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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610008841.6 (22)申请日 2016.01.04 C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市广州国际生物岛 螺旋四路一号生产区第五层 502 单元 (72)发明人 葛啸虎 陈海佳 王一飞 罗二梅 (74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344 代理人 刘雪花 (54) 发明名称 调节性 T 细胞的扩增方法 (57) 摘要 本发明涉及调节性 T 细胞的扩增方法。所述 调节性 T 细胞的扩增方。
2、法包括将 CD4+CD25+Treg 细 胞 和 hUC-MSCs 共 同 培 养 的 步 骤, 将 P3 代 hUC-MSCs按照一定的密度接种到Transwell小室 的上室, 将 CD4+CD25+Treg 细胞按照一定的密度接 种到Transwell小室的下室, 共同培养14天, 每隔 2 天对细胞进行补液。本发明将 CD4+CD25+Treg 细 胞在体外与hUC-MSCs进行共培养, hUC-MSCs所分 泌的生长因子可以促进 CD4+CD25+Treg 细胞的增 殖, 增强了扩增效果。 将使用本发明方法扩增后的 CD4+CD25+Treg 细胞做成制剂, 回输疗效良好。 (51)。
3、Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105543171 A 2016.05.04 CN 105543171 A 1.调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 将CD4+CD25+Treg细胞和hUC-MSCs共同培养。 2.根据权利要求1所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 所述CD4+CD25+Treg细 胞和hUC-MSCs共同培养的方法为: 将hUC-MSCs接种到Transwell小室的上室, 将CD4+CD25+Treg细胞接种到Transwell小室 的下室, 共同培养14天, 每隔2天对细胞。
4、进行补液。 3.根据权利要求2所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 所述hUC-MSCs的密度 为1105cells/ml, CD4+CD25+Treg细胞的密度为1106cells/ml。 4.根据权利要求2所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 共同培养时所使用的 培养基为X-VIVO15培养基, 其中添加200-1000U/ml的IL-2和10-50ng/ml的Flt3。 5.根据权利要求1所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, CD4+CD25+Treg细胞通 过以下方法制备: S11、 采用密度梯度离心法自血液中分离PBMC; S12、 自PBMC中分选出CD4+。
5、CD25+Treg细胞。 6.根据权利要求5所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 所述步骤S12使用 EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自PBMC中分选出CD4+CD25+Treg细胞。 7.根据权利要求5所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, 所述血液为系统性红 斑狼疮患者的血液。 8.根据权利要求1所述的调节性T细胞的扩增方法, 其特征在于, hUC-MSCs通过以下方 法制备: S21、 去除脐带中的动静脉和羊膜; 将脐带剪成碎块; 用0.2m/v的型胶原酶消化液 脐带碎块2-4h, 2000rpm离心得到原代的hUC-MSCs; S22、 用含5-20。
6、ng/mlEGF 的X-VIVO15培养原代hUC-MSCs, 24h后换液, 去掉未贴壁细 胞; 继续培养至hUC-MSCs汇合度达到90, 用0.25m/v胰蛋白酶消化2min, 1000rpm离心得 到P1代hUC-MSCs; 继续培养直到获得P3代hUC-MSCs。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543171 A 2 调节性T细胞的扩增方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞领域, 尤其涉及一种调节性T细胞的扩增方法。 背景技术 0002 调节性T细胞(Regulatorycell, 简称Treg)是一群具有免疫抑制效应的T细胞亚 群。 对人体的免疫系统来说, Treg细胞无。
7、疑是把双刃剑。 它对维持机体免疫耐受和免疫应答 稳态具有非常重要的作用, 可以通过一系列机制抑制过强的免疫应答, 使得机体在自身损 伤最小的情况下有效的清除抗原或病原体。 控制Treg细胞的数量与表达可以帮助我们控制 疾病的进程。 Treg细胞主要通过两种方式发挥免疫抑制功能。 第一种方式是Treg细胞可以 通过分泌异质性细胞因子等发挥免疫调节作用; 第二种方式是Treg细胞主要通过细胞与细 胞的直接接触来发挥作用。 0003 CD4+CD25+Treg细胞作为一类调节性T细胞, 在自身反应性T细胞的增殖, 维持免疫 耐受方面起着重要的作用。 现有技术中采用免疫磁珠两步法分离CD4+CD25+。
8、Treg细胞, 并用 CD4+CD25+Treg细胞专用的完全培养基和一定浓度的IL-2培养扩增CD4+CD25+Treg细胞。 在 上述现有技术中使用的培养基成本较高, 免疫磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞需要过柱, 操作 繁琐。 而且, 分离得到的CD4+CD25+Treg细胞的扩增效率低。 因此, 如何简单分离并提高CD4+ CD25+Treg细胞的扩增效率, 是当下研究的热点。 发明内容 0004 有鉴于此, 有必要针对上述的问题, 提供一种调节性T细胞的扩增方法。 0005 为了实现上述目的, 本发明采用如下技术方案: 0006 调节性T细胞的扩增方法, 将CD4+CD25+T。
9、reg细胞和hUC-MSCs共同培养。 0007 优选地, 所述CD4+CD25+Treg细胞和hUC-MSCs共同培养的方法为: 0008 将hUC-MSCs接种到Transwell小室的上室, 将CD4+CD25+Treg细胞接种到Transwell 小室的下室, 共同培养14天, 每隔2天对细胞进行补液。 0009 优选地, 所述hUC-MSCs的密度为1105cells/ml, CD4+CD25+Treg细胞的密度为1 106cells/ml。 0010 优选地, 共同培养时所使用的培养基为X-VIVO15培养基, 其中添加200-1000U/ml 的IL-2和10-50ng/ml的F。
10、lt3(Fms-liketyrosinekinase,FMS样的酪氨酸激酶3)。 0011 优选地, CD4+CD25+Treg细胞通过以下方法制备: 0012 S11、 采用密度梯度离心法自血液中分离单个核细胞(PBMC); 0013 S12、 自PBMC中分选出CD4+CD25+Treg细胞。 0014 更优选地, 所述血液为系统性红斑狼疮患者的血液。 系统性红斑狼疮患者因自身 抗原免疫耐受缺失, 导致淋巴细胞大量活化和增生、 自身抗体大量产生和炎性介质的大量 释放。 系统性红斑狼疮患者缓解期体内的CD4+CD25+Treg细胞对由免疫过强而引起的自身免 疫性疾病有很好的治疗效果。 说明书。
11、 1/4 页 3 CN 105543171 A 3 0015 更优选地, 所述步骤S12使用EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自PBMC中分 选出CD4+CD25+Treg细胞。 0016 优选地, hUC-MSCs通过以下方法制备: 0017 S21、 去除脐带中的动静脉和羊膜; 将脐带剪成碎块; 用0.2m/v的型胶原酶消 化液脐带碎块2-4h, 2000rpm离心得到原代的hUC-MSCs; 0018 S22、 用含5-20ng/mlEGF 的X-VIVO15培养原代hUC-MSCs, 24h后换液, 去掉未贴壁 细胞; 继续培养至hUC-MSCs汇合度达到90, 用。
12、0.25m/v胰蛋白酶消化2min, 1000rpm离心 得到P1代hUC-MSCs; 继续培养直到获得P3代hUC-MSCs。 0019 与现有技术相比, 本发明调节性T细胞的扩增方法具有如下有益效果: 0020 1、 本发明将CD4+CD25+Treg细胞在体外与人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)进行共 同培养, hUC-MSCs所分泌的生长因子可以促进CD4+CD25+Treg细胞的增殖, 增强了扩增效果。 将使用本发明方法扩增后的CD4+CD25+Treg细胞做成制剂, 回输疗效良好。 0021 2、 本发明采用分选试剂盒免疫磁珠进行分选, 无需过柱, 操作简便, 节省时间。 00。
13、22 3、 本发明采用基础培养基进行培养, 降低了成本。 附图说明 0023 图1为效果实施例1中CD4+CD25+Treg细胞的增殖曲线。 0024 图2为实施例1中分选获得的CD4+CD25+Treg细胞的流式检测结果。 0025 图3为实施例1共同培养后获得的CD4+CD25+Treg细胞的流式检测结果。 0026 图4为对比例1中分选获得的CD4+CD25+Treg细胞的流式检测结果。 0027 图5为对比例1共同培养后获得的CD4+CD25+Treg细胞的流式检测结果。 具体实施方式 0028 为了更好的说明本发明, 下面结合附图和具体实施例做进一步说明。 本发明中所 用试剂或仪器均。
14、可由市场购得, 使用的检测方法等都是本领域所熟知的, 在此不再赘述。 0029 实施例1 0030 调节性T细胞的扩增方法, 包括以下步骤: 0031 S1、 CD4+CD25+Treg细胞的分离和分选; 具体包括以下步骤: 0032 S11、 采用密度梯度离心法自血液中分离单个核细胞(PBMC); 所述血液为系统性红 斑狼疮患者的血液; 0033 S12、 使用EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒, 按照其说明书所述的步骤操作 自PBMC中分选出CD4+CD25+Treg细胞。 0034 S2、 hUC-MSCs的分离和传代; 具体包括以下步骤: 0035 S21、 去除脐。
15、带中的动静脉和羊膜; 将脐带剪碎至约1mm3大小的碎块; 用0.2m/v (质量体积浓度)的型胶原酶消化脐带碎块2-4h, 用含体积分数10FBS的培养基终止消 化, 2000rpm离心5min得到原代的hUC-MSCs; 0036 S22、 用含5-20ng/mlEGF 的X-VIVO15培养原代hUC-MSCs, 24h后换液, 去掉未贴壁 细胞; 继续培养至hUC-MSCs汇合度达到90, 用0.25m/v胰蛋白酶消化2min; 用含体积分 数10FBS的培养基终止消化, 1000rpm离心5min得到P1代hUC-MSCs; 继续培养至获得P3代 说明书 2/4 页 4 CN 1055。
16、43171 A 4 hUC-MSCs。 0037 S3、 将CD4+CD25+Treg细胞和hUC-MSCs共同培养; 具体包括以下步骤: S31、 将密度为 1105cells/ml的P3代hUC-MSCs接种到Transwell小室(CORNING, 聚碳酸酯膜的孔径为3 m)中的上室, 每孔2ml; 0038 S32、 将密度为1106cells/ml的CD4+CD25+Treg细胞接种到Transwell小室中的下 室, 每孔2ml; 0039 S33、 共同培养14天, 每隔2天对细胞进行补液, 所使用的培养基为X-VIVO15培养 基, 其中添加200-1000U/ml的IL-2和。
17、10-50ng/ml的Flt3。 0040 对比例1 0041 (1)使用Ficoll-Paque中密度梯度离心法分离20ml红斑狼仓患者的血液样本中的 单个核细胞; 0042 (2)取1106个单个核细胞用MidiMACS法分离CD4+T细胞; 使用FACSAria高速细胞 分选仪(BDBiosciences)分选CD4+T细胞中的CD4+CD25+Treg细胞; 使用流式细胞仪分析CD4 +CD25+Treg细胞的表达并鉴定纯度; 0043 (3)体外使用X-VIVO15培养基培养CD4+CD25+Treg细胞, 为刺激调节性T细胞扩增, 向培养基中加入大剂量重组人IL-2(500-100。
18、0U/ml), 刺激培养14天。 0044 效果实施例1、 增殖情况检测 0045 在实施例1和对比例1细胞培养中, 每隔2天随机抽取20 l细胞悬液进行台盼蓝染 色, 进行细胞计数; 连续计数7次, 绘制细胞的生长曲线, 结果如图1所示。 0046 由图1可知, 对比例1方法培养调节性T细胞时, 细胞增殖缓慢, 培养3周后, 细胞数 量也仅为1106个左右。 使用实施例1所述方法培养调节性T细胞, 细胞增殖迅速, 在培养第 13天左右细胞的含量就达到1106个左右, 在培养3周后, 细胞的含量达到4.5106个以上, 是对比例1方法的4.5倍。 0047 效果实施例2、 流式检测 0048 。
19、取实施例1、 对比例1分选后及共同培养后的CD4+CD25+Treg细胞进行CD4和CD25的 流式检测。 流式检测方法如下: 取1106个CD4+CD25+Treg细胞; 250g离心5min去上清; 用含 10FBS的PBS溶液清洗2次; 避光加入CD4和CD25抗体2.5 L室温孵育30min; 用含10FBS的 PBS溶液清洗2次; 用500mLRPMI1640培养基重悬细胞并过滤, 上流式细胞仪进行检测。 流 式检测结果如图2-5和表1所示。 0049 表1、 CD4+CD25+Treg细胞流式检测结果 0050 组别分选后共同培养后 实施例195.797.9 对比例182.583.。
20、5 0051 由图2-5和表1可知, 对比例1方法分选后获得的调节性T细胞的CD4+CD25+表达量为 82.5, 与hUC-MSCs共同培养后CD4+CD25+表达量为83.5; 而实施例1方法分选后获得的调 节性T细胞的CD4+CD25+表达量为95.7, 与hUC-MSCs共同培养后CD4+CD25+表达量为 97.9, 显著高于对比例1方法获得的调节性T细胞的CD4+CD25+表达量, 且差异具有统计学 意义。 所以, 本发明方法可以显著提高调节性T细胞的CD4+CD25+表达量。 说明书 3/4 页 5 CN 105543171 A 5 0052 效果实施例3、 CD4+CD25+T。
21、reg细胞分泌的细胞因子含量的检测 0053 取实施例1、 对比例1收集的细胞培养液浓缩后采用ELASA法定量检测其所分泌的 TGF- 和IL-10含量。 0054 TGF- 标准品的浓度与吸光度值成线性关系, 其线性曲线为: Y0.047X+0.29。 实 施例1中细胞培养液所测TGF- 的OD450值为1.12, 对比例1中细胞培养液所测TGF- 的OD450 值为0.94。 根据线性曲线计算得到, 实施例1中细胞培养液的TGF- 的含量为17.66 g/ml, 对 比例1中细胞培养液的TGF- 的含量为13.83 g/ml。 0055 IL-10标准品的浓度与吸光度值成线性关系, 其线性。
22、曲线为: Y0.11X+0.8。 实施 例1中细胞培养液所测IL-10的OD450值为1.203, 对比例1中细胞培养液所测IL-10的OD450 值为1.04。 根据线性曲线计算得到, 实施例1中细胞培养液的IL-10的含量为3.66 g/ml, 对 比例1中细胞培养液的IL-10的含量为2.19 g/ml。 0056 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式, 其描述较为具体和详细, 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是, 对于本领域的普通技术人员 来说, 在不脱离本发明构思的前提下, 还可以做出若干变形和改进, 这些都属于本发明的保 护范围。 因此, 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 4/4 页 6 CN 105543171 A 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 105543171 A 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 105543171 A 8 图5 说明书附图 3/3 页 9 CN 105543171 A 9 。