技术领域
本发明属于生物技术和免疫性领域；更具体地，本发明涉及监测肾损伤的 新型试剂和试剂盒。
背景技术
嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)以往作为一种中性粒细胞激 活标志为人们所知，当入侵微生物引起中性粒细胞脱颗粒和颗粒蛋白胞吐时， NGAL被释放到血液中。后来，NGAL被报导可作为尿生物标记，用来检测肾 小管细胞损伤的早期发作。美国专利申请2005/0272101公开了血清中NGAL用 于同样的目的。PCT申请WO2006/066587公开了怎样利用尿或血浆或血清中的N GAL进行检测。因此，NGAL已经作为一种疾病发作的标记物被人们研究和应 用。人NGAL共包括198个氨基酸。
尽管NGAL作为疾病诊断的标志物已经为人们所了解，然而由于它的全长 蛋白本身免疫原性并不理想，免疫获得抗体的过程中还存在抗体效价差，不稳 定的缺陷。
因此，本领域还有必要进一步优化针对以上检测NGAL的抗体，以期提高 肾损伤诊断的准确率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种监测肾损伤的新型试剂和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，它是如SEQIDNO：1或SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于嗜中性粒细胞明胶酶相关 性脂运蛋白(NGAL)。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它编码所述的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种多肽混合物，其由SEQIDNO：1和SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽混合而成。
在一个优选例中，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽 混合的比例按照重量比为1∶5～5∶1。
较佳地，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽混合的比 例按照重量比为1∶3～3∶1。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽混合物的用途，用于制备特异性抗 嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的抗体，其是由所述的多 肽混合物免疫动物而获得。
在一个优选例中，所述的抗体是多克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种制备抗体的方法，所述方法包括：以所述 的多肽混合物免疫动物，从免疫后的动物体内分离出特异性抗嗜中性粒细胞明 胶酶相关性脂运蛋白的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的试剂盒，包括：
固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体，该多克隆抗体由所述的多 肽混合物免疫动物而获得。
在一个优选例中，所述的固相载体是包被板、试纸和/或微球。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括：标记的检测抗体，显色剂， 洗涤液，终止液和/或使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1、ELISA反应后，在A405nm测酶标板上各孔的吸光度，所获得的读 数。其中A、B行微孔中包被SEQIDNO：1多肽；在C、D行微孔中包被SEQ IDNO：2多肽。1、2列为#YZ2391号兔子1∶1000稀释度的血清(多抗)；3、4 列为#YZ2391号兔子1∶10,000稀释度的血清；5、6列为#YZ2391号兔子 1∶100,000梯度稀释血清；7、8列为#YZ2392号兔子1∶1000稀释度的血清；3、 4列为#YZ2392号兔子1∶10,000稀释度的血清；5、6列为#YZ2392号兔子 1∶100,000梯度稀释血清。A、C孔加入预免疫血清；B、D孔加入最终获得的 血清。
图2、SEQIDNO：1(上图)、SEQIDNO：2(下图)分别免疫#YZ2392兔子后 不同稀释度的抗体的滴度(效价)测定结果。
具体实施方式
在本领域人员的实践中经常发现，由于蛋白的抗原决定簇易于被包埋在蛋 白空间结构的内部，因此难以找到一种特异性高的抗体。针对上述技术难题， 为了高效获得检测NGAL肾损伤标志物的特异性抗体，本发明人经过深入的研 究，从全长的NGAL上分别鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决 定簇的短肽混合物作为免疫原，分别获得了特异性抗NGAL的多克隆抗体。本 发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵 敏度高。
本发明中，“分离的多肽”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋 白、脂类、糖类或其它物质，本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯 化该多肽，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主带。
本发明的SEQIDNO：1-2任一所述的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合 成多肽，优选合成多肽。本发明所述的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学 合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
编码所述的多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括 cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
编码本发明的多肽的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成 的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其 是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关 的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。目前，已经可以完全通过 化学合成来得到编码本发明的多肽的DNA序列。
本发明还提供了一种多肽混合物，其由SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所 示氨基酸序列的多肽混合而成。
多肽制备成混合物联合用于作为免疫原进行动物免疫，可获得高效价的抗 体，免疫的效果显著优于单条多肽的免疫。
本发明还提供了可特异性识别NGAL的抗体。这里，“特异性”是指抗体 能识别和结合于NGAL蛋白，但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明更优选多克隆抗体，本发明中，所用的术语“多克隆抗体”(多抗) 指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学 反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的， 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之 为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆 抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它 们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此 外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。
多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。本发明的多肽混 合物，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体 的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。 多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫 方法制得。实施例中采用多肽混合物与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射， 免疫新西兰兔；并进行加强免疫；最终获得高效价的多克隆抗体。
利用本发明的多肽混合物，也可以生产单克隆抗体。此类单克隆抗体可以 利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976； Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier， N.Y.，1981)。
多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还提供了检测样品中是否存在NGAL的方法，是利用本发明制备的 抗NGAL的特异性多克隆抗体进行检测，它包括：将样品与抗NGAL的特异 性多克隆抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品 中存在NGAL。抗NGAL的特异性多克隆抗体用于检测NGAL蛋白，可以用本 领域技术人员熟知的各种按照抗原抗体体外特异性结合的原理设计的方法来 达到，例如蛋白免疫印迹实验，免疫共沉淀实验等。
本发明还提供了一种检测肾损伤试剂盒，其中含有本发明的抗体，较佳地 是多克隆抗体。较佳地，所述的检测试剂盒包括：
固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体，该多克隆抗体由所述的多 肽混合物免疫动物而获得。
所述的固相载体可以是包被板、试纸和/或微球。从而通过免疫检测试纸， 胶体金等技术来进行检测。
此外，所述的检测试剂盒还包括：标记的检测抗体，显色剂，洗涤液，终止 液和/或使用说明书。可根据检测方法的不同来调整这些试剂。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明首次鉴定到了NGAL蛋白序列中的关键抗原决定簇，以含有这 些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得的抗体效价高，识别抗原的 特异性好。
(2)利用短肽来制备多克隆抗体，短肽合成方法简单。
(3)本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特 异性强，灵敏度高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版 社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、特异的NGAL氨基酸片段序列及其产物的混和物作为免疫原
NGAL蛋白的全长氨基酸序列如下：
NGAL蛋白的全长氨基酸(人源，198aa)，序列如下(SEQIDNO：3)：
MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGK
WYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWI
RTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNR
EYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
由于全长序列作为免疫原存在合成难且免疫原性不强的缺点，本发明人根 据以上全长序列，采用常规方法人工合成各种长度的序列片段，以片段作为免 疫原，反复测试各种免疫原的免疫效果。最终，获得了适合的免疫原，其包括 来自NGAL的两个多肽片段，序列(N→C端)如下：
CREDKDPQKMYATIYELKEDKS(SEQIDNO：1)；
CYNQHAMVFFKKVSQNREY(SEQIDNO：2)。
两条多肽片段以质量比1∶1进行混合，获得多肽混合物。以该混合物作 为生产特异性多克隆抗NGAL抗体的特异免疫原。以这两个片段的混和物免疫 动物后，可获得有高效价、高免疫原性(即高抗原性)的特异性多克隆抗体。
实施例2、特异性多克隆抗NGAL抗体的产生
分别以上述实施例1制备的特异性多肽的混和物作为免疫原与血蓝蛋白 (KLH)偶联，免疫新西兰大白兔而产生的免疫血清。动物免疫的方法和程序如 下：
1)免疫两只新西兰雄兔(#YZ2391；#YZ2392)，采集免疫前血清并-20℃存 贮。
2)首次免疫取与血蓝蛋白(KLH)偶联好的免疫原与等量弗氏完全佐剂乳 化抗原(抗原∶弗氏完全佐剂＝1∶1(v/v))，背部多点注射。首次免疫的注射量是400 μg多肽混和物。
3)14天后，用弗氏完全佐剂乳化抗原(抗原∶弗氏完全佐剂＝1∶1(v/v))重 复背部多点注射加强免疫。加强免疫的注射量是400μg多肽混和物。
4)28天后，使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，背部多点 注射加强免疫。
5)42天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
6)70天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
7)77天后，颈动脉采血取血清，-70℃存放。
获取特异性抗体后，进行ELISA以及WESTERNBLOT验证抗体的效价以 及识别抗原的性能。
ELISA方法如下：
采用直接法，将合成多肽包被在96孔酶标板中，加入免疫后血清，对照 为免疫前血清。按照。
材料：
1、包被抗原：将多肽抗原包被在96孔酶标板中，0.1μg/100μl/孔；
其中在酶标板的A、B行微孔中包被SEQIDNO：1多肽；在C、D行微孔中 包被SEQIDNO：2多肽。
2、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体；
3、抗体或酶交联物的稀释：用含0.05％(v/v)吐温20的1×PBS溶液配制 1.0％(v/v)BSA溶液，其中含有正常山羊IgG，浓度为0.1mg/ml；
4、洗脱液：含0.05％(v/v)吐温20的PBS溶液；
5、ABTS底物。
方法：
1、在酶标板每孔加入100μl10倍比稀释的本实施例上述制备的多克隆抗 体，在37℃下孵育30分钟；
2、洗脱：用缓冲液加入96孔酶标板内，300-360μl/孔，3min后，将洗液轻 轻甩出，倒置于纸上拍干，重复二次；
3、每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶2000)，在37℃下 孵育30分钟；
4、洗脱，将洗脱液加入96孔酶标板内，300-360μl/孔，3min后，将洗脱液 轻轻甩出，倒置于纸上拍干，重复二次；
5、每孔加入100μlABTS底物溶液，在室温下孵育10-20分钟；
6、酶标仪分析：在405nm波长下读数。
图1为酶标板上各孔的读数。
ELISA结果显示，所获得的多克隆抗体可以特异性地识别NGAL的两个多 肽片段。图2为SEQIDNO：1(上图)、SEQIDNO：2(下图)分别免疫#YZ2392 兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)实验结果。结果显示，免疫后血清中抗 体滴度均非常高。也即，该多克隆抗体效价可达到1∶100,000。
WESTERNBLOT结果显示，所获得的多克隆抗体可以特异性地结合全长 的NGAL以及NGAL的两个多肽片段。
实施例3、试剂盒
所述的试剂盒包括：
容器1，以及装于容器的前述实施例2制备的多克隆抗体；
容器2，以及装于容器的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG多克隆抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。