-2细胞和拟南芥， 获得LDH-lactate-NS负载生 物活性分子导入植物细胞的安全浓度 ； 将生物活 性分子和 LDH-lactate-NS 以不同的质量比进行 偶联， 获得最优吸附比的纳米片 - 生物活性分子 复合物 ； 将最优吸附比的纳米片 - 生物活性分子 复合物与植物细胞共孵育， 以最优孵育时间将生 物活性分子导入完整的活体植物细胞中。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权。
3、局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 105441484 A 2016.03.30 CN 105441484 A 1.一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法， 其 特征在于， 按照以下步骤进行： 步骤1， 合成乳酸根插层的类水滑石纳米材料MgAl-lactateLDH， 在水中剥离获得二维 纳米片LDH-lactate-NS； 步骤2， 对LDH-lactate-NS进行XRD等表征分析鉴定； 步骤3， 用含有不同浓度LDH-lactate-NS的缓冲液处理BY-2细胞和拟南芥， 获得其负载 生物活性分子导入植物细胞的安全浓度； 步。
4、骤4， 将生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的质量比进行偶联； 步骤5， 将二维纳米片-生物活性分子复合物与植物细胞共孵育， 把生物活性分子导入 植物细胞中。 2.根据权利要求1所述的一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导 入植物细胞的方法， 其特征在于， 所述步骤1具体按照以下步骤进行： 将镁/铝摩尔比为0.5:1-6:1的镁铝乳酸盐于125mL双蒸水中在30-100条件下溶解配 制成溶液A置于分液漏斗中； 另将大于等于铝的摩尔量的L-乳酸溶于25mL双蒸水中， 配制成 溶液B置于三颈圆底烧瓶中； 在室温下快速搅拌将溶液A逐滴滴入溶液B中， 滴定过程中用氢 氧化钠。
5、溶液控制其pH体系， 维持pH值为8-12； 待滴定完毕后， 继续剧烈搅拌并陈化5-48h， 得 到乳白色混合物， 用双蒸水通过离心方法反复洗涤直至上清液变浑浊； 将离心后的样品分 为两份， 一份置于真空干燥箱里室温干燥， 干燥后研磨， 所得粉末为MgAl-lactateLDH； 另 一份置于一定量的双蒸水中， 剧烈搅拌直至没有沉淀变为透明状得到悬浊液C， 悬浊液C的 浓度由干燥后MgAl-lactateLDH质量和双蒸水的含量计算得出， 记为LDH-lactate-NS， 全 过程在N2保护下进行。 3.根据权利要求1所述的一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导 入植物细胞的方。
6、法， 其特征在于， 所述步骤2具体按照以下步骤进行： 将剥离的LDH- lactate-NS滴在铜网上进行透射电子显微镜成像， 并烘干LDH-lactate-NS进行扫描电子显 微镜成像， 采用凝胶法将LDH-lactate-NS置于托盘获得XRD特征谱， 并用激光照射LDH- lactate-NS胶体检测丁达尔现象。 4.根据权利要求1所述的一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导 入植物细胞的方法， 其特征在于， 所述步骤4中， LDH-lactate-NS： 带负电荷的生物活性分子 DNA质量比为3:1时， LDH-lactate-NS： 带负电荷的生物活性分子FITC质量比。
7、为5:1时， 可完 全吸附。 5.根据权利要求1所述的一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导 入植物细胞的方法， 其特征在于， 所述步骤5具体按照以下步骤进行： 将LDH-lactate-NS的浓度控制在100ug/ml以下作为工作浓度， 以DNA： LDH-lactate-NS 质量比1:3以上， 以FITC： LDH-lactate-NS质量比1:5以上， 孵育时间为1h， 即将生物活性分 子导入植物细胞中。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441484 A 2 乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植 物细胞的方法 技术领域 0001 本发明属于生物活性。
8、分子技术领域， 涉及一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片 负载生物活性分子导入植物细胞的方法。 背景技术 0002 生物活性分子导入技术在将酸性生物活性分子导入植物细胞这一方面， 仍受到高 效性、 经济性和操作简易性等方面的限制， 仍是对更广泛的植物物种进行活体细胞实时检 测技术的瓶颈之一。 相关研究曾报道， 研究人员利用多孔硅纳米颗粒等材料将DNA分子导入 植物原生质体中。 然而， 制备原生质体时， 不仅操作繁琐、 得率较低， 得到的原生质体非常脆 弱， 极易破裂。 因此， 研究者们一直在探索一种能够将生物活性分子直接导入完整活体植物 细胞的理想载体。 0003 作为一种新型的生物活性分子载体。
9、， 无机纳米材料正以其操作简单， 适用广泛等 优势受到研究者们的重视。 其中， 类水滑石纳米片(layereddoublehydroxide， LDH)相对 于其他纳米材料而言， 具有合成方法简单， 原材料容易获得的优势。 特别是还能通过对其片 层结构表面进行功能基团的特异性修饰， 进一步开发其应用潜力。 0004 因此， 本研究首次借助无机纳米材料乳酸根插层的类水滑石开发了一种将生物活 性分子导入完整活体植物细胞的技术， 这不仅能为基础生物学研究提供有力的工具， 也将 在多种作物和林业经济树种的基因改造和遗传育种方面具有重大意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种乳酸根插层的类水滑。
10、石超薄纳米片负载生物活性分子 导入植物细胞的方法， 解决了现有技术难以将生物活性分子导入完整活体植物细胞中的问 题。 0006 本发明所采用的技术方案是， 一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活 性分子导入植物细胞的方法， 按照以下步骤进行： 0007 步骤1， 合成乳酸根插层的类水滑石纳米材料MgAl-lactateLDH， 在水中剥离获得 二维纳米片LDH-lactate-NS； 0008 步骤2， 对LDH-lactate-NS进行XRD等表征分析鉴定； 0009 步骤3， 用含有不同浓度LDH-lactate-NS的缓冲液处理BY-2细胞和拟南芥， 获得其 负载生物活性分子导入植。
11、物细胞的安全浓度； 0010 步骤4， 将生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的质量比进行偶联； 0011 步骤5， 将二维纳米片-生物活性分子复合物与植物细胞共孵育， 把生物活性分子 导入植物细胞中。 0012 进一步的， 所述步骤1具体按照以下步骤进行： 将镁/铝摩尔比为0.5:1-6:1的镁铝 乳酸盐于125mL双蒸水中在30-100条件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中； 另将大于等 说明书 1/4 页 3 CN 105441484 A 3 于铝的摩尔量的L-乳酸溶于25mL双蒸水中， 配制成溶液B置于三颈圆底烧瓶中； 在室温下快 速搅拌将溶液A逐滴滴入溶液B中， 滴定过程中。
12、用氢氧化钠溶液控制其pH体系， 维持pH值为 8-12； 待滴定完毕后， 继续剧烈搅拌并陈化5-48h， 得到乳白色混合物， 用双蒸水通过离心方 法反复洗涤直至上清液变浑浊； 将离心后的样品分为两份， 一份置于真空干燥箱里室温干 燥， 干燥后研磨， 所得粉末为MgAl-lactateLDH； 另一份置于一定量的双蒸水中， 剧烈搅拌 直至没有沉淀变为透明状得到悬浊液C， 悬浊液C的浓度由干燥后MgAl-lactateLDH质量和 双蒸水的含量计算得出， 记为LDH-lactate-NS， 全过程在N2保护下进行。 0013 进一步的， 所述步骤2具体按照以下步骤进行： 将剥离的LDH-lacta。
13、te-NS滴在铜网 上进行TEM(透射电子显微镜)成像， 并烘干LDH-lactate-NS进行SEM(扫描电子显微镜)成 像， 采用凝胶法将LDH-lactate-NS置于托盘获得XRD特征谱， 并用激光照射LDH-lactate-NS 胶体检测丁达尔现象。 0014 进一步的， 所述步骤4中， LDH-lactate-NS： 带负电荷的生物活性分子DNA(脱氧核 糖核酸)质量比为3:1时， LDH-lactate-NS： 带负电荷的生物活性分子FITC(异硫氰酸荧光 素)质量比为5:1时， 可完全吸附。 0015 进一步的， 所述步骤5具体按照以下步骤进行： 将LDH-lactate-NS。
14、的浓度控制在 100ug/ml以下作为工作浓度， 以DNA： LDH-lactate-NS质量比1:3以上， 以FITC： LDH- lactate-NS质量比1:5以上， 孵育时间为1h， 即将生物活性分子导入植物细胞中。 0016 本发明的有益效果是： 首次使用水中剥离的二维纳米片(LDH-lactate-NS)通过偶 联生物活性分子获得纳米片-生物活性分子复合物， 以最优吸附比和孵育时间与植物细胞 共孵育将生物活性分子导入完整的活体植物细胞中。 (1)在水中剥离获得了LDH-lactate- NS二维纳米片， 保证了溶剂对细胞无毒， 克服了现有的生物活性分子载体只能溶于DMSO/甲 醇等。
15、有毒溶剂中； (2)通过试验探索， 利用LDH-lactate-NS二维纳米片吸附生物活性分子的 特性， 弥补了现有的生物活性分子载体吸附生物活性分子时间较长的缺点， 大大缩短了试 验时间， 为活体实时检测提供了更加便利和快捷的方法； (3)通过优化对生物活性分子的负 载和导入生物活性分子至活体细胞的条件， 可以借助LDH-lactate-NS二维纳米片高效吸附 生物活性分子并有效导入完整活体植物细胞中， 超越了现有生物活性分子载体的功能极 限。 附图说明 0017 图1是LDH-lactate-NS表征： 其中， A为LDH-lactate-NS的XRD表征； B为LDH- lactate-。
16、NS的FE-SEM表征； C为LDH-lactate-NS的丁达尔现象； D为LDH-lactate-NS的HR- TEM表征。 0018 图2是PI染色不同浓度LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞： 其中， A-C为PI染色25 g/ mlLDH-lactate-NS处理的BY-2细胞； D-F为PI染色50 g/mlLDH-lactate-NS处理的BY-2细 胞； G-I为PI染色100 g/mlLDH-lactate-NS处理的BY-2细胞； J-L为PI染色300 g/mlLDH- lactate-NS处理的BY-2细胞。 标尺长度为100 m。 0019 图3是含不同浓度。
17、LDH-lactate-NS培养基上的幼苗根长、 胚轴长度： 其中， A为拟南 芥幼苗的根长； B为拟南芥幼苗的胚轴长度。 *表示P 0.01， *表示P 0.001。 0020 图4是LDH-lactate-NS对DNA分子的吸附能力。 说明书 2/4 页 4 CN 105441484 A 4 0021 图5是Zeta-potential数据。 0022 图6是LDH-lactate-NS负载FITC导入BY-2细胞： A为明场； B为荧光图； C为高倍镜下 的DIC图； D为高倍镜下的荧光图； E为C和D的叠加图。 标尺长度分别为100 m(A和B)和20 m (C、 D和E)。 0023。
18、 图7是LDH-lactate-NS负载ssDNA-FITC导入BY-2细胞： A为背景荧光图； B为LDH- lactate-NS负载ssDNA-FITC导入BY-2细胞后的荧光图； C为对A图荧光场的三维成像； D为对 B图荧光场的三维成像； E为A和B图荧光场的灰度值； F为对应B图细胞的明场。 标尺长度为30 m。 0024 图8是LDH-lactate-NS负载FITC导入拟南芥细胞， 标尺长度为30 m。 0025 图9是LDH-lactate-NS负载ssDNA-FITC导入拟南芥细胞， 标尺长度为30 m。 具体实施方式 0026 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
19、。 0027 本发明一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞 的方法， 按照以下步骤进行： 0028 步骤1， 合成乳酸根插层的类水滑石(MgAl-lactateLDH)纳米材料， 在水中剥离获 得二维纳米片(LDH-lactate-NS)： 0029 将镁/铝摩尔比为0.5:1-6:1的镁铝乳酸盐于125mL双蒸水中在30-100条件下溶 解配制成溶液A置于分液漏斗中； 另将大于等于铝的摩尔量的L-乳酸溶于25mL双蒸水中， 配 制成溶液B置于三口圆底烧瓶中； 在室温下快速搅拌将溶液A逐滴滴入溶液B中， 滴定过程中 用氢氧化钠溶液控制其pH体系， 维持pH值为8-12；。
20、 待滴定完毕后， 继续剧烈搅拌并陈化5- 48h， 得到乳白色混合物， 用双蒸水通过离心方法反复洗涤直至上清液变浑浊； 将离心后的 样品分为两份， 一份置于真空干燥箱里室温干燥， 干燥后研磨， 所得粉末为MgAl-lactate LDH； 另一份置于一定量的双蒸水中， 剧烈搅拌直至没有沉淀变为透明状得到悬浊液C， 悬浊 液C的浓度由干燥后MgAl-lactateLDH质量和双蒸水的含量计算得出， 记为LDH-lactate- NS， 全过程在N2保护下进行。 0030 步骤2： 对LDH-lactate-NS进行XRD等表征分析鉴定： 将剥离的LDH-lactate-NS滴 在铜网上进行TEM。
21、成像， 并烘干LDH-lactate-NS进行SEM成像。 采用凝胶法将LDH-lactate- NS置于托盘获得XRD特征谱， 并用激光照射LDH-lactate-NS胶体检测丁达尔现象。 0031 如图1所示， XRD结果表明获得了正确特征的材料(图1A)。 将合成获得的材料进行 FE-SEM成像， 结果表明， 剥离之前为多层垛叠结构(图1B)。 通过水中剥离， 产生了丁达尔现 象， 说明片层大小介于1nm100nm之间(图1C)。 HR-TEM成像表明， 在水中剥离后获得了二维 结构的LDH-lactate-NS(图1D)。 本研究中以水中剥离的二维纳米片LDH-lactate-NS为载。
22、体 负载生物活性分子。 0032 步骤3， 用含有不同浓度LDH-lactate-NS的培养基处理BY-2细胞和拟南芥， 探索 LDH在植物细胞中的毒理作用， 建立LDH-lactate-NS对植物细胞的毒理机制模型， 为后续的 负载试验提供参考： 0033 如图2所示。 Propidiumiodide(PI)染料是一种与DNA结合发出红色荧光的染料。 然而， PI染料无法透过活细胞完整的细胞膜。 利用这一特性， 用不同浓度的LDH-lactate-NS 说明书 3/4 页 5 CN 105441484 A 5 (浓度分别为25/50/100/300ug/ml)处理BY-2细胞并进行PI染色。。
23、 结果显示， 当LDH- lactate-NS的浓度为100ug/ml时， 检测到微弱的胞内荧光。 然而， LDH-lactate-NS的浓度高 达300ug/ml时， 检测到极强的胞内荧光。 说明LDH-lactate-NS浓度在100ug/ml以下为负载 生物活性分子的安全浓度。 0034 如图3所示。 配制含有不同浓度LDH-lactate-NS的培养基(浓度分别为25/50/100/ 300ug/ml)， 将拟南芥种子播种在该培养基上。 种子萌发之后， 统计幼苗(6天)的根长和胚轴 长度。 结果表明， LDH-lactate-NS的浓度在100ug/ml以下时， 无明显的抑制作用。 而。
24、在 300ug/ml时， 其抑制效果为极显著。 说明LDH-lactate-NS浓度在100ug/ml以下为负载生物 活性分子的安全浓度。 0035 步骤4， 将生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的质量比进行偶联， 获得最佳的 吸附比： 0036 将DNA和LDH-lactate-NS按不同质量比(1:1、 1:2、 1:3、 1:4和1:5)共孵育获得LDH- DNA偶联物。 如图4所示， 以单独DNA作为阳性对照， 以没有DNA的电泳孔为阴性对照， 对其进 行灰度分析， 其结果证明LDH-DNA质量比为3:1时， 即可完全吸附。 0037 如图5 Zeta-potential。
25、数据表明， FITC是带负电荷的生物活性分子， LDH-Lactate 是带正电荷的生物活性分子。 将FITC和LDH-lactate-NS按不同质量比(1:1、 1:2、 1:3、 1:4和 1:5)共孵育5min获得LDH-FITC偶联物。 结果显示LDH-lactate-NS： FITC质量比为5:1时， 电 荷为0， 表明其质量比为5:1时即可完全吸附。 0038 步骤5， 通过纳米片-生物活性分子复合物与植物细胞共孵育的方法， 利用二维纳 米片载体将生物活性分子导入植物细胞中： 0039 根据毒性试验结果， 将LDH-lactate-NS的浓度控制在100ug/ml以下作为工作浓 度。
26、。 同时， 根据吸附试验结果， 以DNA： LDH-lactate-NS质量比1:3以上， 以FITC： LDH- lactate-NS质量比1:5以上作为工作吸附比进行负载试验。 0040 最优情况是： 使用的FITC： LDH-lactate-NS质量比为1:6， DNA： LDH-lactate-NS质 量比为1:5， 终浓度为10ug/ml， 孵育时间为1h。 通过共聚焦荧光显微镜， 从细胞质中检测到 了明显的荧光。 0041 如图6和图7所示， 在以上的方法和试验条件下， 将LDH-Lactate-NS-FITC复合物与 BY-2悬浮细胞和拟南芥共孵育后， 利用confocal检测到。
27、了强烈的胞内荧光， 说明该纳米片 高效负载FITC染料导入了BY-2细胞和拟南芥细胞中。 不仅如此， LDH-Lactate-NS还能负载 ssDNA-FITC导入BY-2细胞(如图8)和拟南芥细胞(如图9)中， 进一步有力地证明了我们探索 获得的方法可以高效利用LDH-Lactate-NS将生物功能分子有效导入完整的活体植物细胞 中。 说明书 4/4 页 6 CN 105441484 A 6 图1 图2 说明书附图 1/4 页 7 CN 105441484 A 7 图3 图4 图5 说明书附图 2/4 页 8 CN 105441484 A 8 图6 图7 说明书附图 3/4 页 9 CN 105441484 A 9 图8 图9 说明书附图 4/4 页 10 CN 105441484 A 10 。