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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510893562.8 (22)申请日 2015.12.07 CGMCC No.11626 2015.11.06 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/04(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 河北省微生物研究所 地址 071051 河北省保定市竞秀区五四中路 2089 号 申请人 中国科学院微生物研究所 (72)发明人 高庆华 胡美荣 吴芳彤 陶勇 秦艳梅 马清河。
2、 王云鹏 (74)专利代理机构 石家庄海天知识产权代理有 限公司 13101 代理人 田文其 (54) 发明名称 葡萄糖氧化酶基因 GOD、 利用其编码的蛋白、 转化的巴斯德毕赤酵母及其制备 (57) 摘要 本 发 明 属 于 新 基 因 的 制 备， 特 别 是 指 一种葡萄糖氧化酶基因 GOD、 利用其编码的 蛋 白 以 及 转 化 的 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 Pichia pastoris。葡萄糖氧化酶基因 GOD 是以 5端 ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA 和 3端 CTAGGCAC TTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物， 以点青霉DNA为 模板， 采用。
3、PCR扩增方法获得。 本发明解决了目前 重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达的问题， 利 用本发明获得了全长的 GOD 基因及其构建的穿梭 表达载体， 进一步转化到巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris， 经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高 分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。本发明为进一步 的工厂化生产大大节约了成本费用， 提高了葡萄 糖氧化酶的经济效益。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图5页 CN 105420252 A 2016.03.23 CN 105420252 A 1/1。
4、 页 2 1.葡萄糖氧化酶基因 GOD， 其特征在于其基因序列为 SEQ ID No.1。 2.萄 萄 糖 氧 化 酶 基 因 GOD 的 制 备 方 法， 其 特 征 在 于 是 以 5 端 ATGAAGTCC ACTATTATCACCTCCA 和 3端 CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA 为特异引物， 以点青霉 DNA 为模 板， 采用 PCR 扩增方法获得。 3.利用萄萄糖氧化酶基因 GOD 编码的蛋白， 其特征在于其序列为 SEQ ID No.2。 4.利用葡萄糖氧化酶基因 GOD 转化的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris， 其特征在于 其保藏编号为 CGM。
5、CC No.11626。 5.根据权利要求 4 所述的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 的制备方法， 其特征在于 其制备方法中的步骤如下 ： A、 通过 PCR 方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去 除， 引物序列如下 ： GodF:5GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCC GGCCGAGCAGATCGAC3， 序 列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶 Eco RI 识别位点 ； GodR:5 GAGATGAGTTTTT GTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCAT AGTCTTC3， 序列中下划线部分为下。
6、游添加限制性 内切酶 NotI 识别位点 ； B、 PCR 产物经纯化回收采 GIBSON 连接到表达载体 pMD-AOX 的 EcoRI 和 NotI 位点上， 转化到 E.coli DH5， 酶切验证筛选阳性克隆， 并送测序 ； C、 测序正确重组质粒pMD-AOX-GOD经PmeI酶切后线性化， 用2g线性化pMD-AOX-GOD 质粒电击转化 80L 毕赤酵母 Pichia pastoris X33 感受态细胞， 然后将转化细胞涂于 含 100g/ml G418 的 YPD 平板上， 30培养 96h ； 获得巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris CGMCC No.11626。
7、。 权 利 要 求 书 CN 105420252 A 2 1/5 页 3 葡萄糖氧化酶基因 GOD、 利用其编码的蛋白、 转化的巴斯德 毕赤酵母及其制备 技术领域 0001 本发明属于新基因的制备， 特别是指一种葡萄糖氧化酶基因 GOD、 利用其编码的蛋 白以及转化的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris。 背景技术 0002 葡萄糖氧化酶 (EC1.1.3.4) 是一种能够专一的催化 -D- 葡萄糖氧化为 -D- 葡 萄糖酸， 并且利用分子氧作为受体产生过氧化氢的需氧脱氢酶。葡萄糖氧化酶是国家允许 使用的酶制剂之一， 对人体无毒、 无副用作， 具有去除葡萄糖、 脱氢、 杀菌等功效， 。
8、已被广泛 应用于食品、 纺织、 化工、 饲料、 医药等行业中。 0003 葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体内， 目前用于研究及生产葡萄糖氧化 酶的主要菌株为黑曲霉(Abperrillus niger)和点青霉(Penicillium notatum)， 这是因为 霉菌产酶能力强， 易于规模化生成 ； 但黑曲霉和青霉菌发酵生产 GOD 过程中， 过氧化氢酶、 纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当的困难。 近几年市场对葡萄糖氧化酶 的需求量逐年增长。但我国葡萄糖氧化酶技术水平尚处于研究发展的初级阶段， 存在产量 低、 酶活低、 提纯繁琐、 酶活检测方法操作复杂等问题， 使国内葡萄糖。
9、氧化酶仍以进口为主。 并且传统以优化发酵条件提高葡萄糖氧化产量和酶活的方法， 存在着精确度低、 实验次数 多、 周期长、 不能快速有效地提高葡萄糖氧化酶的产量和酶活的技术缺陷。 0004 重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达可有效地解决这些问题， 尤其是毕赤酵母表 达外源蛋白具有表达量高、 稳定性好、 培养成本低和产物易分离纯化等优点， 适于大体积高 密度连续发酵， 具有强且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase， AOX)启动子等优点， 可严格控 制外源基因的表达。 0005 通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株， 获得萄糖氧化酶准确高效的生产 和提取方法， 提高产酶量， 为后期的工。
10、业化生产提供了导向基础， 提高其经济效益。 发明内容 0006 本发明的目的之一在于提供一种葡萄糖氧化酶基因 GOD。 0007 本发明的目的之二在于提供一种葡萄糖氧化酶基因 GOD 的制备方法。 0008 本发明的目的之三在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因 GOD 编码的蛋白。 0009 本发明的目的之四在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因 GOD 转化巴斯德毕赤酵 母 Pichia pastoris 的方法。 0010 本发明的整体技术构思是 ： 0011 葡萄糖氧化酶基因 GOD， 其基因序列为 SEQ ID No.1。 0012 葡萄糖氧化酶基因 GOD 的制备方法， 是以 5端 ATGAA。
11、GTCCACTATTATCACCTCCA 和 3端 CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA 为特异引物， 以点青霉 DNA 为模板， 采用 PCR 扩增方法 获得。 说 明 书 CN 105420252 A 3 2/5 页 4 0013 利用萄萄糖氧化酶基因 GOD 编码的蛋白， 其序列为 SEQ ID No.2。 0014 利用葡萄糖氧化酶基因 GOD 转化的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris， 其保藏编 号为 CGMCC No.11626。 0015 本发明中的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 申请人已于 2015 年 11 月 6 日提交 中国微生物。
12、菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.11626， 该保 藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 该保藏机 构的简称为 CGMCC。 0016 利用葡萄糖氧化酶基因 GOD 转化的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 的制备方 法， 其制备方法中的步骤如下 ： 0017 A、 通过 PCR 方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码 序列去除， 引物序列如下 ： GodF:5 GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG AC3， 序列中下划线部分为上游引。
13、物添加限制性内切酶 EcoRI 识别位点 ； GodR:5 GAGATG AGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3， 序列中下划线部分为下游添加 限制性内切酶 NotI 识别位点 ； 0018 B、 PCR 产物经纯化回收采 GIBSON 连接到表达载体 pMD-AOX 的 EcoRI 和 NotI 位点 上， 转化到 E.col i DH5， 酶切验证筛选阳性克隆， 并送测序 ； 0019 C、 测序正确重组质粒 pMD-AOX-GOD 经 PmeI 酶切后线性化。用 2g 线性化 pMD-AOX-GOD 质粒电击转化 80l 毕赤酵母。
14、 Pichia pastoris X33 感受 态细胞， 然后将 转化细胞涂于含 100g/ml G418 的 YPD 平板上， 30培养 96h ； 随机挑选阳性菌落转接含 100g/mLG418 的液体 YPCS 培养基， 在温度 30、 转速 200r/min 条件下振荡培养 3d， 期间 每隔 24h 加 1的甲醇 , 测定发酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性。 0020 本发明的具体技术内容还有 ： 0021 所述的葡萄糖氧化酶基因 GOD 的制备方法中是利用所设计的特异性引物， 以点 青霉 DNA 为模板， 在扩增仪上按照 98预变性 5 分钟 ； 30 个 PCR 循环 ： 98变性 。
15、30 秒， 65退火 30 秒， 72延伸 1 分钟 ； 72延伸 10 分钟的程序进行 PCR 扩增 ； PCR 反应均按 如下成份及用量进行 : 反应体系为 50l: 基因组 DNA 100ng， 引物各 0.2mol/L， dNTPs 250mol/L,5Q5High-Fidel ity DNA Polymerase Buffer 10l,Q5High-Fidel ity DNA Polymerase 0.5l。PCR 产物跑 1的琼脂糖电泳观察结果 ； PCR 产物通过 T4DNA 连 接酶连接到质粒pMD18-T载体上， 并转化大肠杆菌DH5， 然后涂布到具有氨苄青霉素的LB 平板上。
16、， 37过夜培养直至菌落长出， 随机挑取 2 个克隆进行测序， 序列分析获得 GOD 基因 序列。 0022 本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于 ： 0023 1、 本发明通过PCR技术获得了一个全长的GOD基因序列， 该基因全长为1815bp， GC 含量为 55.4。同源分析该基因与以往的报道的 GOD 的基因序列具有一定的差异， 证明该 基因是一个新的 GOD 基因。 0024 2、 本发明中所制备的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris CGMCC No.11626 突破了 传统黑曲霉和青霉菌发酵生产 GOD 过程中， 夹杂大量过氧化氢酶、 纤维素酶及淀粉酶等杂 酶，。
17、 难纯化的问题。利用本发明所获得的转基因毕赤酵母工程菌， 在 10L 发酵罐水平检测条 件下， 甲醇诱导 144 小时， 发酵液中的酶活达到 594U/ml， 显著提高了发酵酶活 ； 并且通过基 说 明 书 CN 105420252 A 4 3/5 页 5 因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株， 还可以获得萄糖氧化酶准确高效的生产， 提高产 酶量 (9g/L)， 为后期的工业化生产提供了导向基础， 提高经济效益。 0025 本发明中的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris申请人已提交中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.11626， 该保藏机构的。
18、地址位于北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研 究所， 该保藏机构的简称为 CGMCC。 附图说明 0026 本发明的附图有 ： 0027 图 1是本发明中葡萄糖氧化酶基因 GOD 及利用其编码的蛋白的序列表。 0028 图 2点青霉 GOD 基因全长结果。 0029 以点青霉基因组DNA为模板， 引物P1和P2进行PCR扩增， 扩增出现一条约1800bp 的特异带， 。 序列分析结果表明， 其基因组DNA长1815bp， GC含量为55.4， 含有全长的GOD 基因片段。 M为DNA Marker， 分子量从大到小依次为10000， 8000， 6000， 5000， 4。
19、000， 3000bp， 2000bp， 1000bp ； 1 和 2 为 GOD 基因扩增产物。 0030 图 3是表达质粒 pMD-AOX-GOD 双酶切检测结果。 0031 将经引物 GodF 和 GodF 进行 PCR 扩增并纯化回收的点青霉 GOD 基因和经过 EcoRI 和 NotI 双酶切的载体 pMD-AOX 进行 Gibson 连接以构建重组质粒。用重组质粒转化感受态 大肠杆菌 DH5， 并在含 Amp 的 LB 平板上筛选阳性菌落。阳性菌落质粒经 EcoRI 和 NotI 双酶切后， 得到约 6.5.0kb 和 1.8kb 的两个 DNA 片段， 亦与预期大小相符。图中 M。
20、 为 DNA Marker， 分子量从大到小依次为 10000， 8000， 6000， 5000， 4000， 3000bp， 2000bp， 1000bp， 1-6 是表达质粒 pMD-AOX-GOD 双酶切产物。 0032 图 4是葡萄糖氧化酶在 YPCS 的表达的 SDS-PAGE 检测结果。 0033 将重组的表达质粒 pMD-AOX-GOD 经 PmeI 酶切后线性化后， 电转化毕赤酵母 X33 感 受态， 在 YPD 平板生长 3d 后， 随机挑选阳性菌落转接液体 YPCS， 经甲醇诱导 72h 后， 测定发 酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性， 从32个转化子中挑选出6株有葡萄糖氧化。
21、酶活性的转化 子， 表达率为 16.7。同时发酵液上清液做蛋白质 SDS-PAGE 电泳， 可见一条浓染的约 90kD 的蛋白条带。图中 M 为是蛋白 Marker， 1-8 筛选的不同毕赤酵母菌株， 其中 5 号菌株酶活最 高， 24U/ml。 0034 图 5是葡萄糖氧化酶在 10L 发酵罐的表达 SDS-PAGE 检测结果。 0035 在 10L 发酵罐中， 在甲醇未诱导之前， 处于菌株培养和碳源饲喂阶段， 在这两个阶 段内， 菌体大量增长， 此时无葡萄糖氧化酶蛋白的表达。随着甲 醇的诱导， 发酵液中的葡 萄糖氧化酶活性逐渐增加， 诱导 144h 后发酵液中葡萄糖氧化酶活性为 496U/。
22、ml， 蛋白质表 达量达到 9.4g， SDS-PAGE 同时表明发酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表达量也在不断积累。图 中 M 为是蛋白 Marker， 1-12 为经甲醇诱导 0h， 24h， 36h， 48h， 60h， 72h， 84h， 96h， 108h， 120h， 132h， 144h 葡萄糖氧化酶表达量。 具体实施方式 0036 以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述， 但不作为对本发明的限定， 本发 明的保护范围以权利要求记载的内容为准， 任何依据说明书作出的等效技术手段替换， 均 说 明 书 CN 105420252 A 5 4/5 页 6 不脱离本发明的保护范畴。 0037 。
23、实施例 1 0038 巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 的构建 0039 本实施例中的葡萄糖氧化酶基因 GOD 序列以及编码的蛋白序列如图 1所示， 其具 体制备及葡萄糖氧化酶基因 GOD 功能鉴定包括 ： 0040 A、 葡萄糖氧化酶基因 GOD 的全序列扩增和克隆 ； 0041 B、 葡萄糖氧化酶基因 GOD 转化毕赤酵母。 0042 步 骤 A 葡 萄 糖 氧 化 酶 基 因 GOD 的 制 备，其 制 备 方 法 是 以 5 端 ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA 和 3端 CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA 为特异引物， 以点 青霉 DN。
24、A 为模板， 在扩增仪上按照 98预变性 5 分钟 ； 30 个 PCR 循环 ： 98变性 30 秒， 65退火 30 秒， 72延伸 1 分钟 ； 72延伸 10 分钟的程序进行 PCR 扩增 ； PCR 反应均按 如下成份及用量进行 : 反应体系为 50L: 基因组 DNA100ng， 引物各 0.2mol/L， dNTPs 250mol/L,5Q5High-Fidel ity DNA Polymerase Buffer 10L,Q5High-Fidel ity DNA Polymerase 0.5L。PCR 产物跑 1的琼脂糖电泳观察结果 ； PCR 产物通过 T4DNA 连 接酶连接。
25、到质粒pMD18-T载体上， 并转化大肠杆菌DH5， 然后涂布到具有氨苄青霉素的LB 平板上， 37过夜培养直至菌落长出， 随机挑取 2 个克隆进行测序， 序列分析获得葡萄糖氧 化酶基因 GOD 序列。 0043 步骤 B 的步骤如下 ： 0044 A、 通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列 去除， 引物序列如下 ： GodF:5GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCC GGCCGAGCAGATCGAC3， 序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶 Eco RI 识别位点 ； GodR:5 GAGATGAGTT TTTGTTCTAGAGC。
26、GGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3， 序列中下划线部分为下游添加限制 性内切酶 NotI 识别位点 ； 0045 B、 PCR 产物经纯化回收采 GIBSON 连接到表达载体 pMD-AOX 的 EcoRI 和 NotI 位点 上， 转化到 E.coli DH5， 酶切验证筛选阳性克隆， 并送测序 ； 0046 C、 测序正确重组质粒 pMD-AOX-GOD 经 PmeI 酶切后线性化。用 2g 线性化 pMD-AOX-GOD 质粒电击转化 80L 毕赤酵母 Pichia pastoris X33 感受态细胞， 然后将转 化细胞涂于含 100g/ml G418 的 。
27、YPD 平板上， 30培养 96h ； 获得巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris。 0047 实施例 2 0048 巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 在试管中酶活的验证 0049 以实施例 1 获得的巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 为生产菌， 活化后在温度为 30、 转速为 200rpm 条件下培养到 OD600 在 1.2 左右的种子培养液以 2的接种量转入 YPCS 培养基 , 于温度为 30、 转速为 200rpm 条件下培养 ； 在 YPCS 培养基中培养至 OD600 值为 1.2 左右时 , 将酵母细胞转入 YPCS 诱导培养基， 每天添加 。
28、1甲醇诱导表达 3 天。 0050 培养基 ： 种子和斜面培养基为 YPD 培养基 ： 胰蛋白胨 2， 酵母提取物 1， 葡萄糖 2； 斜面培养基添加琼脂 2。含 100g/mL G418 的 YPCS 培养基含有如下质量百分含量 的原料 ： 胰蛋白胨 2， 酵母提取物 1， 酪蛋白水解物 2， 山梨醇 0.5。 0051 通过蛋白电泳 (SDS-PAGE) 得到一条如图 4所示的分子量大小约为 90kDa 的蛋白 说 明 书 CN 105420252 A 6 5/5 页 7 条带， 同时在摇瓶中以 1甲醇浓度诱导产葡萄糖氧化酶的能力， 最高酶活为 25U/mL， 比野 生菌的酶活 (14U/。
29、mL) 提高了近 0.8 倍。 0052 实施例 3 0053 巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 在 10L 发酵罐上酶活的验证 0054 将活化好的重组菌株接种于 YPD 培养基中， 在温度为 30、 转速为 200-250rpm 培 养到 OD600 2 时以 3的接种量接种于 BMGY 培养基中， 在温度为 30、 转速为 250rpm 培 养至 OD600 达到 10 左右。将培养好的 BMGY 发酵液以 10的接种量接入 10L 全自动发酵 罐。初始装液量 6L， 并加入 4 PTM1， 每隔 24h 无菌操作添加无菌 VC 6mL， 诱导 48h 后无 菌操作添加无菌。
30、 VB212ml。 0055 菌体培养阶段 ： 30通气搅拌培养 18-24h， 培养基中的甘油逐渐消耗， 当甘油消 耗殆尽后菌体不再生长， 此时 DO 会突然上升， 稳定不变。培养过程中用氨水维持 pH 值 5.0 左右 , 此时菌体 OD600 约为 90 左右。 0056 碳源饲喂阶段 ： 菌体培养阶段甘油耗尽后， 连续流加 50甘油， 每升甘油中含 12mLPTM1, 流加速度为 12mL/h/L,30培养 4h, 溶氧维持在 0， pH 用氨水维持在 5.0 左右。 此步结束时 OD600 约为 150-170 之间。 0057 饥饿培养阶段 ： 在诱导培养前， 停止补料0.5-1h。
31、， 确认甘油完全耗尽。 pH用氨水维 持在 5.0。当甘油消耗完后菌体不再生长， 此时 DO 会突然上升， 稳定不变。此时菌体 OD600 约为 180。 0058 诱导表达阶段 ： 流加入诱导剂甲醇， 每升甲醇中含 12mlPTM1, 流加速度为 3.0ml-5.0ml/h/L, 在 10 小时后提高流加速度。山梨醇作为碳源流加， 流加量是甲醇的 1/20， 速度为 0.3ml-0.5ml/h/L， 在 10 个小时后提高流加速度， 此时溶氧维持在 0 的水平， 在温度为 30条件下培养。诱导时间达到 120-144h。在诱导阶段， 当提高培养基 pH 至 6.0-6.5， 葡萄糖氧化酶的表。
32、达量可进一步提高， 但是杂菌污染的概率会大大增加。 0059 诱导表达阶段结束后， 巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 在 10L 发酵罐上的酶活 可达到 594U/ml。 0060 培养基和试剂 0061 BMGY 培养基 ： 酵母提取物 1， 蛋白胨 2， 磷酸钾 pH 6.0100mM， YNB1.34， 生 物素 410-5， 甘油 1或甲醇 0.5； 微量元素包括 ： 硫酸铜 6.0g/L， 碘化钠 0.08g/L， 硫 酸锰 3.0g/L， 钼酸钠 0.2g/L， 硼酸 0.02g/L， 氯化钴 0.5g/L， 氯化锌 20g/L， 硫酸亚铁 65g/L， 酸 5.0m。
33、L/L， 生物素 0.2g/L， VC 80mg/L， VB2 ： 0.5M， 余量为水。 说 明 书 CN 105420252 A 7 1/3 页 8 序列表 序 列 表 CN 105420252 A 8 2/3 页 9 序 列 表 CN 105420252 A 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 105420252 A 10 1/5 页 11 说 明 书 附 图 CN 105420252 A 11 2/5 页 12 说 明 书 附 图 CN 105420252 A 12 3/5 页 13 说 明 书 附 图 CN 105420252 A 13 4/5 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 105420252 A 14 5/5 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 105420252 A 15 。