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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610019927.9 (22)申请日 2016.01.13 C12N 5/074(2010.01) (71)申请人 河南科技大学第一附属医院 地址 471003 河南省洛阳市涧西区景华路 24 号 (72)发明人 高社干 冯笑山 梁硕 牟红梅 刘刚 原翔 马志坤 孔金玉 (74)专利代理机构 洛阳市凯旋专利事务所 41112 代理人 韩晓静 (54) 发明名称 一种食管上皮干细胞的分离培养方法 (57) 摘要 本发明公开一种食管上皮干细胞的分离培养 方法， 其步骤为 ： 首先， 取食管黏膜组织及附着的 上皮， 去除肌肉组织， 取黏。
2、膜上皮组织的基底层并 剪成碎片， 消化离心， 将获得的细胞铺于包被有基 质的培养瓶、 培养板或培养皿中 ； 然后， 加入添加 有 HEPES、 碳酸氢钠、 L- 谷氨酸、 FBS、 EGF、 胰岛素、 氢化可的松、 霍乱弧菌毒素、 转铁蛋白、 BPE、 类维 生素 A、 细胞信号通路抑制剂的 DMEM/Ham s F-12 培养液 ； 最后， 将含有细胞悬液的培养瓶、 培养板 或培养皿放入37孵箱中培养， 1014天即可形 成单层上皮干细胞。本发明操作简便， 安全性好， 分离得到食管上皮干细胞， 干细胞的活性高， 在组 织工程和再生医学领域应用前景良好。 (51)Int.Cl. (19)中华人。
3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 105505860 A 2016.04.20 CN 105505860 A 1.一种食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其包括以下步骤： 步骤1、 取食管黏膜组织及附着的上皮， 去除肌肉组织， 取黏膜上皮组织的基底层并将 其剪成碎片， 消化离心， 将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、 培养板或培养皿中； 步骤2、 加入添加有1020mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、 25mmol/L碳酸氢 钠、 25mmol/LL-谷氨酸、 体积分数25的胎牛血清、 2030ng/mL人表皮生长因子、 3。
4、 6mg/mL胰岛素、 50150mmol/L氢化可的松、 0.050.2mg/mL霍乱弧菌毒素、 46mg/mL转铁 蛋白、 2040mg/mL牛垂体提取物、 0.010.02mmol/L类维生素A、 825mmol/L细胞信号通 路抑制剂的DMEM/Ham sF-12培养液； 步骤3、 将含有细胞悬液的培养瓶、 培养板或培养皿放入37孵箱中培养， 23天可见 到细胞贴壁， 1014天即可形成单层上皮干细胞。 2.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤1中， 消化 的方法是： 将碎片加入含有0.10.3%胶原酶I型、 0.10.3%链酶蛋白酶和0.51.0mg。
5、/ml 脱氧核糖核酸酶I的Ham sF12-DMEM1/1溶液中， 37恒温消化24h， 离心后过滤， 即得细 胞。 3.根据权利要求2所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其Ham sF12- DMEM1/1溶液中还含有1020mg/ml牛血清蛋白。 4.根据权利要求3所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤1中， 包被 在培养瓶上的基质为胶原酶、 牛血清白蛋白中的一种或两种组合。 5.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤1中， 培养 瓶、 培养板或培养皿包被的方法为： 加入含0.10.5mg/mL牛血清白蛋白和/或3050ug/。
6、mL 胶原酶 的EBSS培养液， 完全覆盖培养瓶、 培养板或培养皿底部即可， 在37恒温孵箱中孵 育12小时， 孵育完后吸弃培养液， 用无菌PBS清洗35次。 6.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤2中的培 养液中添加有1216mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、 34.5mmol/L碳酸氢钠、 3 4.5mmol/LL-谷氨酸、 体积分数24的胎牛血清、 2327ng/mL人表皮生长因子、 4 5.5mg/mL胰岛素、 70130mmol/L氢化可的松、 0.10.18mg/mL霍乱弧菌毒素、 4.55.5mg/ mL转铁蛋白、 2535mg/mL牛。
7、垂体提取物(BPE)、 0.010.02mmol/L类维生素A、 1020mmol/ L细胞信号通路抑制剂。 7.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤2的培养 液中， 细胞信号通路抑制剂含有： 浓度为510mM的ROCKi、 浓度为15mM的TGF- 抑制剂 A83-01、 浓度为15mM的BMP抑制剂DMH1、 浓度为15mM的GSK抑制剂CHIR99021。 8.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其特征是： 其步骤2的培养 液中还含有抗生素， 抗生素为0.250.5mg/mL两性霉素B和200400mg/mL青霉素/链霉素 液。 9.一种。
8、食管上皮干细胞的分离培养液， 其特征是： 其为添加有1020mmol/L4-羟乙基 哌嗪乙硫磺酸缓冲液、 25mmol/L碳酸氢钠、 25mmol/LL-谷氨酸、 体积分数25的胎 牛血清、 2030ng/mL人表皮生长因子 （EGF） 、 36mg/mL胰岛素、 50150mmol/L氢化可的 松、 0.050.2mg/mL霍乱弧菌毒素、 46mg/mL转铁蛋白、 2040mg/mL牛垂体提取物、 0.01 0.02mmol/L类维生素A、 825mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham sF-12培养液。 权利要求书 1/2 页 2 CN 105505860 A 2 10.根据权利。
9、要求9所述的食管上皮干细胞的分离培养液， 其特征是： 其还含有抗生素， 抗生素为0.250.5mg/mL两性霉素B和200400mg/mL青霉素/链霉素液。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105505860 A 3 一种食管上皮干细胞的分离培养方法 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学技术领域， 涉及干细胞分离培养技术， 尤其是涉及一种食 管上皮干细胞的分离培养方法。 背景技术 0002 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。 在一定条件下， 它可以分化成多 种功能细胞。 根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ESCs) 和成体干细胞(Adu。
10、ltStemCells,ASCs)。 胚胎干细胞的增殖与分化是构成个体发育的基 础， 由单个的受精卵发育成具备各种组织器官的个体； 而成体干细胞可进一步分化为复杂 的组织器官， 其研究几乎涉及所有的生命科学和生物医药领域， 具有光明的发展前景。 根据 干细胞的发育潜能分为三类： 全能干细胞、 多能干细胞和单能干细胞。 干细胞(StemCell) 是一种未充分分化， 尚不成熟的细胞， 具有再生各种组织器官和人体的潜在功能， 医学界称 为 “万用细胞” 。 干细胞是机体生长和发育的起源细胞， 具有持久自我更新、 高度增殖分裂、 多向分化潜能和对疾病损伤具有反应能力的细胞群体。 由于其独特的生物学特。
11、性和功能， 使之成为生命科学和生物医药领域最引人注目的研究热点之一。 0003 食管的黏膜上皮是由一群复杂而有高度组织化的未角化复层扁平上皮排列而成。 食管上皮可分为两个带： 一是基底带， 包括几层小的嗜碱性细胞， 另一是分化带， 包括多层 规则排列的分化的鳞状上皮。 基底带中贴紧基底膜的一层细胞称为基底层， 覆盖其上的数 层称上皮基底层。 在解剖学上基底层可以进一步的分为两种成分： 一种是扁平的称乳头间 基底层 （theinterpapillarybasallayer， IBL） ， 另一种是覆盖在乳头表面的， 称乳头基 底层 （thepapillarybasallayer， PBL） 。 。
12、只有基底带的细胞才有分化能力， 并且这种分化 是以细胞从基底层移向食管腔面完成的， 细胞的迁移、 分化起始与分化标志物的表达结果 有关。 相对于IBL， PBL中的细胞分裂是比较均匀的， 可产生2个子细胞紧贴基底膜， 相反地， 在IBL中细胞分裂本质上是不均匀的， 其细胞分裂主要发生于基底膜的右角， 产生一个停留 于基底层的子细胞及一个进入基底上层的子细胞。 因此， IBL中的细胞就相当于食管上皮干 细胞。 0004 研究表明， 人食管上皮细胞的原代培养方法研究较多， 但目前未有研究食管上皮 干细胞分离培养方法的报道。 食管上皮干细胞具有旺盛的增殖分化能力， 在维持食管粘膜 屏障结构、 功能的。
13、完整性、 以及食管粘膜的损伤修复中起着至关重要的作用。 而食管干细胞 培养方法的建立， 对于研究食管粘膜的增生与分化细胞以及食管肿瘤的发生发展具有重要 的意义。 发明内容 0005 为解决上述问题， 本发明的目的是提供一种食管上皮干细胞的分离培养方法。 0006 为实现上述发明目的， 本发明采用如下技术方案： 一种食管上皮干细胞的分离培养方法， 其包括以下步骤： 说明书 1/6 页 4 CN 105505860 A 4 步骤1、 取食管黏膜组织及附着的上皮， 去除肌肉组织， 取黏膜上皮组织的基底层并将 其剪成碎片， 消化离心， 将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、 培养板或培养皿中； 步骤2、。
14、 加入添加有1020mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液 （HEPES） 、 25mmol/L 碳酸氢钠、 25mmol/LL-谷氨酸、 体积分数25的胎牛血清 （FBS） 、 2030ng/mL人表皮 生长因子 （EGF） 、 36mg/mL胰岛素、 50150mmol/L氢化可的松、 0.050.2mg/mL霍乱弧菌 毒素、 46mg/mL转铁蛋白、 2040mg/mL牛垂体提取物(BPE)、 0.010.02mmol/L类维生素 A、 825mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham sF-12培养液； 步骤3、 将含有细胞悬液的培养瓶、 培养板或培养皿放入37孵箱中培养， 2。
15、3天可见 到细胞贴壁， 之后隔天更换一次培养液以去除杂质细胞的影响， 1014天即可形成单层上 皮干细胞。 0007 上述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其步骤1中， 消化的方法是： 将碎片加入 含有0.10.3%胶原酶I型、 0.10.3%链酶蛋白酶和0.51.0mg/ml脱氧核糖核酸酶I的 Ham sF12-DMEM1/1溶液中， 37恒温消化24h， 离心后过滤， 即得细胞。 0008 进一步地， 上述的Ham sF12-DMEM1/1溶液中， 还含有1020mg/ml牛血清蛋白 （BSA） ， 以保护细胞免受机械和酶作用的损伤， 还有去毒化的作用。 0009 上述的食管上皮干细胞的分。
16、离培养方法， 其步骤1中， 包被在培养瓶上的基质为胶 原酶、 牛血清白蛋白中的一种或两种组合。 0010 上述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其步骤1中， 培养瓶、 培养板或培养皿包 被的方法为： 加入含0.10.5mg/mL牛血清白蛋白 （BSA） 和/或3050ug/mL胶原酶 的 EBSS培养液， 完全覆盖培养瓶、 培养板或培养皿底部即可， 在37恒温孵箱中孵育12小 时， 孵育完后吸弃培养液， 用无菌PBS清洗35次。 由于包被的基质中含有胶原酶和蛋白等 成分， 能促进干细胞较快地贴壁和生长。 0011 上述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其步骤2的培养液中， 细胞信号通路抑制 剂。
17、含有： 浓度为510mM的ROCKi、 浓度为15mM的TGF- 抑制剂A83-01、 浓度为15mM 的BMP抑制剂DMH1、 浓度为15mM的GSK抑制剂CHIR99021。 0012 上述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其步骤2的培养液中还含有抗生素， 抗生 素为0.250.5mg/mL两性霉素B和200400mg/mL青霉素/链霉素液。 0013 上述的食管上皮干细胞的分离培养方法， 其步骤2中的培养液中添加有12 16mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液 （HEPES） 、 34.5mmol/L碳酸氢钠、 34.5mmol/L L-谷氨酸、 体积分数24的胎牛血清 （FBS） 。
18、、 2327ng/mL人表皮生长因子 （EGF） 、 4 5.5mg/mL胰岛素、 70130mmol/L氢化可的松、 0.10.18mg/mL霍乱弧菌毒素、 4.55.5mg/ mL转铁蛋白、 2535mg/mL牛垂体提取物(BPE)、 0.010.02mmol/L类维生素A、 1020mmol/ L细胞信号通路抑制剂。 0014 一种食管上皮干细胞的分离培养液， 其为添加有1020mmol/L4-羟乙基哌嗪乙 硫磺酸缓冲液 （HEPES） 、 25mmol/L碳酸氢钠、 25mmol/LL-谷氨酸、 体积分数25的胎 牛血清 （FBS） 、 2030ng/mL人表皮生长因子、 36mg/m。
19、L胰岛素、 50150mmol/L氢化可的 松、 0.050.2mg/mL霍乱弧菌毒素、 46mg/mL转铁蛋白、 2040mg/mL牛垂体提取物(BPE)、 0.010.02mmol/L类维生素A、 825mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham sF-12培养 液。 说明书 2/6 页 5 CN 105505860 A 5 0015 上述的食管上皮干细胞的分离培养液中， 细胞信号通路抑制剂含有： 浓度为5 10mM的ROCKi、 浓度为15mM的TGF- 抑制剂A83-01、 浓度为15mM的BMP抑制剂DMH1、 浓 度为15mM的GSK抑制剂CHIR99021。 0016 上述。
20、的食管上皮干细胞的分离培养液中， 其还含有抗生素， 抗生素为0 .25 0.5mg/mL两性霉素B和200400mg/mL青霉素/链霉素液。 0017 由于采用如上所述的技术方案， 本发明具有如下优越性： 由于人食管上皮组织分离获得的干细胞数量较少， 易分化和凋亡亦将导致细胞死亡， 因此食管干细胞原代培养较难获得成功。 本发明通过对细胞信号通路抑制剂和培养液的成 分及用量的合理选择和配合， 分离培养得到了原代食管干细胞， 培养液利用微量成分相辅 相成、 综合作用， 具有促进干细胞增殖和分裂， 利于细胞贴附及抑制间质细胞的干扰， 细胞 信号通路抑制剂能够促进干细胞增殖， 抑制多向分化潜能， 延续。
21、细胞活性， 稳定遗传。 0018 本发明的分离方法， 其操作简便， 安全性好， 分离得到食管上皮干细胞， 干细胞的 活性高， 在组织工程和再生医学领域应用前景良好。 附图说明 0019 图1是人体正常食管干细胞成功培养的细胞形态和生物标记的鉴定； 图中， A为人 体正常食管上皮干细胞在P12的明视野图像， 左侧是100 x放大， 右侧是200 x放大， 左、 右侧的 scalebar分别为100mM和50mM； B为人体正常食管上皮干细胞 （P12)的荧光免疫图片， 分别 显示了表达P63、 SOX2、 CK5等常规食管干细胞的表达因子， scalebar为50mM； 图2是小鼠正常食管干细胞。
22、成功培养的细胞形态和biomarker的鉴定； 图中， A为小鼠正 常食管干细胞在P2和P20的明视野图像， scalebar为100mM； B为小鼠正常干细胞 （P12)的荧 光免疫图片， 分别显示表达P63、 SOX2、 CK5常规食管干细胞的表达因子， scalebar为50mM； 图3是多次传代后小鼠正常食管干细胞的分化功能鉴定； 图中， A为分化组织的H&E图 片； B为荧光免疫图片， 显示了分化组织具有正常的生物分化标记P63和CK13， scalebar为 20mM。 具体实施方式 0020 参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明； 但是， 以下实施例仅仅是例证， 本发明并不。
23、局限于这些实施例。 0021 实施例1 人食管上皮干细胞的分离培养与鉴定 1.1分离培养 (1)、 取材： 无菌条件下切除69岁男性的弃置的食管正常上皮组织， 置于内含青霉素l00 ug/mL和链霉素100ug/mL的磷酸盐缓冲生理盐水 （PBS） /生理盐水溶液的无菌管内， 立即 带回实验室； (2)、 分离： 用含200 g/mL青霉素/链霉素的PBS冲洗食管上皮组织35遍， 并去除出 血组织、 坏死组织及纤维血管组织； 在超净工作台下， 用无菌眼科剪、 眼科镊将组织修剪成 0.51mm3的小块， 而后加入含有0.1%胶原酶I型、 0.1%链霉蛋白酶和0.5mg/ml脱氧核糖核 酸酶I的消。
24、化液的离心管中， 再将离心管放入37培养箱恒温消化2h， 之后消化混合液通过 说明书 3/6 页 6 CN 105505860 A 6 200目细胞筛过滤后离心， 1000rpm离心5min后弃上清， 收集细胞沉淀。 0022 (3)、 将细胞铺于包被过的培养瓶/培养皿中， 培养瓶/培养皿在使用前先用含 0.1mg/mLBSA和30ug/mL胶原酶 的EBSS培养液包被2.5小时， 吸弃培养液， 无菌PBS清洗3 次。 0023 (4)、 并添加含有15mmol/LHEPES、 3.6mmol/L碳酸氢钠、 4mmol/LL-谷氨酸、 体 积分数2的FBS、 20ng/mLEGF、 3mg/m。
25、L胰岛素、 60mmol/L氢化可的松、 0.1mg/mL霍乱弧菌 毒素、 4mg/mL转铁蛋白、 20mg/mLBPE、 0.01mmol/L类维生素A、 5mmol/L的ROCKi、 1mmol/L的 TGF- 抑制剂A83-01、 2mmol/L的BMP抑制剂DMH1、 1mmol/L的GSK抑制剂CHIR99021的DMEM/ Ham sF-12培养液。 0024 (5)、 将含有细胞悬液的培养瓶/培养皿放入37孵箱中培养， 每天观察细胞生长 情况， 并拍照记录， 通常干细胞23天即可贴壁， 1014天可形成单层上皮干细胞。 0025 (6)、 以后每天观察细胞生长情况和培养液的颜色变。
26、化， 同时观察培养液是否有污 染， 每23天换液一次， 以满足细胞生长所需的营养。 0026 1.2鉴定： 对分离培养得到的干细胞进行鉴定： 包括形态学鉴定和功能鉴定。 0027 (1)、 形态学鉴定 在倒置显微镜下观察细胞的形态结构。 0028 (2)、 免疫荧光鉴定干细胞Biomarker 制备细胞爬片， 细胞长满至7080融合时取出， 用4多聚甲醛固定20min， 然后用 含0.3TritonX-100的PBS透化10min， 并用含有5牛血清白蛋白的PBS溶液中止反应， 然 后在4一抗过夜， PBS洗涤3次后， 在室温下细胞孵育二抗1h。 细胞核用DAPI染色。 0029 实验中使用的。
27、抗体如下： 山羊抗Sox2多克隆抗体(R&D公司)， 兔抗P63多克隆抗 体(Genetex公司)， 鼠抗P63多克隆抗体(SantaCruz公司)， 兔抗CK5多克隆抗体(abcam 公司)， 鼠抗CK5单克隆抗体(DAKO公司)， 鼠抗CK13单克隆抗体(Thermo公司)， 用奥林巴斯 ix81倒置荧光显微镜观察记录。 0030 2.实验结果 (1)、 细胞形态观察所示： 人体正常食管干细胞从无任何病变的食管组织中提取， 细胞在含有细胞信号通路抑制 剂的培养液中传代培养， 细胞传代比例为1： 10。 0031 如图1中的A图片所示， 人体正常食管干细胞在P12的明视野图像， 左侧是100。
28、 x放 大， 右侧是200 x放大。 在倒置相差显微镜下， 贴壁细胞呈细小梭形状， 即典型的上皮细胞形 态。 0032 (2)、 免疫荧光结果显示： 如图1中的B图片所示， 人体正常食管干细胞 （P12)的免疫荧光图片， 图片显示本发 明分离得到的细胞表达P63、 SOX2常规食管干细胞的标记物。 0033 实验结果说明， 本发明的分离培养方法可以分离培养得到的是正常食管干细胞。 0034 实施例2 小鼠食管上皮干细胞的分离培养与鉴定 1.细胞分离培养 说明书 4/6 页 7 CN 105505860 A 7 所有的动物研究完全按照实验级动物标准执行。 从小白鼠取出正常食管组织， 用含有 抗生。
29、素的PBS冲洗3次。 无菌条件下， 用无菌眼科剪、 眼科镊将食管组织中的出血组织和坏 死组织去除， 并剪碎成0.51mm3的小块， 而后加入含有0.1%链霉蛋白酶和0.5mg/ml脱氧 核糖核酸酶I的消化液的离心管中。 37恒温消化3h， 过滤离心， 收集细胞沉淀。 0035 将细胞用培养液重悬置于铺有包被溶液的培养瓶/培养皿中卧式培养， 培养瓶/培 养皿在使用前先用含0.3mg/mLBSA和40ug/mL胶原酶 的EBSS培养液包被2小时， 吸弃培养 液， 无菌PBS清洗5次。 0036 添加含有20mmol/LHEPES、 4.5mmol/L碳酸氢钠、 5mmol/LL-谷氨酸、 体积分数。
30、 5的FBS、 25ng/mLEGF、 5mg/mL胰岛素、 100mmol/L氢化可的松、 0.15mg/mL霍乱弧菌毒素、 6mg/mL转铁蛋白、 30mg/mLBPE、 0.02mmol/L类维生素A、 5mmol/L的ROCKi、 1mmol/L的TGF- 抑制剂A83-01、 1mmol/L的BMP抑制剂DMH1、 1mmol/L的GSK抑制剂CHIR99021的DMEM/Ham s F-12培养液。 0037 将含有细胞悬液的培养瓶/培养皿放入37孵箱中培养， 每天观察细胞生长情况， 并拍照记录， 通常干细胞23天即可贴壁， 1014天可形成单层上皮干细胞。 干细胞长满瓶 壁， 胰。
31、酶消化离心按照1:10的比例传代。 0038 对分离培养得到的干细胞进行鉴定： 包括形态学鉴定和功能鉴定。 0039 2、 检测 2.1形态学和免疫荧光检测 (1)、 形态学观察 在荧光倒置显微镜下观察不同代数食管干细胞的形态结构。 0040 (2)、 免疫荧光鉴定干细胞生物标志物 用4多聚甲醛固定20min， 然后用含0.3TritonX-100的PBS透化10min， 并用含5牛 血清白蛋白的PBS溶液中止反应， 然后在4下过夜温育初级抗体， 在PBS中洗涤3次后， 细胞 与二次抗体在室温下孵育1小时。 细胞核都经DAPI染色。 0041 实验中使用的抗体如下： 山羊抗Sox2多克隆抗体(。
32、R&D公司)， 兔抗P63多克隆抗 体(Genetex公司)， 鼠抗P63多克隆抗体(SantaCruz公司)， 兔抗CK5多克隆抗体(abcam 公司)， 鼠抗CK5单克隆抗体(DAKO公司)， 鼠抗CK13单克隆抗体(Thermo公司)， 用奥林巴 斯ix81倒置荧光显微镜观察和拍照。 0042 (3)、 Transwell实验鉴定干细胞的分化功能 用含0.1mg/mLBSA和30ug/mL胶原酶 的EBSS培养液和2%GrowthFactorReduced （GFR） Matrigel基底膜基质混合液过夜包被0.4mMTranswell膜。 第二天去除包被液， 并将 Transwell膜。
33、晾干。 将消化后的食管上皮干细胞以6000cells/mm2的密度铺于膜， 在细胞 贴壁12h后， 移除多余细胞， 剩余的细胞用完全Pneumacult-ALI培养液进行预处理， 并充满 上下小室。 第二天ALI培养液仅仅加在下层小室用于启动气道液体接口， 然后每天换液直到 出现分化。 为了标记分化markers， 在室温下用4%PFA固定细胞10min， 然后用PBS+0.2% Triton冲洗和透化。 细胞膜是用全量染色或在OCT下用47mm冷冻/石蜡块包埋。 0043 3、 结果： (1)、 细胞培养形态学观察结果： 小鼠正常食管干细胞从B57-C6小鼠中分离提取并在含有细胞信号通路抑制。
34、剂的培养 说明书 5/6 页 8 CN 105505860 A 8 液中传代培养， 细胞传代比例为1： 10。 0044 如图2中的A图片所示， 小鼠正常食管干细胞在P2和P20的明视野图像。 贴壁细胞 呈细小梭形状， 为典型的上皮细胞形态。 以集落生长， 可正常生长至P20代， 这说明食管干细 胞的增殖能力很强。 0045 (2)、 免疫荧光结果显示： 如图2中的B图片所示， 小鼠正常食管干细胞 （P12)的免疫荧光图片， 显示其表达常规食 管干细胞markerP63、 SOX2、 CK5。 0046 (3)、 Transwell实验结果显示： 如图3中的A图片所示： 小鼠正常干细胞 （P1。
35、2)分化组织的H&E图片； 如图3中的B图片所 示： 荧光免疫颜色显示分化组织具有正常的分化biomarkerP63、 SOX2、 CK5。 这说明传代培 养的小鼠食管干细胞具有正常的分化功能。 在体外适当的分化方法和条件下， 能够产生类 似于体内食管组织相似的3维结构。 0047 实验结果证明， 本发明分离培养的细胞具有上皮细胞形态， 并表达干细胞标记物， 在体外适当的分化方法和条件下， 能够向食管组织结构分化。 证实了本发明方法可分离培 养得到的是正常食管干细胞， 无论是人还是小鼠等物种都可以通过此法获得正常食管干细 胞。 0048 以上所述仅为本发明的较佳实施方式， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神 和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 9 CN 105505860 A 9 图1 说明书附图 1/3 页 10 CN 105505860 A 10 图2 说明书附图 2/3 页 11 CN 105505860 A 11 图3 说明书附图 3/3 页 12 CN 105505860 A 12 。