产生肌苷的微生物以及使用其生产肌苷的方法.pdf

本发明涉及一种产生肌苷的微生物以及使用其生产肌苷的方法。肌苷属于嘌呤核苷，是一种在5’-肌苷酸合成中非常重要的原料。更具体地说，本发明涉及通过使编码核苷水解酶II的基因失活，并且使编码5’-核苷酸酶的基因被增强表达来高浓度产生肌苷的棒状杆菌属重组微生物，该微生物仍保留了产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)的特征。

1、  一种通过使具有由SEQ.ID.NO：1表示的序列的编码核苷水解酶II的基因失活而产生肌苷酸和肌苷的产氨短杆菌。

2、  根据权利要求1的产氨短杆菌，其特征在于，失活通过使用包括一部分由SEQ.ID.NO：1表示的序列和抗生素标记的载体转化微生物来诱导。

3、  根据权利要求1的产氨短杆菌，其特征在于，微生物为产氨短杆菌CJIG650(保藏号：KCCM-10828P)。

4、  一种通过培养权利要求1至3所述的微生物中的一种微生物以及从培养液中得到积累的肌苷酸和肌苷来产生肌苷酸和肌苷的方法。

5、  一种通过过表达权利要求1至3所述的产氨短杆菌中的一种产氨短杆菌的编码5’-核苷酸酶的基因来高浓度产生肌苷的产氨短杆菌。

6、  根据权利要求5的产氨短杆菌，其特征在于，基因的过表达通过使用含有由SEQ.ID.NO：2表示的序列的载体转化微生物诱导。

7、  根据权利要求5的产氨短杆菌，其特征在于，微生物为产氨短杆菌CJIG650(保藏号：KCCM-10829P)。

8、  一种通过培养权利要求5到7所述的微生物中的一种微生物以及从培养液中得到积累的肌苷来生产肌苷的方法。

产生肌苷的微生物以及使用其生产肌苷的方法
技术领域
本发明涉及一种产生肌苷的微生物以及使用其生产肌苷的方法。肌苷属于嘌呤核苷，是一种在5’-肌苷酸合成中非常重要的原料。更具体地说，本发明涉及一种产生高浓度肌苷的棒状杆菌属重组微生物，其中产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)的特征被显示，编码核苷水解酶II的基因(此后被称为‘rih II’)被失活，并且编码5-核苷酸酶的基因(此后被称为‘ushA’)的表达被增强。
背景技术
作为核苷合成相关的酶，已知核苷水解酶II参与核苷的降解，并且已知5’-核苷酸酶参与核苷的合成。
编码核苷水解酶II的基因是在核苷补救合成途径中编码酶的基因，该酶不可逆地催化核糖和相应碱基，即嘌呤和嘧啶。该基因含有1326bp核苷序列和编码308个氨基酸的蛋白质，并对嘌呤核苷和嘧啶核苷两者具有底物特异性(Microbiology，2006，vol.152，pp1169-1177)。
编码5’-核苷酸酶的基因是在核苷生物合成途径(从头合成途径)中编码催化核苷诸如AMP，GMP，IMP和XMP的去磷酸化作用的酶的基因。该基因编码705个氨基酸的蛋白质。
肌苷是在作为风味增强调料而受瞩目的5’-肌苷酸的化学合成和通过酶转移合成中的重要底物。而且，肌苷是一种核酸生物合成的中间体，其不仅是一种动物和植物中的重要生理因子，而且还被应用到包括食品和医药工业等各个领域。已经报道核苷及其衍生物作为抗生素、抗肿瘤和抗病毒物质具有许多用途(J.Virol，vol；72，pp4858-4865)。
生产肌苷的常规方法为使用微生物诸如芽孢杆菌(Agric.Biol.Chem.，46，2347(1982)；韩国专利号27280或者产氨短杆菌(Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))直接发酵，或者5’-肌苷酸的热分解(日本专利早期公开号S43-3320)。但是，热分解需要大量的的热量，这使其难以实践。按照直接发酵法，产生肌苷的菌株的活性非常低，因此生产成本增加并且发酵时间较长，从而导致产率很低。
为了通过使用高浓度高产量的微生物来直接发酵生产肌苷，开发适于在其培养液中高浓度积累肌苷的菌株是非常重要的。
本发明的发明人持续研究了使用微生物通过直接发酵生产高产率/高收率的肌苷。最后，本发明的发明人通过证实当编码核苷水解酶II的rih II基因被失活并且编码5’-核苷酸酶的ushA基因被增强时产生肌苷的微生物可高产率/高产量的生产5’-肌苷酸而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明基于上述发现而建立。因此，本发明的一个目的在于提供一种棒状杆菌属重组微生物，其中编码核苷水解酶II的rih II基因被失活，并且编码5’-核苷酸酶的ushA基因被增强。
本发明的另一目的在于提供一种使用上述微生物生产肌苷的方法。
技术方案
本发明的上述目的和其他目的可通过本发明的下列实施例来实现。
此后，将对本发明进行详细描述。
为了实现本发明的目的，本发明通过对在CJIP2401(KCCM-10610)的核苷合成途径中涉及的基因进行操作，提供了具有核苷生产能力的微生物，其为能够高浓度积累5’-肌苷的产氨短杆菌ATCC 6872的突变株。
在本发明中使用的菌株为亲本菌株产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)[韩国专利公开号10-2004-0099466]，是产氨短杆菌MP377(KFCCl 1141)的突变株。产氨短杆菌MP377(KFCCl 1141)的突变株[韩国专利申请号10-2000-0013303]来源于产氨短杆菌KFCC-10814[韩国专利号127853]，是产氨短杆菌6872的突变株。因此，本发明的微生物具有以下所述的主要特征并具有与产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)相似的效果。
1)腺嘌呤营养缺陷型(Adenine auxotroph)
2)鸟嘌呤缺乏型(Guanine leaky type)
3)生物素营养缺陷型(Biotin auxotroph)
4)对8g/mL溶菌酶敏感
5)对3500g/mL 3，4-脱氢脯氨酸(dihydroproline)具有抗性
6)对300g/mL 6-巯基嘌呤具有抗性
7)对10mg/L 5-氟色氨酸(fluorotryptophan)具有抗性
在本发明中，编码核苷水解酶II的rih II基因是从野生型产氨短杆菌ATCC 6872中分离并优选具有由SEQ.ID.NO：1表示的序列。
在本发明中，编码5’-核苷酸酶的ushA基因被从野生型产氨短杆菌ATCC 6872中分离并优选具有由SEQ.ID.NO：2表示的序列。
本发明提供了一种棒状杆菌属重组微生物，其中编码核苷水解酶II的rih II基因被失活。
本发明还提供了一种棒状杆菌属微生物，其中编码核苷水解酶II蛋白质的rih II基因被失活并且编码5’-核苷酸酶的ushA基因的表达被增强。
在本发明中，“失活”可由本领域技术人员已知的任何方法来诱导。本文中的术语“失活”的意思是指与野生型菌株相比编码核苷水解酶II的rih II基因表达被降低到很低的水平，或者该基因不表达或者该基因表达的产物不具有活性，或者尽管被表达但活性降低。
在本发明中，“失活”可由选自下组的一种或多种突变方法诱导，该组由在rih II基因中插入一个或多个碱基对，在该基因中敲除一个或多个碱基对，通过在该基因中插入无义密码子转换或颠换碱基对所组成。
在本发明的优选实施例中，含有失活基因的微生物可通过培养使用含有部分rih II基因的载体转化的棒状杆菌属微生物而得到。
该基因的部分可通过使用由SEQ.ID.NO：3和NO：4表示的引物来合成。
在本发明中，rih II基因通过将重组载体插入到棒状杆菌中而失活。但是，作为代替重组载体的方法，可使用任何已知方法包括病毒传染都可被用于使rih II基因失活，但并不总限于此。
在本发明中，基因表达的增强可通过任何对本领域技术人员来说常规的方法来进行。这里，基因表达的加强指的是与野生型菌株相比编码5’-核苷酸酶的ushA基因的上调。
在本发明中，基因表达的增强通过含有编码5’-核苷酸酶的ushA基因的启动子区域的整个表达系统的活化来诱导。
在本发明的优选实施例中，含有增强基因的微生物可通过培养含有由SEQ.ID.NO：2表示的载体转化以表达包括编码5’-核苷酸酶的ushA基因的启动子区的整个表达系统的棒状杆菌属微生物而得到。
本发明进一步提供了产氨短杆菌CJIG650(保藏号：KCCM-10828P)，所述菌株具有失活的rih II基因并高浓度产生5’-肌苷酸和肌苷，其为产氨短杆菌CJIP2401(KCCM 10610)的突变株。
本发明还提供了产氨短杆菌CJIG651(保藏号：KCCM-10829P)，所述菌株具有失活的rih II基因和增强的ushA基因并高浓度产生肌苷，其为产氨短杆菌CJIG650(KCCM-10828P)的突变株。
本发明还提供了通过培养产氨短杆菌CJIG650(KCCM-10828P)和CJIG651(KCCM-10829P)以及在培养液中积累肌苷来高浓度高产量生产肌苷的方法。
本发明的菌株的构建过程如下。
使用产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属微生物例如产氨短杆菌ATCC6872的染色体进行测序。结果证实，编码核苷酸水解酶II的rih II基因大约为1326bp(SEQ.ID.NO：1)。进行PCR以得到基因片段来构建重组载体。产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属微生物被载体转化并且从转化菌株中选择高浓度产生5’-肌苷酸和肌苷的菌株。通过对产氨短杆菌ATCC 6872的染色体进行测序，可以确定编码5’-核苷酸的ushA基因大约为2115bp(SEQ.ID.NO：2)。进行PCR以得到基因片段来构建重组载体。产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属微生物被载体转化并且从转化菌株中选择只高浓度产生肌苷的菌株。
本发明的微生物优选通过使用含有编码核苷酸水解酶II的rih II基因的重组载体和含有编码编码核苷酸酶的ushA基因的重组载体转化产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属微生物得到。含有编码核苷酸水解酶II基因的重组载体包括500bp的rih II的结构基因序列，而含有5’-核苷酸酶基因的重组载体大约包括300bp的启动子、ushA结构基因序列和大约300bp的终止子。本发明的微生物是通过插入以产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属微生物的染色体构建含有rih II基因的重组载体来断裂基因以及通过以质粒形式过表达ushA基因的方式而产生的。
含有核苷酸水解酶II基因的重组载体通过下列过程构建；通过PCR得到的rih II基因被分离并纯化；并通过连接将纯化的基因插入到pCR2.1-TOPO载体中。这里重组载体优选为通过将一部分核苷水解酶II的结构基因插入到pCR2.1-TOPO载体中构建的pTOPO-rih II载体。含有5’-核苷酸酶基因的重组载体构建如下；通过PCR得到的ushA基因使用EcoRY和BamHI消化；并通过使用DNA T4连接酶将基因片段插入到使用相同的DNA限制酶预先消化的载体中。可适用的载体不限于特定的一种，并且对本领域技术人员来说任何常规载体都可被使用。但是，pECCG117载体[Biotechnology letters vol 13，No.10，p.721-726(1991)或者韩国专利公开号92-7401]是优选的，通过将ushA基因插入到peCCG117载体中构建的pECCG 117-ushA载体是特别优选地。
使用重组载体例如pTOPO-rih II，可通过常规电转化将线性DNA片段插入到微生物(例如产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610))中，并在含有用作选择标记的抗生素卡那霉素的培养基中培养该微生物，接着进行选择。pTOPO-rih II载体在选择性转化的菌株中的插入可通过PCR来确认。
为了在选择的转化菌株中过表达ushA基因，使用pECCG117-ushA载体通过电转化将线性DNA片段插入到所选的转化菌株中，并在含有用作选择标记的抗生素的氯霉素培养基中培养该微生物，接着进行选择。pECCG117-ushA载体在选择的转化菌株中的插入可通过PCR来确认。
本发明的微生物可在含有适当碳源、氮源、氨基酸和维生素的常规培养基中在有氧条件下适当地调节温度和pH来培养。
作为碳源，可选自下组中糖类的一种，该组由葡萄糖、果糖以及预先灭菌处理的糖蜜(糖蜜被转化为还原糖)所组成。示例性的氮源为无机氮源诸如氨、氯化铵和硫酸铵，有机氮源诸如蛋白胨、NZ-胺、肉汤、酵母膏、玉米浸出液、酪蛋白水解产物、鱼及其分解产物、以及脱脂豆饼及其降解产物。这里的培养基可另外包括无机化合物诸如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁、硫酸镁和硫酸钙等。另外，维生素和营养缺陷型碱基也可被加入。培养在有氧条件下优选在20-40℃下通过摇瓶培养或者液体深层发酵培养进行。pH优选在整个培养过程被调节为中性左右。培养时间优选为4-5天。通过直接发酵积累的肌苷可通过常规方法回收。
根据本发明的方法，肌苷可高产量生产。
附图说明
参照附图最佳理解本发明的优选实施例的应用，其中：
图1是说明来自野生型产氨短杆菌ATCC 6872的编码核苷水解酶II的rih II基因片段的克隆过程以及克隆的载体pTOPO-rih II的示意图。
图2是说明来自野生型产氨短杆菌ATCC 6872的编码5’-核苷酸酶的ushA基因片段的克隆过程以及克隆的载体pECCG117-ushA的示意图。
最佳实施方式
本发明的实践和现有优选实施例如下面的例子中显示的那样阐释的。
但是，可以理解的是在本发明的教导下，本领域技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：rih II基因的克隆
在该实施例中，使用野生型产氨短杆菌ATCC 6872的染色体DNA作为模板并且以SEQ.ID.NO：3和NO：4表示寡核苷酸作为引物通过PCR扩增1326bp的rih II基因片段(SEQ.ID.NO：1)，以构建含有一部分编码核苷水解酶II的rih II基因和抗生素标记的载体(rih II基因断裂载体)。按照下列方式进行PCR；96℃下变性30秒，52℃下退火30秒，并72℃下聚合30秒(30个循环)。扩增的rih II基因片段被克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen Co.，USA)质粒中。结果得到pTOPO-rih II载体。rih II基因片段的克隆过程以及克隆的载体pTOPO-rih II在图1中示出。
产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)使用构建的pTOPO-rih II载体通过电转化转化。然后，回收在含有卡那霉素(25mg/L)的CM固体培养基(肉汤10g/L，酵母膏10g/L，细菌蛋白胨10g/L，氯化钠2.5g/L，细菌琼脂粉1.7％，pH 7.0)上生长的单菌落。
菌落在含有相同抗生素的CM培养基中培养，接着分离质粒。质粒的大小首先被测定，然后使用包括pCR2.1-TOPO的多个克隆区域的两端的引物进行菌落PCR，通过测定插入的DNA的大小来确认转化。
用于使rih II基因失活的引物如下。
引物rih II-F(SEQ.ID.NO：3)：
5’-TGCTGGCGATGCACTTGAAT-3
引物rih II-B(SEQ.ID.NO：4)：
5′-TGTGCGACCAATGGTGGGGCC-3
上面选择的含有rih II基因的菌株被命名为产氨短杆菌CJIG650，其于2006年12月15日被保藏在KFCC(Korean Federation of CultureCollection)的KCCM(韩国微生物保存中心)(保藏号：KCCM 10828P)。
实施例2：ushA基因的克隆
在该实施例中，使用野生型产氨短杆菌ATCC 6872染色体DNA作为模板并使用由SEQ.ID.NO：5和NO：6表示的引物通过PCR扩增2115bp的ushA基因片段(SEQ.ID.NO：2)。按照下列方式进行PCR；96℃下变性30秒，52℃下退火30秒，并72℃下聚合30秒(30个循环)。得到的基因片段使用EcoRV和BamHI消化。通过使用T4连接酶将基因片段与使用相同的DNA限制酶消化的线性pECCG117载体连接。结果，得到pECCG117-ushA载体。ushA基因片段的克隆过程以及以及克隆的载体pECCG117-ushA在图2中示出。
使用构建的pECCG117-ushA载体通过电转化转化在实施例1中制备的突变菌株。然后，回收在含有氯霉素(7.5mg/L)的CM固体培养基(肉汤10g/L，酵母膏10g/L，细菌蛋白胨10g/L，氯化钠2.5g/L，细菌琼脂粉1.7％，pH 7.0)上生长的单菌落。将这些菌落在含有相同抗生素的CM培养基中培养，接着分离质粒。首先测定质粒的大小，然后使用包括pECCG117的多个克隆区域的两端的引物进行菌落PCR，通过测定插入的DNA的大小来确认转化。
用于过表达ushA基因的引物如下。
引物ushA-F(SEQ.ID.NO：5)：
5’-GTGTCTAAGTTTCGCCGTTTTGGC-3
引物ushA-B(SEQ.ID.NO：6)：
5’-GCCGGATCCCTAGAATTTGATGTGGCTAACCTCG-3
上面选择的含有ushA基因的菌株被命名为产氨短杆菌CJIG651，其于2006年12月15日被保藏在KFCC(Korean Federation of CultureCollection)的KCCM(韩国微生物保存中心)(保藏号KCCM 10829P)。
实施例3：在三角瓶中进行发酵试验
将3mL种子培养基分配到已高压灭菌的直径为18mm的试管中。将产氨短杆菌CJIG650(KCCM-10828P)，CJIG651(KCCM-10829P)和亲本菌株(KCCM-10610)分别接种在试管中，接着30℃摇瓶培养24小时以制备种子培养液。将27mL发酵培养基分配到120℃高压灭菌10分钟的500mL三角瓶中摇瓶培养。在接种3mL种子培养基后，培养4-5天。每分钟转数(RPM)被调节为200并且温度设定为32℃，pH调节为7.2。
种子培养基和发酵培养基的成分如下。
种子培养基：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，肉汤0.5％，酵母膏1％，氯化钠0.25％，腺嘌呤100mg/L，鸟嘌呤100mg/L，pH7.2。
摇瓶发酵培养基：谷氨酸钠0.1％，氯化铵1％，硫酸镁1.2％，氯化钙0.01％，硫酸铁20mg/L，硫酸镁20mg/L，硫酸锌20mg/L，硫酸铜5mg/L，L-半胱氨酸23mg/L，丙氨酸24mg/L，尼克酸8mg/L，生物素45μg/L，盐酸硫胺素5mg/l，腺嘌呤30mg/L，磷酸(85％)1.9％，由果糖、葡萄糖和糖蜜的混合物转化的还原糖8％。
对肌苷酸(IMP)或肌苷在CJIG650(KCCM-10828P)，CJIG651(KCCM-10829P)和亲本菌株(KCCM-10610)培养基中的积累情况进行相互比较。结果显示于表1中。如表1所示，在亲本菌株(KCCM-10610)培养基中仅有肌苷酸被积累，并且其中根本没有积累肌苷。但是，本发明的菌株CJIG650(KCCM-10828P)产生高浓度的肌苷酸和肌苷，而菌株CJIG651(KCCM-10829P)产生高浓度的肌苷。
因此，本发明的菌株CJIG650(KCCM-10828P)和CJIG651(KCCM-10829P)被确认为能够产生高浓度肌苷的菌株。
表1