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本发明涉及一种花粉特异性表达启动子及其植物表达载体，该启动子长521bp，具有序列表中<400>1项下的序列，将其取代植物表达载体pBI121上的组成型CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pBITG6。本发明所提供的启动子的获得，为利用基因工程获得植物雄性不育系和恢复系创造了条件，为基因工程研究提供依据，为外源基因在花粉中特异性表达提供了基础，外源基因可以是编码杀昆虫毒素(靶向以花粉为食的昆虫)的基因、可增强或修饰花粉的营养价值的基因等，并且，过量表达芥子酶基因可能起到防御作用、通过RNAi干扰防止花粉的产生应用于行道树可能对花粉过敏症有一定缓解作用等，因此，具有重要的理论和实践意义。

1、  一种花粉特异性表达启动子，其特征在于：通过生物信息学的方法初步确定、在拟南芥生态型Col-0中获得、通过科学实验验证在花粉中特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1下的序列。

2、  一种花粉特异性表达载体，其特征在于：转入了权利要求1所述的拟南芥花粉特异性表达的启动子。

3、  根据权利要求2所述的花粉特异表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的拟南芥花粉特异性表达启动子置换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子，构建成在启动子下游含有GUS报告基因的花粉特异表达载体，并通过转化模式植物拟南芥得到转基因植株。

一种花粉特异性表达启动子及其植物表达载体
技术领域
本发明属于植物分子生物学和基因工程领域，具体的说，涉及一种新型芥子酶TGG6基因启动子的获得和植物表达载体的构建，尤其涉及诱导外源基因在花粉特异性表达和获得植物雄性不育系和恢复系，具有潜在的应用价值。
背景技术
十字花科是一个同时具有重要经济价值和理论研究意义的科。它们分布十分广泛，含有一种共同的次生代谢物硫代葡糖苷，在生物学上是相对惰性的物质，它与细胞质中的硫代葡糖苷葡糖水解酶-芥子酶共同组成了一个双组分系统，即芥子酶防御系统，俗称“芥子炸弹”。酶和底物分别储藏在不同的细胞中。在植物受到机械损伤、昆虫攻击或受到真菌和病原体的感染时，位于特定蛋白体中的芥子酶即释放出来，与硫代葡糖苷作用，产生1分子D-葡萄糖和1分子的糖苷配基，后者不稳定，自发水解形成异硫氰酸酯、腈、恶唑烷硫酮或硫氰酸酯等物质。这些代谢产物参与防御害虫、真菌、病毒、细菌病原体、线虫等，并且参与硫和氮的代谢以及生长调节，赋予蔬菜典型的气味和味道，抑制肿瘤的形成，并在预防心脏病中起着重要的作用。一直以来，人们对芥子酶系统的研究主要集中在植物防御方面，而对它在生长发育方面的作用关注较少。目前在拟南芥中发现的芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5、TGG6，其中已知芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3与新型芥子酶基因TGG4、TGG5、TGG6，它们在DNA序列、基因结构及编码蛋白特性等方面有较大差异，TGG1、TGG2、TGG4、TGG5被证实是有功能的基因，TGG3、TGG6是不能编码完整芥子酶的假基因。对新型芥子酶基因表达调控及功能的研究将进一步揭示芥子酶防御系统的功能，为研究生物进化、生长发育机制和基因组动态变化等事件的机制提供了重要线索，同时在植物营养利用及抗病虫害基因工程研究中也具有重要意义。
花药是花粉发育的场所，植物雄性不育系是作物杂种优势利用的重要途径，因此对花药及花粉发育的研究具有重要的应用价值。目前已在许多植物中分离到花药和花粉特异性表达基因及其调控序列，如烟草(Seurinck J，Truettner J，Goldberg R B.The nucleotide sequence ofan anther-specific gene[J].Nucleic Acids Res，1990，18(11)：3403.)、水稻(Twell D，Yamaguchi J，McCormick S.Pollen-specific geneexpression in transgenic plants：coordinate regulation of two differenttomato gene promoters during microsporogenesis[J].Development，1990，109(3)：705-713.)、玉米(Jeon J S，Chung Y Y，Lee S，et al.Isolation and characterization of an anther-specific gene，RA8，from rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Molecular Biology，1999，39(1)：35-44.)等。杂交繁育是传统的将两种植物的所需遗传性状导入一种植物传统的方法。为了可靠的获得性状一致的杂种，应确保亲本系之一为雄性不育，产生雄性不育目前有多种技术，一种方法是人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗状雄花，该植物只有通过雄性亲本的花粉才具有能育性，然而该方法费力而且不完全可靠。通过应用于植物或土壤以防止花粉产生的化合物防止花粉产生的化学方法也是已知的，以适当的时间间隔施用足够的化合物以确保传粉不会发生，这对环境造成了污染而且这些化合物还很昂贵。基因工程提供了另一种替代方法，来获得植物雄性不育系和恢复系。通过可诱导的启动子根据外部化合物的施用或有效性来启动或关闭能育性。例如，通过表达破坏花粉生物合成的蛋白质的基因序列级联系统诱导植物雄性不育；或是使用绒毡层特异性启动子在绒毡层细胞中表达花粉致死基因芽孢杆菌RNA酶，破坏花粉产生获得雄性不育系等等。
外源基因能够在植物组织中特异高效的表达，必须要构建一个可以特异高效表达的植物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。以人为的可控制的方式在花粉中表达对花粉产生有影响的基因对雄性不育系统将是有利的，必要时，能育性可以恢复。基因工程雄性不育系统的组成成分是使用在花粉中或花粉产生或发育所依赖的组织中特异性地驱动表达的启动子。新型芥子酶基因TGG6为一花部特异性表达的假基因，进一步证实TGG6基因的启动子为花粉特异性表达的启动子，它的获得为通过基因工程的方法获得植物雄性不育系创造有力条件，为外源基因(对花粉或花粉生成有影响的基因)在花粉中特异性表达提供基础。另外，过量表达芥子酶基因可能起到防御作用、通过RNAi干扰防止花粉的产生应用于行道树可能对花粉过敏症有一定的缓解作用等。因此，对于花粉特异性表达启动子的研究具有很大的应用价值。
发明内容
为了解决植物雄性不育系和恢复系，进行杂种优势利用，同时亦为在花粉中特异性的表达外源基因，从而得到高品质的花粉产品，培育具有较高商业价值及保健价值的新品种，本发明的目的是提供一种花粉特异性表达启动子及其植物表达载体，是在芥子酶花粉特异性表达的启动子及其植物表达载体，该启动子大小521bp。
本发明所涉及的设计方案为一种芥子酶花粉特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1项下的序列。通过拟南芥生态型Col-0中提取总DNA克隆获得的芥子酶TGG6基因启动子，经测序其长度为521bp。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。
本发明还提供了一种花粉特异性表达的载体，其特征在于转入了前述的拟南芥花粉特异性表达的启动子。利用前述的拟南芥特异性表达的启动子置换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子，构建成在启动子下游含有GUS基因的新的植物表达载体，命名为pBITG6。通过花序浸泡法转化模式植物拟南芥，成功获得转基因植株。RT-PCR结果表明TGG6基因在花部特异性表达，GUS组织化学染色鉴定进一步证实TGG6基因的启动子为花粉特异性表达的启动子，pBITG6为一种花粉特异性表达的载体。
以下我们分为两大部分详细介绍我们的发明内容。
一、TGG6基因启动子的克隆及表达载体的构建。
采用大连宝生物总DNA提取试剂盒提取拟南芥生态型Col-0基因组DNA。根据数据库中的TGG6基因的序列，设计两个特异性的引物(分别含有HindIII和BamHI酶切位点，粗体为酶切位点)HNP73：5′GGACAG TGC TGC ACC ATT CCA TTG TCA 3′，HNP57：5′GTTGCT TTC TTT TTG CGT TTC TTG ATG GAG 3′，进行PCR扩增，得到一条长约520bp的产物，双酶切后置换植物表达载体pBI121上的CaMV 35S启动子，得到新的植物表达载体，于上海闪晶测序，测序结果该启动子长521bp，序列参照序列表<400>1中。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒等。新的植物表达载体命名为pBITG6。
二、转基因植株的获得及GUS组织化学染色。
1)转基因植株的获得
通过电击转化法将上述表达载体转入农杆菌C58，抗性筛选后进行PCR鉴定。鉴定为阳性的转化子通过花序浸泡法转化拟南芥，收取T0代种子进行抗性筛选，对转基因植株进一步进行PCR鉴定。选择PCR鉴定为阳性的植株继续培养得到转基因纯系。
2)GUS组织化学检测
取T1代种子抗性分离比为3∶1的小苗进行GUS组织化学染色，观察GUS基因在转基因拟南芥各个植物器官的表达情况，照相。
本发明提供的花粉特异性表达的启动子及其植物表达载体，将该启动子取代植物表达载体上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载体在花粉中表达。该启动子的获得，为外源基因(对花粉或花粉生成有影响的基因)在花粉中特异性表达提供了基础，外源基因可以是编码杀昆虫毒素(靶向以花粉为食的昆虫)的基因、可增强或修饰花粉的营养价值的基因等。另外，过量表达芥子酶基因可能起到防御作用、通过RNAi干扰防止花粉的产生应用于行道树可能对花粉过敏症有一定缓解作用等。利用基因工程的方法还可以获得雄性不育系，因此对于花粉特异性表达启动子的研究具有很大的应用价值。
附图说明
图1为TGG6启动子驱动GUS基因在花粉特异表达的染色图(表达的GUS细胞经染色呈蓝色)。
A，在植株的根、茎、叶中都检测不到GUS基因的表达；
B和C，在植株的幼小花蕾中检测不到GUS基因的表达，C为B图中的幼小花蕾，手工拨开以展示其花药；
D，在成熟花蕾但尚未开放的花蕾中，检测到GUS基因在花药中微弱表达(花蕾手工拨开)；
E，成熟半开花朵，GUS基因仅在花粉中表达；
F，开放花朵，显示GUS基因在花粉中表达；
G，放大花药，显示GUS基因在花粉中表达，花瓣上的蓝色斑点为释放出来的花粉；
H，一个表达GUS基因的花粉。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
本发明提供了一种拟南芥花粉特异性表达启动子及其植物表达载体。该启动子是利用生物信息学的方法分析初步确认、通过PCR方法由拟南芥生态型Col-0总DNA中扩增获得、并通过科学实验验证为花粉特异表达(图1)。
1、拟南芥生态型和种植方法是将来自Nottingham ArabidopsisStock Center，England的拟南芥生态型Col-0种子播种在标准营养土上，4℃放置3天后转到培养室培养，温度20℃，光照16小时/天，光照强度5000lx。拟南芥种子消毒是在1.5ml的Eppendorf管中加入少量种子，用1ml 75％乙醇浸泡数秒，吸出上清液；加入1ml无菌水，上下颠倒数次，静置数秒，吸出上清液；再加入1ml 5％的次氯酸钠溶液，颠倒混匀6～8min，用无菌水冲洗5次；消毒后的种子用1ml灭菌的0.1％琼脂糖混匀，用无菌滴管滴到培养基上；4℃冰箱内春化3天，放入到光照8h/d的人工气候箱萌发，温度为白天25℃，晚上22℃，20天后转入14h/d光照培养箱，温度同上；萌发后30天，选取健壮、生长一致的苗移栽到事先灭菌的培养土中，覆盖保鲜膜，等苗生长正常后(一般需3～5d)去保鲜膜培养(培养箱温度为白天25℃，晚上22℃，14h/d光照)。
2、TGG6基因启动子的克隆及载体的构建是取拟南芥生态型Col-0植株的叶片，液氮研磨，采用大连宝生物公司总DNA提取试剂盒提取拟南芥总DNA。以基因特异引物(并分别加上HindIII和BamHI酶切位点)HNP73(5′3′)，HNP57(5′3′)扩增TGG6启动子片段。引物由上海闪晶生物公司合成，DNA聚合酶LA Taq来自大连宝生物公司。
目的片段的PCR扩增：在PCR管中依次加入
10×PCR Buffer               5μl
dNTP                         4μl
Template                     1μl
Primer 1                     1μl
Primer 2                     1μl
Taq E                        0.5μl
Sterilized distilled water   37.5μl
                                        
Total                        50μl
轻轻混匀，瞬时离心，将Eppendorf管置PCR扩增仪中，盖上加热帽。反应程序：94℃变性2min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min结束反应。取5μl PCR扩增反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压条件下电泳30min后，通过凝胶成像系统观察并照相。采用大连宝生物小片段纯化试剂盒回收纯化产物。将纯化产物和植物表达载体pBI121双酶切。酶切反应体系如下：
1×K Buffer                  5μl
Hind III                     1.5μl
BamH I                       1.5μl
纯化PCR产物                  30μl
Sterilized distilled water   12μl
                                      
Total                        50μl
1×K Buffer                  5μl
Hind III                     1.5μl
BamH I                       1.5μl
酶切底物                     pBI121表达载体质粒40μl
Sterilized distilled water   2μl
                                                          
Total                        50μl
30℃反应3h，纯化后40μlddH2O洗脱得到各酶切产物。酶切反应全部结束后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳、照相、检查片段大小，切胶回收大片段、浓缩，进行连接反应。反应体系如下：
10×连接酶Buffer             2μl
PCR片段                      5μl
载体片段                     1μl
T₄DNA连接酶                  1μl
Sterilized distilled water   11μl
                                         
Total                        20μl
轻弹混匀瞬时离心后，16℃过夜反应，次日全部用作转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，酶切鉴定后，由上海闪晶生物公司测序鉴定。每个片段至少测3个克隆，以排除PCR错误对序列的影响。测序结果为该启动子长521bp，序列参照序列表<400>1中。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒等。测序正确的载体命名为pBITG6。
3、表达载体导入农杆菌C58是采用电击转化法，分别吸取1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态细胞于离心管中，充分混匀，置冰上10min；将上述混和液转移到经紫外照射灭菌的电极杯中，进行电击脉冲放电(电压1.8kv，电容25μf，阻抗400Ω)；电击结束后，分别加入500μl液体YEP培养基，轻轻混匀后，吸出混和液到10ml离心管中，，28℃，200rpm，培养4～6h；吸取200μl菌液，涂布到含有相应抗生素的固体YEP培养基上，28℃培养1～2d。对单菌落进行菌液PCR鉴定筛选阳性转化子。
农杆菌介导法转化拟南芥是通过花序浸泡的方法侵染拟南芥生态型Col-0，并引入组成型表达的35S启动子作为一个参照。选取健壮、生长一致、抽苔的的苗，头天浇水浇透；农杆菌先摇30ml，再取25ml放入500ml YEP+Km(抗质粒)中，摇菌24h以上(OD₆₀₀值在1.8～2.0)；4000rpm离心15min(室温)集菌；用2倍体积(1L)转化Buffer(1000ml 1/2MS+10μl BA(1mg/mL)+Tween20 400μl+5％蔗糖，用KOH调PH5.8)溶解，混匀后用来转化；取花序15cm左右的拟南芥植株，剪掉果荚及已开的花，整个花序轴浸入到转化溶液中10min或将整个花序轴浸入到转化溶液后置于真空装置中抽真空5min；取出后让植物平躺，覆盖保鲜膜，置于黑暗中，隔天再立起；约一个半月后可以收种子(25℃/22℃，16h/8h光/暗)；转化植株收种后，根据转化质粒抗性筛选转基因植株，进一步种植筛选得到转基因植株纯系。
4、转基因植株的筛选是根据转化质粒抗性筛选转基因植株，抗性筛选(卡那霉素50μg/ml)得到的转基因植株通过SDS法进行PCR鉴定初步确定转化成功的植株。取新生叶片1片(约10mg)，置于1.5ml Epppendorf管中，室温下，用塑料小杵将叶片迅速研磨成匀浆(20s之内)；加入提取液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0；250mmol/LNaCL；25mmol/L EDTA；0.5％SDS；121℃，高压蒸汽灭菌20min)400μl，剧烈摇动震荡混匀；在微型离心机上，12000rpm，离心2min；取上清液300μl，转移到另一个1.5mlEpppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后，室温下静置2min；室温，12000rpm，离心5min，弃上清，开盖放置15min左右，使异丙醇挥发，但是时间不易过长，否则沉淀的DNA难以回溶；加入50μlddH₂O，溶解沉淀，得到DNA粗提液；离心样品1min，上清液用于PCR反应；取5μl样品电泳，检测DNA提取质量；取1μl DNA为模板，其它成分按标准程序进行PCR反应；取5μl PCR产物电泳检测。继续种植收获T1代拟南芥植株上的成熟种子，取100～200颗消毒后播种于含相应抗生素的培养基上，春化后光照培养，10～20天后分别计数抗性苗和非抗性苗的数目，计算抗性苗与非抗性苗的比率(分离比)，3∶1即符合孟德尔遗传定律。
5、转基因植株的GUS检测是对转基因植株进行GUS染色分析。取T₁代种子抗性分离比为3∶1的小苗直接加入适量新鲜配制的X-gluc溶液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0，1mmol/L X-gluc，0.1％Triton X-100，0.1mmol/L亚铁氰化钾，0.1mmol/L铁氰化钾，20％甲醇)中，37℃温育1h至过夜；然后脱色：分别用30％、50％、70％和100％乙醇漂洗，每次5min，继续用100％乙醇脱色至背景白色或无色为止；最后将脱好色的材料放在70％乙醇中保存或照相。
                            序列表
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120>一种花粉特异性表达启动子及其植物表达载体
<160>1
<210>1
<211>521
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
cagtgctgca ccattccatt gtcatctctg gtttcgagtt tcttatttca tcttcatcac 60
ttcaatattc tctctcattc tttaagattt tgttttgcct tcctctccac cttaatctcc 120
aataggattt atcttttatg ttggtgtttg agttttcttt tcttttgttt gtgtgttttc 180
tttcatattt gggatttcta ttttattagg attgatgtta caacggttct ataaatcgaa 240
actttgcttt gttgtggata atcatttttt ttttttttgg ataaaccaat aaaaaccaaa 300
agaggtaatt atctcaatta cccgtaaatc cggacatctt taagaattca acggctttgt 360
gaaagatttg tcaatggata ttcttagaat tcaacattac ctttgctttg ttgtacttct 420
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tacccgctga aaagctccat caagaaacgc aaaaagaaag c 521