技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种常春藤皂苷元的制备方法。
背景技术
常春藤皂苷元（Hederagenin），别名(3beta,4alpha)-3,23-Dihydroxyolean-12-en-28-oic acid;常春藤皂甙元，分子式C30H48O4，可来源于市售或由多种途径制备得到，味苦、具有 吸湿性、刺激黏膜的作用，可溶于水、易溶于热水、热甲醇及热乙醇、不溶于乙醚等极性 小的有机溶剂。分子结构如下：
吴耀民等从预知子中通过酸水解皂苷，过滤，滤液不溶物用水洗去多余酸后抽干，得 粗品。进一步纯化采用药用乙醇加热溶解粗晶，另加入活性炭脱色，加热回流半小时，趁 热抽滤，醇溶液减压浓缩后，析出大量针簇状结晶，得常春藤皂苷元。该方法步骤复杂， 且采用大量有机溶剂，易造成污染且苷元含量及转移率差；信学雷等从维药瘤果黑种草籽 中采用脱脂、萃取及大孔树脂吸附的方法制备常春藤皂苷元，该方法采用多种有机溶剂， 不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简便、转移率高、无污染且易于产业化的常春藤皂苷元 的制备方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种常春藤皂苷元的制备方法，该方法包括将续断药材醇提后进行酸解，浓缩酸解后 得到的溶液，静置放冷，过滤所得沉淀物即为常春藤皂苷元。
该方法所述的醇提条件是乙醇浓度为65～90%，乙醇用量为药材重18～30倍，提取 时间3～9h，提取次数为1～3次。优选醇提条件是乙醇浓度为90%，乙醇用量为药材重 30倍，提取时间6h，提取次数为3次。
该方法所述的酸解条件是酸解液中盐酸体积分数为5～9%，酸解液中乙醇体积分数为 35～65%，酸解时间为4～8h，酸解温度为65～95℃，料液比为1:30～1:50。优选酸解条 件是酸解液中盐酸体积分数为7%，料液比为1:30（即每30ml酸解液中含有生药1g），酸 解时间为4h，酸解温度为80℃。
所述的续断药材粒度优选为过40目筛的粗粉，浸泡时间为2h。
本发明制备方法具体包括以下步骤：
取续断药材粗粉，用浓度为65～90%的乙醇浸泡2h，加热回流提取1～3次，乙醇用 量为续断药材重18～30倍，提取时间为3～9h，合并提取液，过滤；滤液回收乙醇至无醇 味得到得到粗提物；
在粗提物中加入乙醇以及盐酸，搅匀，得到酸解液，使酸解液中盐酸体积分数为5～ 9%，酸解液中乙醇体积分数为35～65%，酸解温度为65～95℃，酸解时间为4～8h，料液 比为1:30～1:50，酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味，在室温条件下放冷，沉淀，过滤， 得沉淀物，经水洗涤至中性，65℃条件下减压干燥，得常春藤皂苷元。
以下通过主要实验进一步解释本发明：
试药：常春藤皂苷元对照品（HPLC归一法测定，纯度大于98%）；乙腈（色谱纯，Tedia, USA）；水（纯净水，娃哈哈）；工业乙醇（食用级，南京鼎新试剂有限公司）；甲酸（分 析纯，南京化学试剂有限公司）；浓硫酸（南京化学试剂有限公司）；续断药材购自湖北鹤 峰，经鉴定为川续断（DipsacusasperoidsC.Y.chenget.T.M.Ai）的干燥根。
一、醇提工艺选择
1、固定因素(药材粒度、药材浸泡时间)的单因素考察
（1）药材粒度的考察
不同药材粒度的供试样品溶液制备：
取续断药材饮片，用电子天平减重法称取约5g药材，置于250ml圆底烧瓶内，加入 75ml的70%乙醇，水浴回流提取两次，每次3h（温度70℃）。提取结束后，将提取液过滤 至蒸发皿中，将蒸发皿置水浴锅上（80℃），挥去全部溶剂。挥去全部溶剂后用30ml乙醇 超声溶解转移至圆底烧瓶内，移液管精密吸取10.5ml浓盐酸至圆底烧瓶，再加入109.5ml 纯净水至圆底烧瓶。100℃下水浴回流酸解4h。
酸解结束后，取出圆底烧瓶，减压回收乙醇，放冷，减压抽滤酸反应溶液。有棕色固 形物吸附于滤纸上，用纯净水洗掉多余的酸，PH试纸测试PH值显示中性。棕色固形物于 烘箱中烘干（90℃），取出，至于蒸发皿内，加入少量甲醇，超声溶解，用干净的滴管转 移至10mL容量瓶，甲醇定容至刻度线，摇匀，即得样品液，浓度为0.2g生药/ml。移液管 精密吸取2.5ml样品液至10mL容量瓶，甲醇定容至刻度线，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤， 即得供试品溶液，浓度为0.05g生药/mL。
取续断药材颗粒（米粒大小），同法操作制备样品。
取续断药材粗粉（过40目筛），同法操作制备样品。
对照品溶液的制备：精密称取常春藤皂苷元对照品1.25mg，用甲醇溶解并定容至5ml， 摇匀，即得浓度为250μg/ml的对照品溶液。
不同药材粒度的样品溶液HPLC检测：色谱条件：色谱柱：phenomenex-C18柱 (4.6mm×25cm,5μm)及预柱；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液=64:36；检测波长：212nm； 进样量：20μl；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。在此条件下，样品中的常春藤皂苷元与其 他成分色谱峰均能得到较好的分离，相邻峰间分离度大于1.5，峰形良好，理论塔板数按 常春藤皂苷元峰计算不低于10000。
HPLC测定结果见表1。
表1：不同药材粒度考察测定结果
药材粒度考察结果:以目标成分常春藤皂苷元的含量及过滤难易为评价指标，选择粗粉 （过40目）为药材粒度，进行下一步提取工艺考察。
（2）药材浸泡时间的考察
同上述制备方法，药材浸泡时间分别为0h、1h、2h、3h。
测定结果见表2。
表2：不同药材浸泡时间考察测定结果
药材浸泡时间考察结果：以目标成分常春藤皂苷元的含量评价指标，选择2h为药材浸 泡时间，进行下一步提取工艺考察。
2、采用正交实验设计考察乙醇回流提取工艺
采用L9(34)正交实验设计，以药材中常春藤皂苷元的含量为考察指标，不同浓度乙醇、 不同溶媒倍量、不同提取时间及不同提取次数四个因素的不同水平进行筛选研究，以便确 定最佳的提取工艺。
（1）实验设计
因素水平表见表3；提取次数与溶媒倍量和提取时间的二次分配表见表4、表5。
表3：药材乙醇回流提取工艺因素水平表
表4：提取次数与溶媒倍量二次分配表
表5：提取次数与提取时间二次分配表
固定条件为：每份的投药量为5g，药材粒度为粗粉，浸泡时间为2h。酸解液中盐酸体 积分数为7%，酸解液中乙醇体积分数为50%，酸解时间为4h，酸解温度为80℃,料液比为 1:30。
（2）正交试验样品液HPLC检测
色谱条件：色谱柱：phenomenex-C18柱(4.6mm×25cm,5μm)及预柱；流动相：乙腈-0.1% 甲酸水溶液=64:36；检测波长：212nm；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。 在此条件下，样品中的常春藤皂苷元与其他成分色谱峰均能得到较好的分离，相邻峰间分 离度大于1.5，峰形良好，理论塔板数按常春藤皂苷元峰计算不低于10000。
（3）实验结果和分析
按照L9(34)正交表进行提取实验，计算9组样品中常春藤皂苷元的含量(%)，直观分析 实验结果见表6。
表6：乙醇回流提取正交试验安排表及直观分析表
从表6直观分析的结果可见，四个因素的极差大小排序为A>C>D>B，采用极差最小 的B作为误差列进行方差分析，A因素的水平均具有显著性差异(p<0.05)。A水平最佳因 素为90%乙醇，因为90%乙醇是最高浓度，故不再进行追加实验考察。
醇提最佳工艺：综合以上结果得到药材的醇提最佳工艺：药材粒度为过40目的粗粉； 药材浸泡时间为2h；乙醇浓度为90%；乙醇用量为药材重30倍；提取时间为6h；提取次 数为3次。
二、酸解工艺考察：
1、酸解液中乙醇体积分数的考察
固定因素：投料量为2g，酸解液中盐酸体积分数为5%，酸解温度为95℃，料液比为 1:30，酸解时间为4h。
考察因素：酸解液中乙醇体积分数分别考察30%、50%、80%。
（1）酸解液中不同体积分数乙醇考察的样品液制备
同上法操作步骤，控制酸解液中乙醇体积分数分别为30%、50%、80%。
样品液的HPLC检测色谱条件同上。
（2）测定结果
表7：不同乙醇体积分数分别考察测定结果
（3）酸解液中不同体积分数乙醇考察结果
随着酸解液中乙醇体积分数的增大，样品中常春藤皂苷元的含量显著性的提高，当酸 解液中乙醇体积分数达到50%时，样品纯度达到了92.58%，即已经达到了我们的目标纯度 90%以上。随着乙醇体积分数的继续增大，纯度有所下降，但是仍保持在目标纯度90%以 上，由此推测，酸解液中乙醇体积分数是影响样品纯度的主要因素，从为了保证样品纯度 达到目标纯度90%以上及节约乙醇用量的条件下，在进行正交试验考察中，酸解液中乙醇 体积分数分别为设置为35%、50%、65%。
2、料液比的考察
固定因素：投料量为2g，酸解液中盐酸体积分数为5%，酸解温度为95℃，酸解时间 为4h，酸解液中乙醇体积分数为30%。
考察因素：料液比1:10、1:30、1:50。
（1）不同料液比样品液的制备
同上述操作步骤，控制料液比为1:10、1:30、1:50。
不同料液比考察样品液的HPLC检测色谱条件同上。
（2）测定结果
表8：不同料液比样品液考察测定结果
（3）料液比考察结论
随着料液比的增大，所得样品的纯度有所提高，但是增大到1:50时还是没有达到我 们的目标纯度90%，由此推测料液比可能不是影响样品纯度的关键因素。从节约溶剂成本 的角度考虑，在进行正交试验考察中，料液比的设置为1:30、1:40、1:50。
3、正交实验设计考察酸解工艺
采用L9(34)正交实验设计，以所得样品的纯度为考察指标，不同体积分数的盐酸、酸 解液中的不同乙醇体积分数、不同酸解时间及料液比四个因素的不同水平进行筛选研究， 以便确定最佳的酸解工艺。
（1）实验设计
因素水平表见表9；正交实验工作安排表及实验结果分别见表10、11。
表9：药材酸解工艺因素水平表
固定条件为：每份的投药量为3g，酸解温度为95℃。
（2）样品液制备
根据上述正交设计，进行九组不同的酸解条件下实验。
（3）正交试验样品液HPLC检测及结果
色谱条件同上。
表10：酸解工艺L9(34)正交实验结果
4）实验结果分析
按照L9(34)正交表进行提取实验，计算9组样品中常春藤皂苷元的含量(%)，直观分析 实验结果见表11。
表11：酸解工艺正交试验安排表及直观分析表
从直观分析的结果可见，四个因素的极差大小排序为B>A>C>D，采用极差最小的D 作为误差列进行方差分析，结果显示，B因素的水平均具有显著性差异(p<0.05)。所以正交 实验结果显示，最佳的酸解工艺为：酸解液中盐酸体积分数为7%，酸解液中乙醇体积分 数为50%，酸解时间为4h，料液比为1:30。
结果：发明人采用酸解最佳工艺，取三份原料进行验证实验，测得酸解所得样品的纯 度平均纯度为94.82%，其结果优于正交试验的所有组别，且三份样品纯度的RSD小于2%， 说明该工艺为稳定的最佳工艺。
最优常春藤皂苷元的制备工艺为：将续断药材过40目筛的粗粉用浓度为90%的乙醇 浸泡2h，加热回流提取3次，乙醇倍量为续断药材重30倍，提取时间共为6h，每次2h， 合并3次提取液，过滤；滤液回收乙醇至无醇味得到得到粗提物。
在粗提物中加入浓度为95%的乙醇以及盐酸，搅匀，得到酸解液，使得酸解液中盐酸 体积分数为7%，乙醇体积分数为50%，酸解温度为80℃，酸解时间为3h，料液比为1:30。 酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味，在室温条件下放冷，沉淀，过滤，得沉淀物，经少 量水洗涤，65℃条件下减压干燥，得常春藤皂苷元。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明常春藤皂苷元提取方法简便、转移率高达 95～98%，得到的常春藤皂苷元纯度在93%以上、无污染、且易于工业产业化。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不 应理解为对本发明总的技术方案的限定。
实施例1
将续断药材过40目筛的粗粉（木通皂苷D含量为4%）用浓度为90%的乙醇浸泡2h， 加热回流提取3次，乙醇倍量为续断药材重30倍，提取时间共为6h，每次2h，合并3次 提取液，过滤；滤液回收乙醇至无醇味得到得到粗提物，粗提物的得率约为6%，木通皂 苷D的转移率98%；
在粗提物中加入浓度为95%的乙醇以及盐酸，搅匀，得到酸解液，使得酸解液中盐酸 体积分数为7%，乙醇体积分数为50%，酸解温度为80℃，酸解时间为4h，料液比为1:30。 酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味，在室温条件下放冷，沉淀，过滤，得沉淀物，经少 量水洗涤至中性，65℃条件下减压干燥，得常春藤皂苷元。常春藤皂苷元纯度94.85%，常 春藤皂苷元的得率约为1.8%。
实施例2
将续断药材过40目筛的粗粉（木通皂苷D含量为4%）用浓度为90%的乙醇浸泡2h， 加热回流提取3次，乙醇倍量为续断药材重18倍，提取时间共为6h，每次2h，合并3次 提取液，过滤；滤液回收乙醇至无醇味得到得到粗提物，粗提物的得率约为6%，木通皂 苷D的转移率97.5%；
在粗提物中加入浓度为95%的乙醇以及盐酸，搅匀，得到酸解液，使得酸解液中盐酸 体积分数为9%，乙醇体积分数为50%，酸解温度为80℃，酸解时间为4h，料液比为1:50。 酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味，在室温条件下放冷，沉淀，过滤，得沉淀物，经少 量水洗涤至中性，65℃条件下减压干燥，得常春藤皂苷元。常春藤皂苷元纯度94.02%，常 春藤皂苷元的得率约为1.79%。
实施例3
将续断药材过40目筛的粗粉（木通皂苷D含量为4%）用浓度为80%的乙醇浸泡2h， 加热回流提取2次，乙醇倍量为续断药材重18倍，提取时间共为9h，每次4.5h，合并2 次提取液，过滤；滤液回收乙醇至无醇味得到得到粗提物，粗提物的得率约为6%，木通 皂苷D的转移率97%；
在粗提物中加入浓度为95%的乙醇以及盐酸，搅匀，得到酸解液，使得酸解液中盐酸 体积分数为5%，乙醇体积分数为50%，酸解温度为65℃，酸解时间为6h，料液比为1:40。 酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味，在室温条件下放冷，沉淀，过滤，得沉淀物，经少 量水洗涤至中性，65℃条件下减压干燥，得常春藤皂苷元。常春藤皂苷元纯度93.63%，常 春藤皂苷元的得率约为1.82%。