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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610091777.2 (22)申请日 2016.02.19 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (71)申请人 彭冬青 地址 050011 河北省石家庄市裕华区槐北路 19 号 (72)发明人 彭冬青 (54) 发明名称 一种番茄黄曲叶病毒 LAMP 检测试剂盒及检 测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种番茄黄曲叶病毒 (Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)LAMP 检测试剂 盒， 其包括特异性引物、 反应缓冲液、 B。
2、st DNA 聚 合酶和核酸染料。本发明还涉及番茄黄曲叶病毒 LAMP检测方法。 使用本发明的LAMP检测试剂盒及 检测方法能够对番茄黄曲叶病毒进行快速、 高效、 简便的分子生物学检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 CN 105525042 A 2016.04.27 CN 105525042 A 1.一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒， 包括特异性引物、 反应缓冲液、 BstDNA聚合 酶和核酸染料。 2.根据权利要求1所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒， 其中所述引物的核苷酸序 列如下所示:。
3、 外引物F3： TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQIDNO:1) 外引物B3： GCATGCGTACATGCCATA(SEQIDNO:2) 内引物FIP： CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGATGAGGAAATTTCATG(SEQIDNO:3) 内引物BIP： ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAACAAGGCGTTTTCAGT(SEQIDNO:4)。 3.根据权利要求1所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒， 其中所述反应缓冲液由 10mMdNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 5mM甜菜碱和50mMMgSO4组成。
4、。 4.根据权利要求1所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒， 其中所述核酸染料为SYBR GreenI。 5.根据权利要求1-3任一项所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒， 其进一步包括DNA 提取试剂以及阳性对照和阴性对照。 6.一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法， 其包括以下步骤： (1)提取待测样品DNA： 向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液， 按照常规CTAB法提取DNA； (2)设计并合成引物； (3)建立LAMP反应体系： 在PCR管中制备25 l的LAMP反应体系， 其包括5pmol/ l的外引 物F31 l、 5pmol/ l的外引物B31 l、 40pmol/ l的内引物。
5、FIP1 l、 40pmol/ l的内引物BIP1 l、 反应缓冲液2.5 l、 8UBstDNA聚合酶1 l、 模板DNA2 l， 加水补充至25 l， 并以番茄黄 曲叶病毒基因组DNA作为阳性对照， 以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为阴性对照； (4)LAMP反应： 将步骤(3)中PCR管于63恒温反应60min； (5)结果判读： 在反应产物中加入核酸染料， 如反应液为橙色， 表示结果为阴性， 绿色表 示结果为阳性。 7.根据权利要求6所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法， 所述引物的核苷酸序列如下 所示: 外引物F3： TGAAGAATGATTTGCGGGAT。
6、A(SEQIDNO:1) 外引物B3： GCATGCGTACATGCCATA(SEQIDNO:2) 内引物FIP： CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGATGAGGAAATTTCATG(SEQIDNO:3) 内引物BIP： ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAACAAGGCGTTTTCAGT(SEQIDNO:4)。 8.根据权利要求6所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法， 其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 5mM甜菜碱和50mMMgSO4组成。 9.根据权利要求6所述的番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法。
7、， 其中所述核酸染料为SYBR GreenI。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105525042 A 2 一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物检测领域， 具体地说， 本发明涉及一种番茄黄曲叶病毒LAMP检 测试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 番茄是常见的可食用植物， 其营养丰富、 风味特别， 具有减肥瘦身、 消除疲劳、 增进 食欲、 促进蛋白质消化等功效， 原产南美洲， 在我国广泛栽培。 然而， 1964年Cohen等首次报 道了在以色列发生的番茄黄曲叶病毒病。 在之后的几十年间， 该病迅速地扩散到中东、 地中 海沿岸、 东亚、 南亚、。
8、 非洲、 欧洲、 美国、 中美洲、 澳大利亚等众多国家和地区。 2002年传入我 国南部省份， 首先在广西大面积暴发,同年传入江浙一带,随后在各个省份相继发现、 连续 暴发， 给我国的番茄生产造成重大损失。 0003 番茄黄曲叶病毒病的病原体是番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurl virus,TYLCV)， 是对番茄产量影响最严重的病害之一， 主要由烟粉虱传播。 番茄植株感染该 病毒后,最典型的症状是病株生长迟缓或停滞， 节间变短， 严重矮化， 枝条直立丛簇， 叶片明 显变小、 增厚、 皱缩， 叶质脆硬， 向上卷曲呈杯、 盘状， 植株顶部形似菜花； 病叶边缘至叶脉区 域黄化。
9、， 植株上部叶片症状尤其明显； 大部分花穗凋萎， 结果稀少， 果实变小， 膨大速度慢， 成熟期的果实不能正常转色。 番茄在开花以前遭受TYLCV侵染， 危害极其严重， 果实产量和 商品价值均大幅度下降,严重时造成的损失可达100。 0004 番茄黄曲叶病毒病的症状并不是一成不变的， 而是随着病毒株系、 番茄品种、 植株 年龄以及侵染时间的不同而改变， 难以鉴别。 此外， 番茄病毒病的种类很多， 经常是多种病 毒同时发生， 如黄瓜花叶病毒(CMV)、 番茄花叶病毒(ToMV)等， 构成混合侵染， 因此田间症状 往往十分复杂， 不易辨认。 目前检测番茄黄曲叶病毒多使用血清学测定或PCR法， 然而这。
10、两 种方法均存在不足： 前者须制作抗血清， 非特异反应多， 易产生假阳性或假阴性结果， 而PCR 灵敏度和特异性不高， 导致检测结果的准确性较低。 因此， 有必要开发一种快速、 准确的 TYLCV检测方法， 以满足产业需求。 0005 环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH, YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplification ofDN。
11、A.NucleicAcidsRes.2000Jun15； 28(12):E63)。 该技术不仅能够在恒温条件下对 目的序列进行快速扩增， 且与常规PCR相比， 无需高端的仪器设备， 可以通过在扩增产物中 加入荧光染料进行直接判断或者通过观察扩增曲线变化判断扩增结果， 因此具有特异性 强、 灵敏度高、 易于判读、 可定性定量等优势。 目前LAMP技术已经应用于多种动植物病毒的 快速检测， 并随着该技术的成熟， 使用范围也越来越广。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法。 说明书 1/4 页 3 CN 105525042 A 3 0007 为了实现。
12、本发明的目的， 在一个方面中， 本发明提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检 测试剂盒， 其包括特异性引物、 反应缓冲液、 BstDNA聚合酶和核酸染料， 其中所述引物的核 苷酸序列如下所示: 0008 外引物F3： TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQIDNO:1) 0009 外引物B3： GCATGCGTACATGCCATA(SEQIDNO:2) 0010 内引物FIP： CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA 0011 TGAGGAAATTTCATG(SEQIDNO:3) 0012 内引物BIP： ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CA。
13、ATAA 0013 CAAGGCGTTTTCAGT(SEQIDNO:4)。 0014 优选地， 所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/ l， 所述内引物FIP和所 述内引物BIP的浓度均为40pmol/ l。 0015 优选地， 所述反应缓冲液由10mMdNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 5mM甜菜碱和 50mMMgSO4组成。 0016 优选地， 所述核酸染料为SYBRGreenI。 0017 优选地， 所述番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性 对照和阴性对照。 0018 在另一个方面中， 本发明还提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法，。
14、 其包括以下 步骤： 0019 (1)提取待测样品DNA： 向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液， 按照常规CTAB法提取 DNA； 0020 (2)设计并合成引物， 其中所述引物的核苷酸序列如下所示: 0021 外引物F3： TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQIDNO:1) 0022 外引物B3： GCATGCGTACATGCCATA(SEQIDNO:2) 0023 内引物FIP： CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA 0024 TGAGGAAATTTCATG(SEQIDNO:3) 0025 内引物BIP： ACGTAACTTATAATCATCAGG。
15、AGGC-CAATAA 0026 CAAGGCGTTTTCAGT(SEQIDNO:4)； 0027 (3)建立LAMP反应体系： 在PCR管中制备25 l的LAMP反应体系， 其包括5pmol/ l的 外引物F31 l、 5pmol/ l的外引物B31 l、 40pmol/ l的内引物FIP1 l、 40pmol/ l的内引 物BIP1 l、 反应缓冲液2.5 l、 8UBstDNA聚合酶1 l、 模板DNA2 l， 加水补充至25 l， 并以 番茄黄曲叶病毒基因组DNA作为阳性对照， 以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为阴性 对照； 0028 (4)LAMP反应： 将。
16、步骤(3)中PCR管于63恒温反应60min； 0029 (5)结果判读： 在反应产物中加入核酸染料， 如反应液为橙色， 表示结果为阴性， 绿 色表示结果为阳性。 0030 优选地， 所述反应缓冲液由10mMdNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 5mM甜菜碱和 50mMMgSO4组成。 0031 优选地， 所述核酸染料为SYBRGreenI。 0032 本发明的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法针对病毒保守区域设计， 获 说明书 2/4 页 4 CN 105525042 A 4 得特异性和灵敏度高的四条引物， 假阳性率低； 扩增在30-60min内即可完成， 快速、 高效且 。
17、产率高； 通过肉眼观察颜色变化即可判定结果， 无需高端的仪器设备以及繁锁的电泳和紫 外观察等步骤， 鉴定简便， 较传统的PCR检测方法优势显著。 具体实施方式 0033 以下实施例用于说明本发明， 但不用于限制本发明的范围。 0034 实施例1本发明的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒的制备 0035 1.1试剂 0036 引物由天根生化科技(北京)有限公司合成； BstDNA聚合酶和10ThermoPol反应 缓冲液购自NEB； SYBRGreenI购自Invitrogen； 其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需 的试剂购自Sigma。 0037 1.2试剂盒的制备： 0038 试剂盒中。
18、所包含试剂如下： 0039 反应缓冲液， 配制如下： 10mMdNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 5mM甜菜碱、 50mM MgSO4； 0040 引物： 外引物F3， 浓度为5pmol/ l， 其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3， 浓度为5pmol/ l， 其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 内引物FIP， 浓度为40pmol/ l， 其核苷 酸序列如SEQIDNO:3所示， 内引物BIP， 浓度为40pmol/ l， 其核苷酸序列如SEQIDNO:4所 示； 0041 8U的BstDNA聚合酶； 0042 核酸染料： 1000SYBRGreenI； 0043。
19、 CTAB抽提缓冲液， 配制如下： 100mMTris-HClpH8.0、 50mMEDTA、 1MNaCl、 1 (v/v) -巯基乙醇、 2CTAB， pH值7.0-7.5； 0044 阳性对照： 番茄黄曲叶病毒基因组DNA； 0045 阴性对照： 100mMTris-HCl(pH8.0)和50mMEDTA。 0046 实施例2番茄黄曲叶病毒的检测 0047 2.1LAMP特异性检测 0048 待测样品包括从河北省农林科学院植物保护研究所获得的4株番茄黄曲叶病毒以 及黄瓜花叶病毒、 番茄花叶病毒、 番茄斑驳病毒和烟草蚀纹病毒各1株。 0049 使用实施例1制备的检测试剂盒按照以下步骤对番茄。
20、黄曲叶病毒进行检测： 0050 (1)向待测样品中加入50 lCTAB抽提缓冲液， 按照常规CTAB法提取DNA； ； 0051 (2)建立LAMP反应体系： 在PCR管中制备25 l反应体系， 其中四种引物各1 l、 反应 缓冲液2.5 l、 8UBstDNA聚合酶1 l、 步骤(1)所得模板DNA2 l， 加水补充至25 l， 以番茄 黄曲叶病毒基因组DNA作为阳性对照， 以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为阴性对 照； 0052 (3)LAMP反应： 将PCR管于63恒温反应60min； 0053 (4)结果判读： 在反应产物中加入荧光染料SYBRGreenI， 。
21、如反应液颜色为橙色， 表示结果为阴性， 绿色表示结果为阳性。 0054 2.2检测结果 说明书 3/4 页 5 CN 105525042 A 5 0055 4株番茄黄曲叶病毒的PCR管中均呈现绿色， 而对照病毒株黄瓜花叶病毒、 番茄花 叶病毒、 番茄斑驳病毒和烟草蚀纹病毒的显色结果均为橙色， 表明引物不能扩增出其他几 种常见的番茄易感染病毒， 具有很强的特异性。 0056 实施例3番茄黄曲叶病毒的灵敏度检测 0057 3.1LAMP灵敏度检测 0058 按照2.1的步骤(1)提取番茄黄曲叶病毒DNA， 并系列稀释为100ng、 10ng、 1ng、 100pg、 10pg、 1pg、 100fg7个梯度。 0059 按照2.1的步骤(2)-(4)进行LAMP反应和结果分析。 0060 3.2检测结果 0061 除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外， 其余浓度的PCR管中均呈现绿色， 表 明本发明的LAMP检测方法的最低检测极限达到1pgDNA， 灵敏度很高。 说明书 4/4 页 6 CN 105525042 A 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 105525042 A 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 105525042 A 8 。