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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510832550.4 (22)申请日 2015.11.26 C12N 9/50(2006.01) A61K 38/48(2006.01) (71)申请人 青岛康原药业有限公司 地址 266300 山东省青岛市胶州市营海第三 工业园 (72)发明人 刘乃山 林晓磊 刘翠珍 (54) 发明名称 一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法及提高 激肽释放酶稳定性的药物组合物 (57) 摘要 本发明公开一种疏水色谱纯化激肽释放酶的 方法及提高激肽释放酶稳定性的药物组合物， 该 方法通过以下工艺步骤 ：（1） 离子交换层析 ;（2） 盐析 ；（3） 。
2、超滤 ；（4） 热原处理 ；（5） 透析 ；（6） 疏 水色谱 ；（7） 冻干， 制备激肽释放酶。本发明对激 肽释放酶的生产工艺进行不断改进， 特别是对各 工艺参数进行反复的实验研究， 不断优化， 最终 确立了一套更为科学的规模化生产工艺， 经疏水 色谱纯化所得的激肽释放酶的效价高达 1500 1800iu/mg, 并且各项指标均符合中国药典规定。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105400757 A 2016.03.16 CN 105400757 A 1/1 页 2 1.一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法及。
3、提高激肽释放酶稳定性的药物组合物， 该方 法通过疏水色谱等现代生物分离技术， 提高了纯化激肽释放酶的效率， 保持激肽释放酶的 效价稳定。 2.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 以激肽释放酶原为原料， 依次经过离子交换 层析、 盐析、 超滤、 热原处理、 透析、 疏水色谱、 冻干等工序纯化得到激肽释放酶。 3.如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于所述纯化工艺包括如下步骤 ： 1） 将激肽释放酶原用醋酸缓冲液溶解， 离心， 上清液加入离子交换树脂， 搅拌、 吸附、 漂 洗、 洗脱 ； 2） 调节 pH 值后加入固体硫酸铵进行盐析， 静置过夜， 过滤， 收集滤饼 ； 3） 加。
4、入磷酸盐缓冲液搅拌调节 pH 值， 超滤 ； 4） 超滤液加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液后， 调节 pH 搅拌， 离心， 弃沉淀物 ； 5） 取上述滤液置于于透析袋中， 透析 4 6 天 ； 6） 疏水色谱， 用 2 种洗脱液进行洗脱， 最终收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液， -20 保存 ； 7） 调节 pH 值， 装盘、 冻干， 得激肽释放酶。 4.如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于离子交换树脂选 AmheriteCG-50, 并且 m( 树 脂 ) ： m（粗制品） =50 ： 1。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于离子交换层析选用洗脱液为0.01-0.3mol/L， PH3-8。
5、 的 NaCL 溶液。 6.如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于盐析工序中每升提取液中加入 500g 硫酸铵。 7.如 权 利 要 求 3 所 述 的 方 法， 其 特 征 在 于 ： 所 述 疏 水 色 谱 快 胶 柱 包 括 ： Butyl-Sepharose 2B FF,Butyl-Sepharose 4B FF,Butyl-Sepharose 6B FF， Butyl-Sepharose CL-2B FF,Butyl-Sepharose CL-4B FF,Butyl-Sepharose CL-6B FF。 8.如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述疏水色谱条件为 ： 平。
6、衡液选用含 0.5-3mol/L (NH4)2SO4的 0.01-0.3mol/L， PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液 , 流速控制在 15mL/ min 左右， 洗脱液选用 0.5-3mol/L 的 (NH4)2SO4溶液和不含 (NH 4)2SO4平衡缓冲液。 9.如权利要求 1 7 所述的方法， 其特征在于 ： 疏水色谱纯化所得激肽释放酶效价高 达 1500 1800iu/mg。 10.一种药物组合物， 其含有根据权利要求1-9制备的激肽释放酶原作为活性成分,还 含有预胶化淀粉、 微晶纤维素、 柠檬酸三钠、 羟丙基甲基纤维素、 硬脂酸镁及肠溶型薄膜包 衣预混剂 ( 兰色 )。 权。
7、 利 要 求 书 CN 105400757 A 2 1/4 页 3 一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法及提高激肽释放酶稳 定性的药物组合物 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说涉及一种应用疏水色谱纯化激肽释放酶的方 法。 背景技术 0002 激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶， 它包括血浆型激肽释放酶和组织型激肽释放酶两 种类型， 分子量分别为25200道尔顿和33800道尔顿， 均能使激肽原释放出一种多肽激 肽， 而激肽释放酶激肽系统 （kallikrein kinin system， KKS） 是体内主要的降压系统之 一， 作为一个复杂的内源性多酶系统， 参与调控心血管、 肾脏、 。
8、神经系统等的生理功能， 与心 脏病、 肾病、 炎症反应、 癌症等疾病的发生有着密切关系。 0003 近年来在心血管系统方面的研究进展很快， 许多临床研究和基础实验已证实糖尿 病、 高血压、 心力衰竭、 心肌梗死及左心室肥厚等疾病的发生与 KKS 的活性降低有关。因而 深入研究 KKS 的作用为研究心血管相关疾病的发病机制和治疗手段提供了又一新的途径。 0004 本发明人自 2008 年开始对胰酶的生产工艺进行试验研究， 特别是在糜蛋白酶原 和胰蛋白酶原的生产过程中， 不断探索， 力求优化完善工艺参数， 并且在原有工艺的基础上 另辟蹊径， 成功完成提取激肽释放酶原的工艺研究， 其收率为 0.2%。
9、 0.4%， 生产工艺稳定， 质量可控。 发明内容 0005 本发明提供了一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法及提高激肽释放酶稳定性的 药物组合物， 通过疏水色谱等生物分离工程技术纯化激肽释放酶， 较好的保持蛋白活性。 0006 一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法及提高激肽释放酶稳定性的药物组合物， 其 特征在于 ： 采用疏水色谱等现代生物分离技术， 将激肽释放酶效价提高到 1500 1800iu/ mg， 更好的保持了蛋白的活性。 在发明技术方案中， 其特征还在于所述提取工艺包括如下步 骤 ： 1 离子交换层析 1.1 将激肽释放酶原用 0.001-0.01mol/L， PH3-6 的醋酸缓冲液溶。
10、解离心， 上清液加入 离子交换树脂， 搅拌、 吸附， 收集树脂， 漂洗直至无泡沫 ； 1.2 再用 0.01-0.3mol/L， PH3-8 的 0.1-5mol/L， PH5-10 的 NaCL 溶液搅拌洗脱树脂， 分 离树脂得洗脱液。 0007 2 盐析 调节洗脱液 pH 值至 3.0 5.0， 加入固体硫酸铵， 静置过夜， 次日过滤， 收集滤饼。 0008 3 超滤 加入滤饼重量 15 倍量的 （w/v） 磷酸盐缓冲液， 搅拌， 调节 pH 值至 7.0 9.0， 待液体超 滤， 体积控制在 3/10。 说 明 书 CN 105400757 A 3 2/4 页 4 0009 4 热原处理。
11、 4.1 取超滤液， 按 50 ： 5 ： 3 的比例， 先后加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液 ； 4.2 调节 pH 值至 8.0 10.0， 搅拌， 离心， 弃去沉淀物， 取滤液， 准备透析扎包。 0010 5 透析工序 取滤液， 透析液扎包， 放入纯化水中， 进行透析交换， 透析 4 6 天。 0011 6 疏水色谱 6.1用适量的含0.5-3mol/L (NH4)2SO4的0.01-0.3mol/L， PH3-8的NaAc-HAc缓冲液来 平衡疏水色谱快胶柱 ； 6.2 将透析液流经此柱， 流速控制在 15mL/min 左右 ； 6.3 平衡后， 用 0.5-3mol/L 的 (NH4)2S。
12、O4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线 ； 6.4 再用不含 (NH4)2SO4平衡缓冲液洗脱， 收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液， -20保 存。 0012 7 冻干 调节 pH 值至 5.5 6.5， 装盘、 冻干， 得激肽释放酶。 0013 经检测， 所得激肽释放酶效价约为 1500 1800iu/mg。 0014 与现有技术相比， 本发明的优点和积极效果是 ： 选用疏水色谱等现代生物分离技术纯化激肽释放酶 , 可以使其理化性质和生物活性 在后续生产过程中保持稳定， 最终使激肽释放酶的各项指标均符合中国药典标准。更重要 的是， 通过工艺的不断改进和完善， 使得激肽释放酶效价提高到 1500 1。
13、800iu/mg， 节约成 本， 提高了经济效益。 具体实施方式 0015 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 而不以任何方式限制。 0016 实施例 1 1） 离子交换层析 1.1） 将激肽释放酶原 20kg 用 0.005mol/L， PH4 的醋酸缓冲液 100L 溶解离心， 上清液 加入离子交换树脂， 搅拌吸附 2h， 收集树脂， 漂洗直至无泡沫 ； 1.2） 再用0.03mol/L， PH5的NaCL溶液150L搅拌洗脱树脂1h， 分离树脂得洗脱液138L。 0017 2） 盐析 调节洗脱液 pH 值至 3.0 5.0， 加入固体硫酸铵， 静置过夜， 次日过滤， 收集滤饼 13。
14、.5kg。 0018 3） 超滤 将所得滤饼投入反应罐中， 加入磷酸盐缓冲液163L， 搅拌10分钟， 用5mol/L NaOH调节 pH 值至 8.5， 待液体超滤， 体积控制在 3/10， 得超滤液 165L。 0019 4） 热原处理 4.1） 取上述超滤液， 按 50 ： 5 ： 3 的比例， 先加入 0.4mol/L 磷酸钠溶液 16.5L， 在不断搅 拌下缓缓加入 1mol/L 醋酸钙溶液 9.90L; 4.2） 用 2mol/L NaOH 调节 pH 值至 9.0， 稳定后继续搅拌 1.5 小时， 结束后， 离心 20 分 钟， 弃去沉淀物 , 得滤液 162L。 说 明 书 C。
15、N 105400757 A 4 3/4 页 5 0020 5） 透析工序 取上述滤液， 透析液扎包 （100mL/包） ， 将透析袋放入4纯化水中， 进行透析交换5天， 每 24 小时换一次纯化水。 0021 6） 疏水色谱 6.1） 用 44L 的含 1.5mol/L (NH4)2SO4的 0.2mol/L， PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液来平衡疏 水色谱快胶柱 ； 6.2） 将透析液流经此柱， 流速控制在 3mL/min 左右 ； 6.3） 平衡后， 用 1.5mol/L 的 (NH4)2SO4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线 ； 6.4） 再用不含(NH4)2SO4平衡缓冲液洗脱。
16、， 收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液， -20保 存。 0022 7） 冻干 用 2mol/L NaOH 溶液调节 pH 值至 6.0， 装盘、 冻干， 得激肽释放酶 6.5kg。 0023 经检测， 所得激肽释放酶效价约为 1725iu/mg。 0024 实施例 2 1） 离子交换层析 1.1） 将激肽释放酶原 1.8kg 用 0.005mol/L， PH4 的醋酸缓冲液 90L 溶解离心， 上清液 加入离子交换树脂， 搅拌吸附 2h， 收集树脂， 漂洗直至无泡沫 ； 1.2） 再用0.03mol/L， PH5的NaCL溶液140L搅拌洗脱树脂1h， 分离树脂得洗脱液126L。 0025 2）。
17、 盐析 调节洗脱液 pH 值至 3.0 5.0， 加入固体硫酸铵， 静置过夜， 次日过滤， 收集滤饼 12.9kg。 0026 3） 超滤 将所得滤饼投入反应罐中， 加入磷酸盐缓冲液156L， 搅拌10分钟， 用5mol/L NaOH调节 pH 值至 8.5， 待液体超滤， 体积控制在 3/10， 得超滤液 158L。 0027 4） 热原处理 4.1） 取上述超滤液， 按 50 ： 5 ： 3 的比例， 先加入 0.4mol/L 磷酸钠溶液 15.8L， 在不断搅 拌下缓缓加入 1mol/L 醋酸钙溶液 9.48 L; 4.2） 用 2mol/L NaOH 调节 pH 值至 9.0， 稳定后。
18、继续搅拌 1.5 小时， 结束后， 离心 20 分 钟， 弃去沉淀物 , 得滤液 155L。 0028 5） 透析工序 取上述滤液， 透析液扎包 （100mL/包） ， 将透析袋放入4纯化水中， 进行透析交换5天， 每 24 小时换一次纯化水。 0029 6） 疏水色谱 6.1） 用 42L 的含 2mol/L (NH4)2SO4的 0.15mol/L， PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液平衡疏水 色谱快胶柱 ； 6.2） 将透析液流经此柱， 流速控制在 2mL/min 左右 ； 6.3） 平衡后， 用 1mol/L 的 (NH4)2SO4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线 ； 6.4） 再。
19、用不含(NH4)2SO4平衡缓冲液洗脱， 收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液， -20保 存。 说 明 书 CN 105400757 A 5 4/4 页 6 0030 7） 冻干 用 2mol/L NaOH 溶液调节 pH 值至 6.5， 装盘、 冻干， 得激肽释放酶 6.2kg。 0031 经检测， 所得激肽释放酶效价约为 1688iu/mg。 0032 实施例 3 将实施例 2 制备的胰激肽原酶 120000 单位、 预胶化淀粉 217g、 微晶纤维素 65g、 柠檬酸 三钠1.63g置混合机内， 搅拌15分钟， 再加入羟丙基甲基纤维素7.25g、 硬脂酸镁0.37 g， 缓 缓均匀地加入混合机内搅拌， 至颗粒形成， 放入制粒机中制粒， 中间体检验， 合格后用高速 旋转压片机制成 10000 片， 片芯检验合格后按每公斤素片加入肠溶型薄膜包衣预混剂 ( 兰 色 )0.15kg 完成包肠溶衣工序。 0033 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非是对本发明作其它形式的限制， 任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、 等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。 说 明 书 CN 105400757 A 6 。