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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610048293.X (22)申请日 2016.01.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 厦门大学 地址 361000 福建省厦门市思明南路 422 号 申请人 国家海洋局第三海洋研究所 (72)发明人 林镇跃 陈明谅 陈建明 (74)专利代理机构 厦门市精诚新创知识产权代 理有限公司 35218 代理人 方惠春 (54) 发明名称 一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引 物、 探针及鉴定方法。
2、 (57) 摘要 本发明公开了一种鉴定珊瑚共生光合藻类 快速分裂型的引物、 探针及鉴定方法。所述引 物为 SEQ ID NO:2-3， 探针为 SEQ ID NO:4 ； 或 引物和探针分别为 SEQ ID NO:5-7 ； 或引物和 探针分别为 SEQ ID NO:8-10 ； 或引物和探针分 别为 SEQ ID NO:11-13 ； 或引物和探针分别为 SEQ ID NO:14-16 ； 或引物和探针分别为 SEQ ID NO:17-19 ； 所述探针的 5 端、 3 端分别用 FAM 报 导荧光染料和 TAMRA 淬灭基团标记。可进行珊瑚 共生光合藻类快速分裂型的定性和定量鉴定。 (51。
3、)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表6页 附图4页 CN 105506145 A 2016.04.20 CN 105506145 A 1.一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物和探针， 其特征在于， 所述引物为SEQ IDNO:2-3， 探针为SEQIDNO:4； 或引物为SEQIDNO:5-6， 探针为SEQIDNO:7； 或引物为SEQIDNO:8-9， 探针为SEQIDNO:10； 或引物为SEQIDNO:11-12， 探针为SEQIDNO:13； 或引物为SEQIDNO:14-15， 探针为SEQIDNO:1。
4、6； 或引物为SEQIDNO:17-18， 探针为SEQIDNO:19； 所述探针的5 端、 3 端均分别用FAM报导荧光染料和TAMRA淬灭基团标记。 2.一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的试剂盒， 其特征在于， 含有权利要求1 所述的引物和探针。 3.权利要求1所述引物和探针或权利要求2所述的试剂盒用于鉴定珊瑚共生光合藻类 快速分裂型的用途。 4.一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 采用权利要求1所 述引物和探针或权利要求2所述的试剂盒。 5.权利要求4所述用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 步骤 为， 提取光合藻类DNA； PCR扩增。
5、， 采用权利要求1所述引物和探针； 结果判定。 6.权利要求5所述用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 所述 PCR扩增的程序为： 90-100,30-60s； 90-100,5-30s， 50-70,20-90s， 2050个循环， 在 每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测， 荧光模式设为FAM； 淬灭基团设为TAMRA。 7.权利要求5所述用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 所述 PCR扩增的体系为， 1/10体积的10倍PCR反应缓冲液， dNTP各0.10.5mmol/L， TaqDNA聚合 酶0.15国际单位， 探针0.10.5mmol/L分。
6、离纯化的DNA模板液0.15 l， 上下游引物各 0.12mmol/L， 加无菌去离子水使总体积达到10100 l。 8.权利要求5所述用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 所述结 果判定为： 如果Ct值在0-40之间， 优选的， Ct值在0-38之间； 判定为阳性， 表示样品检出珊瑚共生 光合藻类的快速分裂型为CladeA； 如果Ct值为0或者大于等于40， 判定为阴性， 表示样品未检出珊瑚共生快速分裂型光合 藻类。 9.权利要求5所述用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 还包括 根据标准曲线， 依据Ct值计算出快速分裂型为CladeA的浓度值Y； 所。
7、述标准曲线为Yclade A-0.3098x+5.4468， R20.9992。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506145 A 2 一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物、 探针及鉴定 方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引 物、 探针及鉴定方法。 背景技术 0002 很多海洋无脊椎动物 ， 如珊瑚、 海葵等 ， 发现会与一类光合自养的 海藻 Symbiodinium(又名虫黄藻)共生。 最近通过分子生物学研究发现Symbiodinium属的藻类在 不同的海洋生物宿主中存在生物多样性， 基于分子分类的方法， 把Symbi。
8、odinium属分为A-G 七个类型。 其中A-F， G是与造礁珊瑚共生的光合藻类， 这些藻类的多样性分布不仅与宿主的 种类相关， 还与珊瑚礁的群落， 地理位置相关。 由于Symbiodinium的群体组成(不同的种类 细胞或个体的丰度)是动态变化的， 通常认为这是Symbiodinium为响应环境变化的生理反 应。 然而， 目前对珊瑚组织中共生的Symbiodinium生理生长特点和与珊瑚宿主的共生关系 还知之甚少， 故而以为一些共生的藻类难以培养， 这是对Symbiodinium研究的一个重要难 题。 0003 珊瑚健康及白化现象一直是国际国内研究的焦点， 很多学者一直以来都认为珊瑚 的健。
9、康状态与共生藻的共生有紧密的关系， 共生藻的 “逃跑” 或 “丢失” 被认为是珊瑚疾病或 白化的直接原因。 研究发现珊瑚 “白化” 现象的发生与共生的Symbiodinium群体和多样性动 态变化息息相关。 比如， 由于海水温度随季节性动态变化， 在遇水温升高的情况下， 具有耐 热性较强的共生藻类的细胞丰度就会出现。 目前用于调查藻类细胞数量的方法普遍使用人 工显微镜下的细胞计数， 该方法费时耗力， 实验误差大， 另外从显微镜的形态学观察很难鉴 定共生藻的种类、 类型。 同时在高细胞密度的情况下， 是可行的， 但如果藻类细胞密度低， 就 难以检测。 如何快速， 简单， 准确， 可靠的检测海藻类。
10、型或者细胞丰度， 具有重要的实际运用 意义。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物和探针。 0005 为实现上述目的， 本发明提供一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物和探 针， 其特征在于， 所述引物为SEQIDNO:2-3， 探针为SEQIDNO:4； 0006 或引物为SEQIDNO:5-6， 探针为SEQIDNO:7； 0007 或引物为SEQIDNO:8-9， 探针为SEQIDNO:10； 0008 或引物为SEQIDNO:11-12， 探针为SEQIDNO:13； 0009 或引物为SEQIDNO:14-15， 探针为SEQIDNO:1。
11、6； 0010 或引物为SEQIDNO:17-18， 探针为SEQIDNO:19； 0011 所述探针的5 端、 3 端均分别用FAM报导荧光染料和TAMRA淬灭基团标记。 0012 一个方面， 本发明提供一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的试剂盒， 其 说明书 1/6 页 3 CN 105506145 A 3 特征在于， 含有所述的引物和探针。 0013 一个方面， 提供所述的试剂盒用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的用途。 0014 一个方面， 提供一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法， 其特征在于， 采用所述引物和探针或所述的试剂盒。 0015 进一步， 步骤为， 0016 。
12、提取光合藻类DNA； 0017 PCR扩增， 采用所述引物和探针； 0018 结果判定。 0019 进一步， 所述PCR扩增的程序为： 90-100,30-60s； 90-100,5-30s， 50-70,20- 90s， 2050个循环， 在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测， 荧光模式设为FAM； 淬灭 基团设为TAMRA。 0020 进一步， 所述PCR扩增的体系为， 1/10体积的10倍PCR反应缓冲液， dNTP各0.1 0.5mmol/L， TaqDNA聚合酶0.15国际单位， 探针0.10.5mmol/L分离纯化的DNA模板液 0.15 l， 上下游引物各0.12mmol/L，。
13、 加无菌去离子水使总体积达到10100 l。 0021 进一步， 所述结果判定为： 0022 如果Ct值在0-40之间， 优选的， Ct值在0-38之间； 判定为阳性， 表示样品检出珊瑚 共生光合藻类的快速分裂型为CladeA； 0023 如果Ct值为0或者大于等于40， 判定为阴性， 表示样品未检出珊瑚共生快速分裂型 光合藻类。 0024 进一步， 还包括根据标准曲线， 依据Ct值计算出快速分裂型为CladeA的浓度值Y； 所述标准曲线为YcladeA-0.3098x+5.4468， R20.9992。 0025 所述珊瑚共生快速分裂型的光合藻类CladeA， 是指在中国海域， 珊瑚共生的光。
14、合 藻类CladeA， 具有在温度25正常光照培养下， 其藻体生长速度及细胞分裂速率远远快于 CladeC和CladeF的光合藻类类型， 其检测鉴定特征序列为： 0026 CAATAGTGGAAGGTCCAAAAGGGACCAATGACGATGGGCAATAGCCAGAACATACACTCTGGGTGCAGCTCCGAGTA CGCCCACTCGCCCATAGCTTCCACTTG。 记为SEQIDNO:1。 0027 本发明主要依据物种的基因序列特异性， 利用这段序列的分子标记可以特异的鉴 定共生光合藻CladeA， 同时区别于非A型的珊瑚共生藻； 另外经过前期的序列比对及实验 验证， 通过这。
15、段序列GC含量介于45-60； 长度介于100-150bp； 扩增效率高。 同时设计所得 的引物不易形成二聚体； 引物的退火温度60,探针的退火温度68以上， 二者相差8， 探 针适合携带荧光标记。 故选择此段序列作为分型鉴定的分子标记。 0028 为了实现上述目的， 本发明的珊瑚共生快速分裂型的光合藻类CladeA分子检测 方法， 首先是依据CladeA类型的特征序列， 设计用于实时定量TaqmanPCR的若干引物和 Taqman探针组合FAM-CladeA。 0029 从2014年开始， 申请人通过对中国海域珊瑚样品调查采样及Symbiodinium的生物 地理学研究， 初步鉴定中国海域珊。
16、瑚共生的Symbiodinium常见有CladeA和C两种类型。 通 过不同其培养研究表明， CladeA,F和C在相同的培养状态下分裂速率完全不同， CladeA的 分裂速度和生长速度明显快于CladeC和CladeF。 说明SymbiodiniumCladeA是快速分裂 说明书 2/6 页 4 CN 105506145 A 4 的类型， 这一发现可能与珊瑚 “白化” 或者珊瑚组织的共生藻类丰度的动态变化密切相关。 为此， 如何对中国海域珊瑚共生光合藻类快速分裂型SymbiodiniumCladeA进行快速的检 测鉴定， 对研究珊瑚 “白化” 机理及其防控防治具有十分重要的意义。 0030 。
17、为了确保参试藻种为珊瑚共生光合藻类的快速分裂型CladeA， 本发明通过离体 纯化培养和ITS PCR方法对所采集的样品进行了藻类CladeA的鉴定。 0031 本发明的优点： 本发明以快速分裂型藻种CladeA的ITS序列易变异区设计特异引 物和TanMan探针组合(FAM-CladeA)， 通过TaqmanPCR技术可实现对快速分裂型藻种Clade A的快速定量检测和细胞快速分裂类型的准确鉴定。 进而换算得出共生藻的数量。 0032 本发明首先通过共生藻的培养实验， 比较各种共生藻的分裂速度， 确定A型为快速 分裂性， 选择鉴定A型的意义主要是考虑到快速分裂型共生藻未来可以利用其分裂， 生。
18、长速 度快的优势， 运用于珊瑚的修复。 通过选择最具有针对A型的特异的DNA位点作为标记， 设计 引物及探针， 同时又能准确区分其他非A型的共生藻， 通过前期大量实验验证， 比较多对探 针引物组合的特异性， 另外考虑到引物自身的退火温度， GC含量， 引物长度等综合因素， 本 发明的引物和探针鉴定A型较为理想， 最终达到准确的鉴定区分A型共生藻的目的。 并且充 分利用定量PCR灵敏性特点， 需要的共生藻dna摄入量少， 对珊瑚组织的取样量少， 不但可以 最大限度减少对珊瑚的破坏， 而且可以动态监测珊瑚组织的A型共生藻的数量变化， 探讨A 型共生藻与珊瑚健康状态的关系， 研究及应用价值大。 在我。
19、国， 关于海洋环境监测的指标及 技术有很大的缺陷， 对珊瑚生活环境及健康状态的评价更是一片空白， 对我国珊瑚礁的保 护缺乏法律依据及相关标准。 本发明以此目的作为出发点， 通过准确鉴定及定量测定珊瑚 组织内共生藻的细胞数量， 从珊瑚共生藻的细胞数量鉴定及检测作为一项指标， 以此为角 度进而评判珊瑚的健康状态， 未来有望成为行业内的一项标准。 附图说明 0033 图1是不同藻种培养时间与藻体细胞的光密度吸收关系图。 0034 图2是不同藻种培养10天与21天后藻体细胞的个数的比较图。 0035 图3是用于鉴定珊瑚共生光合藻类的探针及引物设计原理图。 0036 图4是珊瑚共生光合藻类样品的快速分型。
20、结果图。 0037 图5是不同稀释浓度的藻种DNA的TaqmanPCR反应扩增曲线图。 0038 图6是藻种DNA浓度与Ct值的关系图。 具体实施方式 0039 下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。 下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的， 旨在用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。 实施例 中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 0040 WZD35， ITO1。
21、0， WZD17， SSG， XMH和Symka藻株均保藏于中国海洋微生物菌种保藏 管理中心(MCCC)， MCCC属于国家级公益性微生物资源共享平台。 0041 实施例1： 供试藻种培养及细胞分裂速率、 生长速度的比较 说明书 3/6 页 5 CN 105506145 A 5 0042 将分离得到的珊瑚共生藻种ITO10(Symbiodiniumsp .CladeA)、 WZD17 (Symbiodiniumsp.CladeC)和XMH(Symbiodiniumsp.CladeF)用MIK(日本)或f/2培养基 (f/2培养基配方(g/L)A:NaNO375mg75gB:NaH2Po4.H2。
22、O5mg5gC:Na2SiO3.9H2O20mg20g DNa2EDTA4.36mg4.36gE:FeCl3.6H2O3.16mg3.16gF:CuSO4.5H2O0.01mg0.01g ZnSO4.7H2O0.023mg0.023gCoCl2.6H2O0.012mg0.012gMnCl.4H2O0.18mg0.18g Na2MoO42H2O0.07mg0.07gG:维生素B10.1g0.1mg维生素B120.5g0.5mg生物素0.5g 0.5mg自然海水(0.4mm孔径滤膜过滤)1升在121度下灭菌20分钟)。 接种到三角瓶中培养， 加 入MIK(日本)或f/2培养基于光照培养箱中进行培养。
23、。 培养条件： 温度262， 光照强度25- 40 Em-2s-1， 光照周期14h/10h。 将两个盛有自来水的烧杯置于培养箱中保持湿度恒定。 光照 培养1-2个月， 该方法用于制备光合藻类的细胞。 0043 通过血细胞计数板在显微镜下计算藻类细胞个数， 调整细胞浓度至105个细胞/ ml。 取50ul接种到50ml的f/2培养基中， 按前面所述的条件进行培养。 隔三天取1ml培养细胞 的样品， 在分光光度计下(OD600)测量、 比较三个样品的光吸收值。 并通过血细胞计数板在 显微镜下计算藻类细胞个数。 比较三种类型藻类的细胞分裂和生长速度。 0044 经比较ITO10生长速度最快， 确定。
24、ITO10(Symbiodiniumsp.CladeA)为快速分裂 型。 结果见图1和图2。 其中图1是不同藻种培养时间与藻体细胞的光密度吸收关系图。 纵坐 标代表OD600的吸收值， 横坐标为培养时间(天)， 从图1可知ITOCladeA生长速度最快。 图 2是不同藻种培养10天与21天后藻体细胞的个数的比较图。 纵坐标代表细胞个数， 横坐标为 培养时间(天)。 从图2可知ITOCladeA细胞个数最多， 即分裂速度最快。 0045 实施例2： 藻种DNA的提取 0046 利用离心方法收集实施例1确定为ITO10的藻类细胞， 即将藻体细胞置于10ml的 离心管中， 4， 13,000rpm,。
25、离心15min， 去上清液后， 将沉淀的菌体置于无菌超净工作台吹 干。 然后， 采用CTAB法提取藻体的基因组DNA： 首先， 将离心收集得到的藻体转移到1.5ml eppendorf管； 加入600ul的CTAB提取液， 置于水浴651小时， 期间多次强烈震荡， 以使藻体 细胞充分破碎。 其次， 将离心管从水浴中移出， 加入与DNA提取液等体积的酚、 氯仿、 异戊醇 (体积比25： 24： 1)混合液， 剧烈涡旋5min， 离心收集上清液。 最后， 加入等体积的氯仿/异戊 醇(体积比24： 1)， 倒换数次充分混匀， 4， 12,000rpm,离心5min， 取上清液至新的离心管 中。 重新。
26、抽提一次后(以便除去杂质， 提高纯化效率)， 吸取上清液至新的离心管中， 加入两 倍体积预冷的无水乙醇(-20)， -20冰箱放置30min左右。 取出后12,000rpm,离心12min， 于浓缩冷冻离心干燥仪上干燥， 然后加入Rnase水溶液， 37水浴消化1小时， (除去RNA杂 质)。 琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增判断所提DNA质量后， -20保存备用。 调整珊瑚共生光合藻 类快速分裂CladeA的代表藻种ITO10的样品DNA的终浓度为200 g/ml。 0047 实施例3： Taqman荧光定量PCR检测 0048 根据珊瑚共生光合藻类快速分裂型CladeA的特异序列设计实时定量PC。
27、R引物和 Taqman探针组合(FAM-CladeA)。 设计原理图见图3， 图3中， 展示相关的现有珊瑚共生藻的 部分ITS序列的比对结果， 从图中所示， 不同类型的共生藻之间序列表现极大的不一致和变 异， 而同一类型的共生藻之间序列又表现非常的保守和抑制。 可以选取对共生藻A型的特异 片段， 在符合设计引物探针要求为前提下， 设计专门针对鉴定A型共生藻的探针及引物。 0049 其中FAM CladeA包括下述引物探针组中的一组： 说明书 4/6 页 6 CN 105506145 A 6 0050 FAM-CladeA第一组： 0051 引物： FAM-CladeA-F1： 5 -TTTAC。
28、CCTTTCCTCCGCTTAC-3 SEQIDNO:2； 0052 FAM-CladeA-R1： 5 -TTCTTGAGTGACGCTGCTTAT-3 SEQIDNO:3； 0053 探针： FAM-CladeA-P1： 5 -AGCGGGTTCACTTGTCTGACTTCA-3 ； SEQIDNO:4； 0054 FAM-CladeA第二组： 0055 引物： FAM-CladeA-F2： 5 -CTAAGCACTGAAGCAGACATACT-3 SEQIDNO:5； 0056 FAM-CladeA-R2： 5 -GCGCGATAGTCTTTGTGAATTG-3 SEQIDNO:6； 00。
29、57 探针： FAM-CladeA-P2： 5 -TCAGGAAATCCCAAGAGTGCAACGT-3 ； SEQIDNO:7； 0058 FAM-CladeA第三组： 0059 引物： FAM-CladeA-F3： 5 -AGCATCCCTCACAACCAAAG-3 SEQIDNO:8； 0060 FAM-CladeA-R3： 5 -AGAGGAAGGAGAAGTCGTAACA-3 SEQIDNO:9； 0061 探针： FAM-CladeA-P3： 5 -AATGATCCTTCCGCAGGTTCACCT-3 ； SEQ IDNO:10； 0062 FAM-CladeA第四组： 0063 。
30、引物： FAM-CladeA-F4： 5 -CACGAGTTCAGCAAGCAGATA-3 SEQIDNO:11； 0064 FAM-CladeA-R4： 5 -CGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3 SEQIDNO:12； 0065 探针： FAM-CladeA-P4： 5 -CGCAAGCATCCCTCACAACCAAAG-3 ； SEQIDNO:13； 0066 FAM-CladeA第五组： 0067 引物： FAM-CladeA-F5： 5 -CGGGTTCACTTGTCTGACTT-3 SEQIDNO:14； 0068 FAM-CladeA-R5： 5 -GCTTTGCGCG。
31、ATGCTATTC-3 SEQIDNO:15； 0069 探针： FAM-CladeA-P5： 5 -TTGAGTGACGCTGCTTATGCTTGC-3 ； SEQIDNO:16； 0070 FAM-CladeA第六组： 0071 引物： FAM-CladeA-F6： 5 -CAATAGTGGAAGGTCCAAAAGG-3 SEQIDNO:17； 0072 FAM-CladeA-R6： 5 -CAAGTGGAAGCTATGGGCGAGTG-3 SEQIDNO:18； 0073 探针： FAM-CladeA-P6： 5 -CCAGAACATACACTCTGGGTGCAGC-3 ； SEQIDN。
32、O:19； 0074 上述Taqman探针的5 端、 3 端分别用FAM报导荧光染料和TAMRA淬灭基团标记。 0075 通过前期的大量实验验证及比较， 探针及引物组合第六组作为分型鉴定共生光合 藻CladeA， 其设计原理见图3， 主要依据物种的基因序列特异性， 利用这对探针及引物组合 可以十分特异的鉴定A型， 同时区别于非A型的珊瑚共生藻。 其次， 综合考虑到适合设计 Taqman探针及引物的其他因素， 探针及引物GC含量介于4560； 引物及探针的长度介于 2027bp； 引物不易形成二聚体； 引物的退火温度60,探针的退火温度68以上， 二者相 差8以上； 扩增效率高等， 减少了引物因。
33、素可能携带的实验误差， 保证了实验的重复型和 准确性。 0076 利用实施例3的引物和Taqman探针组FAM-CladeA的第六组(可以换成任意一组引 物和探针， 得到的结果均相同)进行快速分裂型CladeA的荧光定量PCR检测： 0077 扩增反应总体积为20 L， 其中上下游引物(FAM-CladeA-F6/FAM-CladeA-R6) 200nM， 探针(FAM-CladeA-P6)100nM,10 lqPCRProbeMasterMix(Vazyme,南京)， ROXReferenceDyeI0.4 l,模板1 L(WZD35的DNA， ITO10的DNA， WZD17的DNA， S。
34、SG的 DNA， XMH的DNA或Symka的DNA， 浓度均为2 g/ml),余下用双蒸水补足20 L， 置ABIStepOne Plus荧光定量PCR系统运行分析， 在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测， 荧光模式设 说明书 5/6 页 7 CN 105506145 A 7 为FAM,淬灭模式设为TAMRA。 反应程序为： 955min； 9510s， 6030s， 40个循环。 0078 结果见图4和表1， 图4是珊瑚共生光合藻类样品的快速分型结果图。 从图4中可以 看出， 快速分裂型藻种CladeA样品定量PCR检测结果在一定循环范围内与荧光强度变化为 指数性增长(呈S型曲线扩增)，。
35、 PCR在一定的循环范围内， 与荧光强度变化的Lg值(即10为底 的对数函数值)呈线性关系。 Ct值介于0-40， 其中Ct(阈值)以定量PCR默认的设置作为参考。 但是非CladeA的样品没有出现S型扩增曲线， 其Ct值为0， 说明Taqman探针FAM-CladeA结 合qPCR的方法， 具有较好的特异性。 0079 表1珊瑚共生光合藻类样品的快速分型结果表 0080 0081 0082 从表1可以看出， WZD35和ITO10为CladeA型， 其定量PCR呈阳性， ct值介于0-40 之间； 非A型共生藻WZD17和SSG(CladeC型)及XMH和Symka(CladeF型)， 鉴定。
36、结果呈阴性， ct值为0。 说明本发明设计的探针及引物结合定量PCR的方法可以准确的鉴定A型珊瑚共生 光合藻快速分裂型。 0083 实施例4： Taqman探针PCR的敏感性分析 0084 调整珊瑚共生光合藻类快速分裂型藻种Symbiodiniumsp.ITO10样品(CladeA) DNA的终浓度为20 g/ml。 依次进行10倍系列稀释(10-1， 10-2， 10-3， 10-4， 10-5， 10-6),分别用特 异鉴定Taqman探针FAM-CladeA进行TaqmanPCR检测， 得到如图1所示的动力学曲线。 0085 结论： 探针FAM-CladeA对ITOCladeA的DNA样。
37、品在6个稀释度(10-110-6)的范 围内定量PCR呈S型扩增曲线， 见图5； 图5是不同稀释浓度的藻种DNA的TaqmanPCR反应扩增 曲线图， 横坐标代表循环数Ct值， 纵坐标代表荧光吸收强度变化值。 从图5可以看出， 所有的 样品扩增曲线呈S型指数增长， 且不同稀释度之间的Ct值相差均匀， 符合定量PCR的Ct值与 起始拷贝数之间严格的线性关系， 结果见图6， 图6是藻种DNA浓度与Ct值的关系图。 横坐标 (x)代表循环数Ct值， 纵坐标(Y)代表DNA浓度。 YcladeA-0.3098x+5.4468， R20.9992。 0086 因此， 样本拷贝数与Ct值之间有良好的相关性。
38、。 为了保证检测结果的可靠性和准 确性， 结合多次重复实验分析， 确定Taqman探针FAM-CladeA鉴定的Symbiodinium sp.CladeA检测极限Ct值为38。 通过标准曲线换算成DNA浓度， 检测极限的共生光合藻快速 分裂A型DNA负载量为2pg， 估算约为0.2个细胞(以共生藻基因组大小为1500MB为例)。 0087 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例， 可以理解的是， 上述实施例是示例 性的， 不能理解为对本发明的限制， 本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、 修改、 替换和变型。 说明书 6/6 页 8。
39、 CN 105506145 A 8 0001 0002 序列表 1/6 页 9 CN 105506145 A 9 序列表 2/6 页 10 CN 105506145 A 10 0003 序列表 3/6 页 11 CN 105506145 A 11 0004 序列表 4/6 页 12 CN 105506145 A 12 0005 0006 序列表 5/6 页 13 CN 105506145 A 13 序列表 6/6 页 14 CN 105506145 A 14 图1 图2 说明书附图 1/4 页 15 CN 105506145 A 15 图3 说明书附图 2/4 页 16 CN 105506145 A 16 图4 图5 说明书附图 3/4 页 17 CN 105506145 A 17 图6 说明书附图 4/4 页 18 CN 105506145 A 18 。