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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610038100.2 (22)申请日 2016.01.20 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) C25D 5/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 山东科技大学 地址 266590 山东省青岛市经济技术开发区 前湾港路 579 号山东科技大学 (72)发明人 李慧娟 孙云鹏 丁瑞 葛圣松 崔志芳 朱孔福 李誉琦 (74)专利代理机构 济南鼎信专利商标代理事务 所 ( 普通合伙 ) 37245 代理人 曹玉琳 (54) 发明名称 一株产生物表面活性剂的不。
2、动杆菌株及其应 用 (57) 摘要 本发明提供一株产生物表面活性剂的不动杆 菌株及其应用， 该菌株从石油污染地采用富集培 养、 稀释涂布、 筛选、 纯化得到， 经鉴定为不动杆菌 属。本发明公开了筛选该菌株的富集培养基、 发 酵培养基， 并对该菌株产生的生物表面活性剂的 特性进行了分析。本发明中培养基所用的碳源为 提取乳酪后剩下的下脚料乳清粉， 价格低廉， 成本 低 ； 菌株繁殖快， 代谢快， 代谢生成的生物表面活 性剂作为生物除油剂， 其在常温下即发挥作用， 产 品环保、 无毒无污染、 生物降解性好， 避免了传统 化学法除油所需的高温强碱环境， 降低了能耗和 操作危险系数， 避免二次环境污染 。
3、； 性能稳定， 具 有良好的工业应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105505830 A 2016.04.20 CN 105505830 A 1.一株产生物表面活性剂的不动杆菌株(Acinetobactersp.XH-2)， 其特征在于： 能够 产生生物表面活性剂， 并提交中国普通微生物菌种保藏管理中心进行了菌种保藏。 2.根据权利要求1所述的一株产生物表面活性剂的不动杆菌株， 其特征在于： 所述菌株 的筛选方法为： 从被石油污染的土壤中采样， 称取5g土样在50mL富集培养基中， 所述富。
4、集培 养基(w/v， )为： 氯化镁2、 磷酸氢二钾6、 磷酸二氢钾3.8、 三氯化铁0.5、 氯化铵10， 附加防 腐油作为唯一碳源； 取出1mL培养液再转接至富集培养基中， 转接3次后， 稀释涂布在血平板 上， 对有透明圈的菌株在LB固体培养基上进行划线纯化。 3.利用权利要求1所述的一株产生物表面活性剂的不动杆菌株生产生物表面活性剂的 方法， 其特征在于： 从LB固体平板上挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中， 活化12h后， 转接到发酵培养基中， 接种量4， 发酵培养基(w/v， )为： 乳清粉0.1、 硝酸钠0.1、 磷酸二 氢钾0.2、 磷酸氢二钠0.6、 六水氯化镁0.02、。
5、 氯化钠2、 微量元素1mL/L、 Tween801、 pH为6， 蒸 馏水配制， 摇床转速为160rpm， 温度设为30， 培养2d， 于4、 10000rpm离心20min， 取上清 液用6mol/LHCl调整pH至2.0， 用等体积的乙酸乙酯溶液萃取2次后， 合并有机相于旋转蒸 发仪上浓缩， 将浓缩液倒入烧杯中， 待自然挥发后即得表面活性剂的粗品。 4.根据权利要求3所述方法获得生物表面活性剂。 5.根据权利要求4所述的生物表面活性剂在金属镀层前除油中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505830 A 2 一株产生物表面活性剂的不动杆菌株及其应用 技术领域 0001 本发。
6、明涉及生物技术领域的不动杆菌的应用， 具体涉及一株产生物表面活性剂的 不动杆菌株及其应用。 背景技术 0002 生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌出的一类含有亲水基团(如氨基酸或 多肽、 二糖、 寡糖或多糖等)和亲脂基团(如饱和或非饱和的脂肪醇或脂肪酸等)的两亲化合 物。 生物表面活性剂除了具有化学表面活性剂的特点以外， 还具有如下特点： (1)在油-水界 面有较高的表面活性； (2)无毒、 安全、 易生物降解、 环境友好； (3)具有很强的油脂乳化能 力； (4)反应产物可引进新类型的化学基团， 其中有些基团是化学方法难以合成的， 分子结 构类型多样； (5)在常温、 常压条件下就可应用。
7、生物表面活性剂； (6)发酵菌株生产生物表面 活性剂的原料在自然界广泛存在且价廉， 是典型的 “绿色” 工艺。 0003 生物表面活性剂主要包括糖脂、 脂肽、 磷脂、 脂肪酸、 多糖-脂类复合物和中性类脂 衍生物等， 已知的生物表面活性剂以糖脂为主。 生物表面活性剂由于其良好的增溶、 乳化、 降低表面活性剂以及环境友好性等特征， 在含油废水的治理、 石油污染地的环境修复、 采油 工业、 清洁等领域中得到了广泛地应用， 并向其他领域渗入。 研究表明， 生物表面活性剂的 驱油效率比化学表面活性剂的驱油效率高3.5-8倍， 而价格仅为化学表面活性剂的30。 生 物表面活性剂取代化学表面活性剂已渐成为。
8、一种新的研究趋势。 0004 金属镀前处理常指零件的除油和除锈， 是电镀的重要工序， 电镀零件镀前处理质 量的好坏， 直接影响电镀层质量。 据统计， 镀件90质量事故的主要原因是由于镀前处理不 当造成的。 目前金属镀前除油的传统工艺， 主要有热碱高温化学清洗法、 超声波除油、 化学 试剂除油等； 其中高温碱法能耗大、 污染严重已遭淘汰； 超声波除油因设备投资大， 限制其 在实际中的应用； 化学试剂除油是目前应用最多的除油方法， 然而， 传统的化学试剂除油存 在如下缺点： 常温下除油效果差， 使用时必须加热(大多在70以上)， 除油效果随着槽液的 老化而逐渐变弱， 既浪费资源又造成油污、 泥渣的。
9、二次污染， 还存在高泡沫性、 高碱性和腐 蚀严重等问题。 因此工业生产中急需一种低能耗、 安全环保、 易降解、 高效率的除油剂。 发明内容 0005 本发明的目的是通过筛选出一株产生物表面活性剂的菌株， 利用该菌株产生的生 物表面活性剂， 达到常温除油， 且可生物降解、 无污染的效果， 应用于金属电镀前处理。 0006 本发明的技术方案是： 从石油污染地采用富集培养、 稀释涂布、 纯化得到菌株XH- 2， 经鉴定该菌为不动杆菌属(Acinetobactersp.XH-2)。 并已经提交中国普通微生物菌种 保藏管理中心进行了菌种保藏。 0007 所用的富集培养基为(w/v， )为： 氯化镁2、 。
10、磷酸氢二钾6、 磷酸二氢钾3.8、 三氯化 铁0.5、 氯化铵10， 附加防腐油作为唯一碳源进行富集培养。 0008 所用的发酵培养基为(w/v， )： 乳清粉0.1、 硝酸钠0.1、 磷酸二氢钾0.2、 磷酸氢二 说明书 1/5 页 3 CN 105505830 A 3 钠0.6、 六水氯化镁0.02、 氯化钠2、 微量元素1mL/L、 Tween801、 pH为6， 蒸馏水配制。 0009 所述的菌株XH-2在所述的发酵培养基中发酵培养48h， 410000rpm离心20min， 取上清液用6mol/LHCl调整pH至2.0， 用等体积的乙酸乙酯溶液萃取2次后， 合并有机相于 旋转蒸发仪上。
11、浓缩， 将浓缩液倒入烧杯中， 待自然挥发后即得表面活性剂的粗品。 0010 为了进一步研究该生物表面活性剂的特性， 使用该粗品进行了成分分析、 临界胶 束浓度的测定和稳定性分析。 0011 本发明公布的生物表面活性剂主要成分， 经定性分析和红外光谱结果初步判断为 糖脂类。 0012 经测定， 该生物表面活性剂的临界胶束浓度为200mg/L， 大幅低于常用的化学表面 活性剂如十二烷基磺酸钠(2120mg/L)、 十六烷基三甲基溴化铵(1300mg/L)。 0013 应用于长、 宽、 高分别为4cm、 2cm和0.3cm钢片表面防腐油的去除， 除油效果好， 时 间短， 仅需16min。 0014 。
12、本发明具有的优点和积极效果是： 0015 申请人从石油污染地筛选到一株产生物表面活性剂的菌株， 命名为不动杆菌XH- 2， 采用生物发酵的方法， 以提取乳酪后的副产品乳清粉、 硝酸钠、 无机盐为原料， 利用不动 杆菌XH-2生产糖脂类生物表面活性剂， 该生物表面活性剂在常温条件下， 可除去金属表面 的防腐油。 0016 本发明中所用的碳源为提取乳酪后剩下的下脚料乳清粉， 价格低廉， 成本低； 微生 物繁殖快， 代谢快， 以微生物代谢生成的生物表面活性剂作为生物除油剂， 其在常温下即 发挥作用， 产品环保、 无毒无污染、 生物降解性好， 避免了传统化学法除油所需的高温强碱 环境， 降低能耗和操作。
13、危险系数， 避免二次环境污染； 本发明所制成的生物表面活性剂经不 同高温、 盐度、 pH处理后， 表面张力变化不大， 且该生物表面活性剂经100煮沸10min后， 其 除油效率没有降低， 具有良好的工业应用价值。 附图说明 0017 图1是本发明的菌株XH-2所产生物表面活性剂的临界胶束浓度测定图 0018 图2是本发明的生物表面活性剂的红外吸收光谱图 0019 图3是本发明的生物表面活性剂用于金属镀层前除油的效果图 具体实施方式 0020 实施例1产生物表面活性剂的不动杆菌(Acinetobactersp.XH-2)菌株的筛选。 0021 从被石油污染的土壤中采样， 本实施例使用的样本为山东。
14、东营胜利油田采油现场 被原油污染的土样， 称取5g土样在50mL富集培养基(w/v， ： 氯化镁2、 磷酸氢二钾6、 磷酸二 氢钾3.8、 三氯化铁0.5、 氯化铵10， 附加防腐油作为唯一碳源)中进行培养， 取出1mL培养液 再转接至富集培养基中， 转接3次后； 稀释涂布在血平板上， 对有透明圈的菌株在LB固体培 养基上进行划线纯化。 0022 将纯化好的单菌落接种于5mL的LB液体培养基中， 活化12h后转接到未优化的发酵 培养基(w/v， ： 葡萄糖1、 蛋白胨1、 磷酸二氢钾0.2、 磷酸氢二钠0.6、 六水氯化镁0.02、 微量 元素1mL/L)中， 发酵培养2d后， 离心发酵液弃菌。
15、体， 用上清液做排油圈实验和利用JK9913型 说明书 2/5 页 4 CN 105505830 A 4 全自动张力仪采用吊环法测定表面张力， 并进行除油实验。 0023 所筛选的菌株XH-2其排油圈直径为4.5cm， 表面张力为32.58mN/m， 具有一定的除 油效果。 0024 选择菌株XH-2作为生物除油剂的原始菌株， 经鉴定该菌属于不动杆菌属。 0025 实施例2菌株XH-2的发酵工艺优化。 0026 以表面张力和除油时间为指标， 对菌株XH-2的发酵培养基和发酵条件进行优化。 0027 从LB固体平板上挑取菌株XH-2单菌落接种于5mL的LB液体培养基中， 活化12h后， 转接到发。
16、酵培养基中， 摇床的转速为160rpm， 温度设为30。 0028 将葡萄糖、 蔗糖、 乳糖、 乳清粉、 甘油、 橄榄油、 炸油条废油作为碳源， 将蛋白胨、 硝 酸钠、 硫酸铵、 酵母提取物(酵提)、 豆粕作为氮源， 发酵2d后， 进行表面张力和除油时间的测 定， 结果见表1和2， 主要根据除油时间确定最适碳氮源； 然后再进行浓度优化， 碳源浓度设 置为(w/v， )0.1、 0.5、 1.5、 3， 设置为氮源浓度(w/v， )设置为0.1、 0.2、 1、 3； 确定碳源为 0.1乳清粉， 氮源为0.1硝酸钠。 0029 初始pH设为5、 6、 7、 8、 9、 10， 附加1Tween8。
17、0和SDS表面活性剂。 0030 优化后的发酵培养基(w/v， )为： 乳清粉0.1、 硝酸钠0.1、 磷酸二氢钾0.2、 磷酸氢 二钠0.6、 六水氯化镁0.02、 氯化钠2、 微量元素1mL/L、 Tween801、 pH为6， 蒸馏水配制。 0031 发酵条件包括接种量和种龄的优化， 接种量(v/v， )设置为1、 2、 3、 4、 8； 将处于生 长初期(6h)、 指数期(12h)、 稳定期(20h)、 衰亡期(30h)的菌株转接到优化好的发酵培养基 中， 确定最佳接种量4和种龄为12h。 0032 表1不同碳源种类对金属表面除油时间和所产表面活性剂的表面张力一览表 0033 0034。
18、 表2不同氮源种类对金属表面除油时间和所产表面活性剂的表面张力一览表 说明书 3/5 页 5 CN 105505830 A 5 0035 0036 实施例3利用菌株XH-2发酵所产的生物表面活性剂制备生物除油剂。 0037 挑取LB固体平板上的菌株XH-2单菌落经5mLLB液体培养基活化12h后， 按4接种 量转接到实施例2优化的发酵培养基中， 在30、 160rpm摇床上发酵培养2d， 发酵液离心后 取上清液放置培养皿中， 将长4cm， 宽2cm， 高0.3cm钢片置于其中， 观察并记录除油所需的时 间。 结果见附图3， 图中A所示为钢片表面覆盖油膜， 图中B所示为钢片表面的油膜已被除净， 。
19、除油时间最短为16min， 图中C所示为除油后钢片放置一段时间后， 出现铁锈， 表明钢片油膜 被除尽。 0038 实施例4利用菌株XH-2发酵培养制备生物表面活性剂， 并进行临界胶束浓度的测 定、 成分初步鉴定及稳定性的研究。 0039 按照实施例3的方法获得菌株XH-2发酵培养2d的发酵液， 于4、 10000rpm的转速 离心20min， 取上清液用6mol/LHCl调整pH至2.0， 用等体积的乙酸乙酯溶液萃取2次后， 合 并有机相于旋转蒸发仪上浓缩， 将浓缩液倒入烧杯中， 待自然挥发后即得表面活性剂的粗 品， 产量为3.1g/L。 0040 将制得的粗品配成10、 20、 50、 10。
20、0、 200、 300、 400、 500、 1000mg/L的水溶液， 分别测 定其表面张力并绘制成曲线， 见附图1所示。 生物表面活性剂溶液从0-50mg/L时， 表面张力 从75mN/m很快下降至38.58mN/m； 以后下降缓慢； 当表面活性剂浓度达到200mg/L时， 表面张 力降为33.12mN/m； 样品浓度高于200mg/L后， 溶液的表面张力几乎不再下降； 因此， 该表面 活性剂的CMC值为200mg/L， 明显低于常用的化学表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS， 2120mg/ L)、 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB， 1300mg/L)， 其良好的表面活性更利于实际应用。 0。
21、041 采用亚甲基蓝-氯仿试验鉴定该生物表面活性剂的带电性。 在亚甲基蓝-氯仿试验 中， 将上述表面活性剂粗品配成0.3g/L的溶液， 取5mL表面活性剂溶液， 依次加入10mL亚甲 基蓝和5mL氯仿， 充分混匀后， 静置几分钟后观察。 实验结果为水层颜色变深， 表明该生物表 面活性剂为阳离子型表面活性剂。 0042 将表面活性剂粗品用KBr压片法进行红外光谱(FT-IR)分析。 结果见附图2， 从图中 可以看出， 3390cm-1附近出现了强而宽的吸收峰， 表明该分子中存在大量-OH； 2924cm-1和 2854cm-1的吸收振动属于脂肪族C-H的吸收峰， 而1460cm-1附近的吸收峰可。
22、归属于分子碳链 上连续的C-H振动引起； 1671cm-1处的吸收峰来自羰基的伸缩振动， 1728cm-1附近有较强且 尖的吸收峰， 表明有酯基的存在； 1074cm-1与1025cm-1处的吸收峰来自C-O-C键的伸缩振 说明书 4/5 页 6 CN 105505830 A 6 动， 表明该分子中存在羧酸酯基团。 跟已发表的糖脂类红外光谱图对比， 初步确定该生物表 面活性剂为糖脂类化合物。 0043 将上述表面活性剂粗品配成0.3g/L的溶液， 进行该生物表面活性剂在不同温度、 pH和盐度处理下的稳定性分析。 0044 (1)温度稳定性： 该生物表面活性剂溶液在不同的温度下(4、 室温、 6。
23、0、 100) 放置30min后， 测定表面张力； 0045 (2)pH稳定性： 该生物表面活性剂粗品用不同pH(2、 4、 6、 8、 10、 12)缓冲液溶解， 于 室温放置12h后， 测定表面张力； 0046 (3)盐度稳定性： 该生物表面活性剂粗品用不同盐度(0-9)的溶液配成浓度为 0.3g/L的溶液， 于室温放置12h后， 测定表面张力。 0047 结果见下表3， 在不同温度、 pH和盐度处理下， 表面张力变化不大， 该生物表面活性 剂具有较好的稳定性和耐受性。 发酵液的上清液经沸水浴处理10min后， 其除油效率影响不 大。 0048 表3温度、 pH和盐度对生物表面活性剂稳定性的影响 0049 0050 以上对本发明的一个实施例进行了详细说明， 但所述内容仅为本发明的较佳实施 例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。 凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 105505830 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 105505830 A 8 图3 说明书附图 2/2 页 9 CN 105505830 A 9 。