技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株脱除钙离子和镁离子的解淀粉芽孢杆菌及 其用途。
背景技术
酸解红土镍矿废水中的金属离子主要以Mg2+为主，理论上可以通过浓缩、结晶手段 生产硫酸镁，但存在硫酸镁杂质含量高、价值低、能耗高等问题；利用碳酸钠、烧碱生产氢氧 化镁可以利用镁资源，但同时副产了大量的硫酸钠；利用电石渣使镁离子转化为氢氧化镁， 并与硫酸钙共沉淀是目前采用的技术，但存在电石渣有效含量低、运输成本高、渣量大的问 题。因此，结合当地的资源条件和生产工艺，寻找一种脱镁效果好、处理成本低的废水净化 可行技术以及经济合理、效果显著的净化工艺势在必行。利用微生物沉降其中的镁离子则 是一种环保经济节约的好方法。
利用微生物不仅能沉降镁离子还能处理硬水中的二价金属离子。硬水是指水中含 有一定浓度的钙离子和镁离子。硬水常用软化方法有离子交换法，石灰法，加药法，电磁法， 膜分离法等，这些方法存在运行成本高，效果不稳定，对进水压力有较高要求等缺陷。微生 物法可避免上述缺点，微生物诱导的镁钙离子的沉降与其他传统软化方法相比，只需较少 的能源和试剂就可以进行，成本很低，经济效益比较明显，环境污染小。
其实微生物沉降钙离子和镁离子形成碳酸盐的现象在自然界是普遍存在的。微生 物从周围环境中选择性地吸取金属离子，在严格的生物控制下组装成功能化的碳酸盐矿 物，也可以通过改变周围的环境诱导碳酸盐的沉降或自身参与碳酸盐的沉降。许多研究人 员应用各种微生物进行了钙镁离子成矿研究，如在实验室中采用蓝细菌沉降钙离子诱导出 了方解石、文石，采用地衣芽孢杆菌在不同镁钙培养体系中诱导出了方解石、单水方解石等 矿物晶体，使用柠檬酸杆菌诱导得到了各种碳酸盐矿物等。若能使用微生物对含镁离子和/ 或钙离子的废水或硬水进行处理使之矿化生成镁或钙的碳酸盐矿物，不仅可以减少镁或钙 对环境的污染，而且还可以实现变废为宝，实现资源的循环再利用。
解淀粉芽孢杆菌是存在广泛的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境而备受青睐。 解淀粉芽孢杆菌目前已制成生物制剂应用于植物根部、枝干、叶、花部以及果蔬采后病害防 治上，还促进植物生长，抑制线虫。若能将解淀粉芽孢杆菌制作成水处理剂来脱除钙离子和 镁离子从而达到治理水环境污染的目的，将会节约大量的人力、财力和物力，同时还是一种 绿色环保无污染的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何脱除钙离子和镁离子达到废水净化或硬水软 化的目的。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株可以脱除钙离子和镁离子的细菌。
本发明所提供的细菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7，该 菌株已于2015年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.10965。解淀粉芽 孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7CGMCCNo.10965简称解淀粉芽孢杆菌DMS7。
本发明还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌DMS7。
所述菌剂的用途可为下述a1)、a2)、a3)或a4)：a1)脱除钙离子和/或镁离子；a2)脱 除水中钙离子和/或镁离子；a3)沉降钙离子和/或镁离子；a4)沉降水中钙离子和/或镁离 子。
所述菌剂的制备方法包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌DMS7接种至细菌培养基并 进行培养，获得OD600nm值约为1.05的菌液，即为所述菌剂。
所述细菌培养基可为改良LB培养基。
所述改良LB培养基的制备方法具体如下：将胰蛋白胨10g、酵母浸提物5g、KCl 0.1g和NaCl0.83g溶于1L蒸馏水，pH自然。
所述菌剂的制备方法中，所述培养的具体条件可为：28℃、130r/min振荡培养48h。
除了活性成分，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所 述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭 土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀 粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、 矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培 养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述 组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒 剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定 剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
解淀粉芽孢杆菌DMS7或上述任一所述菌剂在脱除钙离子和/或镁离子中的应用也 属于本发明的保护范围。
解淀粉芽孢杆菌DMS7或上述任一所述菌剂在脱除水中钙离子和/或镁离子中的应 用也属于本发明的保护范围。
解淀粉芽孢杆菌DMS7或上述任一所述菌剂在沉降钙离子和/或镁离子中的应用也 属于本发明的保护范围。
解淀粉芽孢杆菌DMS7或上述任一所述菌剂在沉降水中钙离子和/或镁离子中的应 用也属于本发明的保护范围。
所述水可为含有钙离子和/或镁离子的硬水。
所述钙离子的存在形式可为Ca2+。
所述镁离子的存在形式可为Mg2+。
所述含有钙离子和/或镁离子的硬水可为含有0.005～0.015mol/LCa2+和0.02～ 0.20mol/LMg2+的水。
所述含有钙离子和/或镁离子的硬水具体可为含有0.01mol/LCa2+和0.03～ 0.10mol/LMg2+的水。
本发明还提供了一种获得方解石的方法。
本发明所提供的获得方解石的方法，包括如下步骤：向液相体系甲中加入解淀粉 芽孢杆菌DMS7；所述液相体系甲中含有0.005～0.015mol/LCa2+。
本发明还提供了一种获得单水方解石的方法。
本发明所提供的获得单水方解石的方法，包括如下步骤：向液相体系乙中加入解 淀粉芽孢杆菌DMS7；所述液相体系乙中含有0.005～0.015mol/LCa2+和0.02～0.06mol/L Mg2+。
本发明还提供了一种获得三水菱镁矿的方法。
本发明所提供的获得三水菱镁矿的方法，包括如下步骤：向液相体系丙中加入解 淀粉芽孢杆菌DMS7；所述液相体系丙中含有0.02～0.20mol/LMg2+。
所述获得方解石的方法、所述获得单水方解石的方法或所述获得三水菱镁矿的方 法中，还包括加入解淀粉芽孢杆菌DMS7后进行培养的步骤。
所述获得方解石的方法、所述获得单水方解石的方法或所述获得三水菱镁矿的方 法中，所述培养的条件可为25℃～30℃、110～150r/min培养10～20天。
所述获得方解石的方法、所述获得单水方解石的方法或所述获得三水菱镁矿的方 法中，所述培养的条件具体可为28℃、130r/min培养15天。
所述液相体系甲、所述液相体系乙或所述液相体系丙中均可含有碳酸根离子和/ 或碳酸氢根离子。
所述碳酸根离子在所述液相体系甲、所述液相体系乙或所述液相体系丙中的浓度 可为0.01～0.06mol/L。
所述碳酸根离子在所述液相体系甲、所述液相体系乙或所述液相体系丙中的浓度 具体可为0.04mol/L。
所述碳酸氢根离子在所述液相体系甲、所述液相体系乙或所述液相体系丙中的浓 度可为0.01～0.06mol/L。
所述碳酸氢根离子在所述液相体系甲、所述液相体系乙或所述液相体系丙中的浓 度具体可为0.03mol/L。
所述液相体系甲中具体可含有0.01mol/LCa2+。
所述液相体系乙具体可含有0.01mol/LCa2+和0.03～0.06mol/LMg2+。
所述液相体系丙具体可含有0.03～0.10mol/LMg2+。
所述液相体系丙还可含有0.005～0.015mol/LCa2+，具体可含有0.01mol/LCa2+。
实验证明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌DMS7在沉降钙离子和镁离子中起至关重 要的作用，在含镁废水治理及硬水软化方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌DMS7的高分辨率透射电镜图和系统发育树图。
图2为在改良LB培养基中解淀粉芽孢杆菌DMS7的生长曲线和pH值变化曲线。
图3为钙离子变化趋势图。
图4为镁离子变化趋势图。
图5为矿物沉淀X射线衍射图。
图6为对照组矿物和实验组矿物的偏光显微镜图。
图7为对照组矿物沉淀的扫描电镜图。
图8为实验组矿物沉淀的扫描电镜图。
图9为对照组矿物沉淀的高分辨率透射电镜和纳米选区电子衍射联合分析。
图10为实验组矿物沉淀的高分辨率透射电镜和纳米选区电子衍射联合分析。
保藏说明
菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：(Bacillusamyloliquefaciens)
菌株编号：DMS7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年06月09日
保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10965
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
硅酸盐培养基：将蔗糖5g、MgS04·7H200.5g、Na2HP042g、CaC030.1g、FeCl30.005g、琼脂15～20g和钾长石粉1.0g溶于1L蒸馏水，调节pH至7.4；其中配制培养基前，钾 长石粉需依次进行如下处理：过筛(过1000目筛子)、浸泡(去离子水浸泡过夜)、冲洗(去离 子水反复冲洗，去除可溶性的钾)和阴干。
硅酸盐固体平板：将硅酸盐培养基趁热倒入培养皿中，得到硅酸盐固体平板。
解钾培养基：将蔗糖10g、MgS04·7H200.5g、CaC031.0g、(NH4)2S041.0g、NaCl 0.1g、酵母膏0.5g、Na2HP042g和钾长石粉10g溶于1L蒸馏水，调节pH至7.4；其中配制培养基 前，钾长石粉需依次进行如下处理：过筛(过1000目筛子)、浸泡(去离子水浸泡过夜)、冲洗 (去离子水反复冲洗，去除可溶性的钾)和阴干。
改良LB培养基：将胰蛋白胨10g、酵母浸提物5g、KCl0.1g和NaCl0.83g溶于1L蒸 馏水，pH自然。
X射线衍射分析使用转靶X射线衍射仪，日本理学电器公司产品，产品型号为D/ Max-RC；扫描电镜分析使用扫描电镜，日本日立公司产品，产品型号为HitachiS-4800；能谱 分析使用GENESIS能谱仪，美国伊达克斯有限公司产品；高分辨率透射电镜分析使用高分辨 率透射电镜，日本电子株式会社公司产品，产品型号为JEM-2100；偏光显微镜分析使用偏光 显微镜，德国卡尔蔡司公司产品，产品型号为AxioScopeA1pol；722s分光光度计为上海 精密科学仪器有限公司产品；原子吸收分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产 品，产品型号为TAS-986；pH计为上海仪电科学仪器股份有限公司产品，型号为PHS-3E。
SrCl2·6H2O水溶液：将30.4gSrCl2·6H2O溶解于100mL蒸馏水，得到的溶液。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7CGMCCNO.10965 的分离、鉴定和保藏
一、解钾菌DMS7的分离
1、在100mL无菌蒸馏水中加入10g土壤样品(采自中国青岛山东科技大学洞门山)， 搅拌15分钟，静止放置10分钟，然后取上清液1mL，加入盛有9mL无菌水中的无菌试管中充分 混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1mL加入到另一盛有9mL无菌水的无菌试 管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1mL 均匀涂布在硅酸盐固体平板上，28℃恒温静置培养3天。
2、完成步骤1后，挑取硅酸盐固体平板上不透明、白色的单菌落，接种于解钾培养 基中，置于振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品，产品型号为HZQ-F160) 上培养(28℃、120rpm)48小时，获得培养菌液。取1mL培养菌液，加入盛有9mL无菌水中的无 菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1mL加入到另一盛有9mL无 菌水的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的菌悬液。将各 稀释度取0.1mL均匀涂布在硅酸盐固体平板上，28℃恒温静置培养3天。挑取单菌落，反复纯 化3次以上。将筛选到的一株解钾菌菌株命名为解钾菌DMS7。
二、解钾菌DMS7的鉴定
1、形态学鉴定
将解钾菌DMS7接种到硅酸盐固体平板上，3天后观察单菌落的形态。结果表明，解 钾菌DMS7菌落圆形，扁平，直径1.0～3.0mm，边缘整齐，颜色为白色，菌落不透明，有一定的 湿润性。
解钾菌DMS7经染色后，鉴定为革兰氏阳性菌。通过高分辨率透射电镜分析解钾菌 DMS7，实验结果见图1中a。结果表明，解钾菌DMS7的大小约1.10μm×5.50μm，细菌为短杆形， 单独存在。
2、16SrDNA序列同源性分析
解钾菌DMS7的16SrDNA如序列表中的序列1所示。
通过ClustalX软件将序列表中的序列1与GenBank中的序列进行比对，采用邻接 法(N-J法)构建系统发育树。系统发育树的实验结果见图1中b。
解钾菌DMS7与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)同源性最高，达到 97％。
综合上述各个鉴定结果，解钾菌DMS7为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
三、解钾菌DMS7的保藏
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7已于2015年06月09日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.10965。解钾菌DMS7的全称为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)DMS7CGMCCNo.10965，简称为解淀粉芽孢杆菌DMS7或 DMS7。
实施例2、制备解淀粉芽孢杆菌DMS7菌剂
将解淀粉芽孢杆菌DMS7在硅酸盐培养基上活化，然后挑取单菌落接种于装有 100mL改良LB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、130r/min的恒温摇床上培养48h，得到OD600值 约为1.05的解淀粉芽孢杆菌DMS7菌剂。解淀粉芽孢杆菌DMS7菌剂在下文简称为DMS7菌剂。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌DMS7的特性
本实施例研究在改良LB培养基中解淀粉芽孢杆菌DMS7的生长曲线和pH变化曲线。 具体操作步骤如下：
取6个250mL的锥形瓶，每个锥形瓶装入200mL改良LB培养基，然后121℃高压灭菌 20min；待培养基冷却至室温后，将6个锥形瓶分为实验组和对照组，每组3个锥形瓶；向实验 组的锥形瓶中接种DMS7菌剂2mL，向对照组的锥形瓶中接种等体积无菌超纯水；接种完毕 后，将锥形瓶置于恒温振荡培养箱，28℃、130r/min培养。接种完毕时取样4mL，然后每3小时 取样4mL，测量菌浓度和pH值。
进行三次实验，结果取平均值。
实验组中DMS7的生长曲线见图2中a。DMS7在改良LB培养基中的生长过程均包括延 滞期(图2中a的0～22h)、对数期(图2中a的22～67h)、稳定期(图2中a的67～71h)和衰亡期 (图2中a的71～75h)四个阶段，其中延滞期为细菌正在适应培养基内的生长环境的阶段，对 数期为细菌处于活跃的分裂状态的阶段，稳定期为由于培养基内的营养物质被消耗以及有 毒代谢产物的逐渐积累，细菌的生长速率逐渐减慢下来但总生物量仍维持不变的阶段，衰 亡期为死亡率增加，细菌少繁殖或不繁殖的阶段，原因主要是外界环境对继续生长越来越 不利，细胞的分解代谢大于合成代谢，继而导致大量细菌死亡。结果表明，DMS7在改良LB培 养基中生长至71小时的浓度为1.05×109cfu/mL。由于对照组中接种的是无菌超纯水而不 是菌液，所以对照组中均无DMS7的生长曲线。
实验组中DMS7的pH值变化曲线见图2中b。DMS7在改良LB培养基中生长，培养基中 的pH值变化均包括缓慢上升期(图2中b的0～22h)、下降期(图2中b的22～47h)和上升期(图 2中b的47～166h)三个阶段，其中缓慢上升期pH值由5.84上升到6.45，下降期pH值从6.45左 右降至5.91左右，上升期pH值从5.91左右持续上升至8.8左右。对照组中的pH值均无明显变 化。
实施例4、解淀粉芽孢杆菌DMS7脱除钙离子和镁离子能力的测定
1、标准曲线的制作
(1)Ca2+标准曲线
准确称取无水CaCl21.11g于1L容量瓶中，用无菌水溶解配成Ca2+浓度为400mg/L的 CaCl2母液。继续用无菌水稀释配制成Ca2+浓度为0、5、10、15、20、25、30和35mg/L系列的 CaCl2溶液。采用原子吸收分光光度计测定不同浓度CaCl2溶液的吸光值，3次重复。以Ca2+浓 度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制Ca2+标准曲线。
(2)Mg2+标准曲线
准确称取优级纯MgCl2·6H2O4.1814g于500mL容量瓶中，用无菌水溶解配成Mg2+浓 度为1000mg/L的MgCl2母液。继续用无菌水稀释配制成Mg2+浓度为0、10、20、30、40、50、75和 100mg/L系列的MgCl2溶液，向各种MgCl2溶液中加入1mLSrCl2·6H2O水溶液。然后采用原子 吸收分光光度计测定不同浓度MgCl2溶液的吸光值，3次重复。以Mg2+浓度为横坐标，吸光值 为纵坐标，绘制Mg2+标准曲线。
2、取改良LB培养基，加入1.0mol/LCaCl2水溶液，使体系中的Ca2+浓度为0.01mol/ L，得到含钙培养基。
3、取步骤2制备的含钙培养基，加入2.0mol/L的MgCl2水溶液，使体系中的Mg2+浓度 依次为0mol/L、0.03mol/L、0.06mol/L、0.08mol/L和0.10mol/L，依次得到含钙镁培养基甲 (镁钙离子摩尔比为0)、含钙镁培养基乙(镁钙离子摩尔比为3)、含钙镁培养基丙(镁钙离子 摩尔比为6)、含钙镁培养基丁(镁钙离子摩尔比为8)和含钙镁培养基戊(镁钙离子摩尔比为 10)。
4、分别采用培养基(含钙镁培养基甲、含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁 培养基丁或含钙镁培养基戊)进行如下操作：
取6个250mL的锥形瓶，每个锥形瓶装入150mL的培养基，121℃高压灭菌20min。待 培养基冷却至室温后，每个锥形瓶中加入3mL的2mol/LNa2CO3水溶液和5mL的1mol/L NaHCO3水溶液(Na2CO3和NaHCO3溶液用孔径为0.22微米的滤膜过滤除菌后再用)，用NaOH调 节pH至7.2。
5、完成步骤4后，将6个锥形瓶分为实验组和对照组，每组3个锥形瓶。向实验组的 每个锥形瓶中接种实施例2制备的DMS7菌剂1.5mL(接种比例1:100)，向对照组的每个锥形 瓶中接种1.5mL的无菌超纯水。接种完毕后，将所有锥形瓶置于恒温振荡培养箱，28℃、 130r/min培养15天。
测量钙离子浓度前的取样工作：培养过程中，每24小时取样1.5mL，10000rpm离心 5min，收集上清液，将收集的上清液用无菌蒸馏水稀释10倍，然后用孔径为0.22微米的滤膜 过滤，得到稀释液。第一次取样的时间为完成步骤4后。
测量镁离子浓度前的取样工作：培养过程中，每次取样1.5mL，10000rpm离心5min， 收集上清液，将收集的上清液用无菌蒸馏水稀释10倍，然后用孔径为0.22微米的滤膜过滤， 得到稀释液。第一次取样为接种DMS7菌剂24小时后，第二次取样为接种DMS7菌剂72小时后， 此后每隔24小时取样。
6、用原子吸收分光光度计测量稀释液的吸光值，根据步骤1制作的Ca2+标准曲线和 Mg2+标准曲线，得到稀释液中Ca2+和Mg2+的浓度。
培养过程中，各个培养基中的Ca2+的变化趋势如图3所示(a为含钙镁培养基甲，b为 含钙镁培养基乙，c为含钙镁培养基丙，d为含钙镁培养基丁，e为含钙镁培养基戊)。实验结 果如下：
(1)由于各培养基中均加入了2mol/LNa2CO3水溶液和1mol/LNaHCO3水溶液，所以 各个培养基中的钙离子浓度均显著下降，且产生了沉淀，但与对照组相比，实验组中的钙离 子浓度明显更低，表明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7有促进钙离子 沉降的作用。
(2)培养至第7天：随着培养基中镁钙离子摩尔比的增大，各培养基中剩余钙离子 的浓度逐渐变大。对照组中，含钙镁培养基甲、含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培 养基丁和含钙镁培养基戊中剩余钙离子浓度分别为35.26mg/L、66.84mg/L、61.58mg/L、 98.42mg/L和108.95mg/L，可见随着镁离子浓度的增加钙离子的沉降会受到阻碍和抑制；实 验组中，含钙镁培养基甲、含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培 养基戊中剩余钙离子浓度分别为10.91mg/L、16.84mg/L、19.47mg/L、43.81mg/L和45.79mg/ L，实验组中的钙离子浓度明显低于对照组，说明即使有镁离子存在的情况下，解淀粉芽孢 杆菌DMS7也有促进钙离子沉降的作用。
培养过程中，各个培养基中的镁离子的变化趋势如图4所示(a为对照组，b为实验 组)。实验结果如下：
(1)接种DMS7菌剂后，培养第1天至第5天镁离子浓度基本保持不变，培养第6天至 第10天镁离子浓度急剧下降，第11天镁离子浓度仍在下降，但下降趋势变缓。
(2)培养至第11天：实验组中含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁 和含钙镁培养基戊中的镁离子浓度均在2.30～15.23mg/L之间，而对照组中镁离子浓度均 在46.36～65.33mg/L之间。可见，解淀粉芽孢杆菌DMS7在镁离子的沉降中也起到了至关重 要的作用。
实施例5、实施例4获得的矿物沉淀分析
对实施例4对照组和实验组中获得的矿物沉淀进行进一步分析。
一、X射线衍射(X-raydiffraction，XRD)分析
取实施例4步骤5中培养15天的各培养基底部沉淀，置于1.5mL离心管，静置5min， 弃上清液，然后每个离心管中各加入1mL的蒸馏水进行洗涤，静置5分钟，弃上清，洗涤三次， 以除去各种盐离子，沉淀自然干燥后进行XRD分析。XRD扫描角度为10°-90°，步长为0.02，扫 描速度8°/min。
实验结果见图5(a为对照组，b为实验组，其中Mg/Ca＝0、Mg/Ca＝3、Mg/Ca＝6、Mg/ Ca＝8和Mg/Ca＝10分别代表含钙镁培养基甲、含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培 养基丁和含钙镁培养基戊中的矿物沉淀)和表1。结果表明，解淀粉芽孢杆菌DMS7与产生三 水菱镁矿矿物沉淀有密切联系。
在实验组中，含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培养基 戊产生的矿物沉淀中含有三水菱镁矿，而对照组却没有三水菱镁矿而只有方解石或单水方 解石，因此三水菱镁矿的产生与解淀粉芽孢杆菌DMS7有关。
在实验组中，含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培养基 戊产生的矿物沉淀中，三水菱镁矿晶体(101)和(002)晶面发生了择优取向现象。标准三水 菱镁矿的(002)晶面的衍射峰强度小于(101)晶面的衍射峰强度，而DMS7诱导产生的三水菱 镁矿晶体(002)晶面的衍射峰强度却大于(101)晶面的衍射峰强度，因此，三水菱镁矿晶体 的择优取向与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DMS7有关。同时，实验组中 的含钙镁培养基丁和含钙镁培养基戊产生的三水菱镁矿的衍射峰强度要高于实验组中的 含钙镁培养基乙和含钙镁培养基丙产生的三水菱镁矿的衍射峰强度，表明实验组中含钙镁 培养基丁和含钙镁培养基戊产生的三水菱镁矿的数量多或是结晶度高。
表1.XRD分析矿物沉淀
分组及培养基类型 沉淀分析 对照组 含钙镁培养基甲 方解石 实验组 含钙镁培养基甲 方解石 对照组 含钙镁培养基乙 方解石 实验组 含钙镁培养基乙 单水方解石、三水菱镁矿 对照组 含钙镁培养基丙 单水方解石 8 --> 实验组 含钙镁培养基丙 单水方解石、三水菱镁矿 对照组 含钙镁培养基丁 单水方解石 实验组 含钙镁培养基丁 三水菱镁矿 对照组 含钙镁培养基戊 单水方解石 实验组 含钙镁培养基戊 三水菱镁矿
二、矿物沉淀的偏光显微镜分析
实验步骤如下：
1、取实施例4步骤5中培养15天的各培养基底部沉淀，置于1.5mL离心管，静置 5min。
2、完成步骤1后，弃上清液，然后每个离心管中各加入1mL的蒸馏水进行洗涤，静置 5分钟。
3、完成步骤2后，弃上清，洗涤三次，以除去各种盐离子，然后向沉淀中加入100μL 的无水乙醇进行悬浮。取部分样品置于载玻片上，自然干燥后置于偏光显微镜下观察。
实验结果见图6(a为对照组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀，b为实验组在含 钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀，c为对照组在含钙镁培养基乙中形成的矿物沉淀，d为实 验组在含钙镁培养基乙中形成的矿物沉淀，e为对照组在含钙镁培养基丙中形成的矿物沉 淀，f为实验组在含钙镁培养基丙中形成的矿物沉淀，g为对照组在含钙镁培养基丁中形成 的矿物沉淀，h为实验组在含钙镁培养基丁中形成的矿物沉淀，i为对照组在含钙镁培养基 戊中形成的矿物沉淀，j为实验组在含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀，比例尺为10μm)。结 果表明，对照组在各培养基中形成的矿物沉淀均为球形，而且随着培养基中镁钙离子摩尔 比的增大，形成的矿物的直径逐渐减小。实验组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀为球 形，在含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培养基戊中形成的矿物 既有球形又有棒状矿物，而且随着镁钙离子摩尔比的增大，棒状矿物在视野中出现的比率 在增大。
三、矿物沉淀的扫描电镜和能谱分析
取实施例4步骤5中培养15天的各培养基底部沉淀，置于1.5mL离心管，静置5min， 弃上清液，然后每个离心管中各加入1mL的蒸馏水进行洗涤，静置5分钟，弃上清，洗涤三次， 以除去各种盐离子，然后向沉淀中加入100μL的无水乙醇进行悬浮。取部分样品置于载物台 上，自然干燥后喷金，置于扫描电镜下观察，然后进行能谱分析。
实验结果如下：
图7为对照组产生的矿物沉淀的扫描电镜图，其中a为对照组在含钙镁培养基甲中 形成的矿物沉淀的表面形貌，b为对照组在含钙镁培养基乙中形成的矿物沉淀的表面形貌， c为对照组在含钙镁培养基丙中形成的矿物沉淀的表面形貌，d为对照组在含钙镁培养基丁 中形成的矿物沉淀的表面形貌，e为对照组在含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀的表面形 貌。
扫描电镜结果表明，对照组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀为菱面体的晶型 结构，菱面体矿物个体较大，属于微米级矿物，晶体生长为层式叠加生长，每层矿物的四周 均有颗粒状状物，比较粗糙，而表面却比较光滑；对照组在含钙镁培养基乙、含钙镁培养基 丙、含钙镁培养基丁或含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀为球形，并不存在菱面体矿物，该 球形矿物直径较小，为纳米级矿物。
对图7中a方框选中的区域进行能谱分析，实验结果见表2。结果表明该矿物含有C、 O和Ca这三种元素，说明形成的矿物为CaCO3，与图5中a的X射线衍射结果为方解石的结论完 全一致。
对图7中b、图7中c、图7中d和图7中e方框选中的区域进行能谱分析，实验结果见表 3、表4、表5和表6。结果表明，在含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙 镁培养基戊中形成的矿物沉淀均含有C、O和Ca这三种元素，说明形成的矿物为CaCO3，此外 还含有少量的Mg元素、Si元素和P元素，推测Mg元素和P元素可能是培养基的成分附着在矿 物表面导致的，Si元素可能来源于载物台，因为扫描电镜的载物台主要成分就是单晶硅。这 一实验结果与图5中a的X射线衍射结果完全一致。
表2.图7中a方框选中区域的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 06.29 11.39 O 46.17 62.80 Ca 47.54 25.81 Matrix Correction ZAF
表3.图7中b方框选中区域的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 08.40 14.45 O 45.29 58.44 Mg 08.17 06.94 Si 01.02 00.75 P 01.96 01.31 Ca 35.15 18.11 Matrix Correction ZAF
表4.图7中c方框选中区域的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 06.43 11.27 O 44.78 58.89 Mg 07.72 06.68 Si 01.01 00.75 P 09.44 07.09 Ca 30.62 16.07 Matrix Correction ZAF
表5.图7中d方框选中区域的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 05.81 10.19 O 45.12 59.38 Mg 07.97 07.67 Si 01.00 00.11 P 10.27 06.98 Ca 29.83 15.67 Matrix Correction ZAF
表6.图7中e方框选中区域的能谱分析
图8为实验组产生的矿物沉淀的扫描电镜图，其中a为实验组在含钙镁培养基甲中 形成的矿物沉淀的表面形貌，b为实验组在含钙镁培养基乙中形成的矿物沉淀的表面形貌， c为实验组在含钙镁培养基丙中形成的矿物沉淀的表面形貌，d为实验组在含钙镁培养基丁 中形成的矿物沉淀的表面形貌，e为实验组在含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀的表面形 貌。
扫描电镜结果表明，实验组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀为不规则形，对 图8中a方框选中的区域进行能谱分析，实验结果见表7。结果表明该矿物主要含有C、O和Ca 这三种元素，还含有少量的Na元素和Si元素，推测钠元素可能来源于培养基，Si元素可能来 源于载物台，因为扫描电镜的载物台主要成分就是单晶硅。这一实验结果与图5中b的X射线 衍射结果为方解石的结论完全一致。
实验组在含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁或含钙镁培养基戊 中形成的矿物沉淀为不规则形的颗粒状矿物和棒状矿物两种，分别对上述四种培养基中形 成的颗粒状矿物进行能谱分析，实验结果见表8、表10、表12和表14；分别对上述四种培养基 中形成的棒状矿物进行能谱分析，实验结果见表9、表11、表13和表15。结果表明，颗粒状矿 物主要含有C、O和Ca这三种元素，还含有少量的Na、Mg和Si元素，推测Na元素和Mg元素可能 来源于培养基，Si元素可能来源于载物台，因为扫描电镜的载物台主要成分就是单晶硅，由 此可知，颗粒状矿物可能为CaCO3，而图5中b进一步揭示在含钙镁培养基乙和含钙镁培养基 丙中形成的矿物沉淀含有单水方解石，因此可以断定颗粒状矿物为单水方解石；含钙镁培 养基丁和含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀进行X射线衍射分析结果(图5中b)表明没有出 现单水方解石的衍射峰，可能与单水方解石的含量太少有关或者可能是在清洗的过程中单 水方解石的颗粒较小被洗掉的缘故；棒状矿物主要含有C、O和Mg元素，还含有少量的Na、Ca 和Si元素，推测Na和Ca元素可能来源于培养基，Si元素可能来源于载物台，因为扫描电镜的 载物台主要成分就是单晶硅，由此可知，棒状矿物可能为MgCO3，而图中5b则进一步揭示在 含钙镁培养基乙、含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀 中含有三水菱镁矿，因此可以推断棒状矿物为三水菱镁矿。
表7.图8中a方框选中的区域的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 06.87 12.49 O 43.68 59.64 Na 01.64 01.56 Si 01.11 00.86 Ca 46.71 25.46 Matrix Correction ZAF
表8.图8中b方框选中的颗粒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 05.38 11.12 O 30.75 47.76 Na 00.93 01.00 Mg 01.70 01.73 Si 01.54 01.36 Ca 59.71 37.02 Matrix Correction ZAF
表9.图8中b方框选中的棒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 09.94 15.06 O 51.18 58.19 Na 00.48 00.38 Mg 22.45 16.80 Si 12.01 07.78 Ca 03.94 01.79 Matrix Correction ZAF
表10.图8中c方框选中的颗粒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 05.54 09.00 O 57.89 70.60 Na 00.52 00.44 12 --> Mg 07.46 05.99 Si 00.26 00.18 Ca 28.33 13.79 Matrix Correction ZAF
表11.图8中c方框选中的棒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 08.32 12.34 O 56.85 63.29 Na 00.31 00.24 Mg 28.27 20.71 Si 03.34 02.12 Ca 02.91 01.29 Matrix Correction ZAF
表12.图8中d方框选中的颗粒状矿物的能谱分析
表13.图8中d方框选中的棒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 05.65 08.32 O 60.75 67.21 Mg 33.61 24.47 Matrix Correction ZAF
表14.图8中e方框选中的颗粒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 C 09.78 16.53 O 43.49 55.17 Na 02.00 01.77 Mg 09.52 07.95 Si 01.34 00.96 13 --> P 03.08 02.02 Ca 30.80 15.60 Matrix Correction ZAF
表15.图8中e方框选中的棒状矿物的能谱分析
元素 重量百分比 原子百分率 CK 06.58 09.85 OK 56.18 63.17 MgK 31.42 23.25 SiK 05.81 03.72 Matrix Correction ZAF
四、矿物沉淀的高分辨率透射电镜(HighResolutionTransmissionElectron Microscopy，HRTEM)和纳米区域电子衍射联合分析
取实施例4步骤5中培养15天的各培养基底部沉淀，置于1.5mL离心管，静置5min， 弃上清液，然后每个离心管中各加入1mL的蒸馏水进行洗涤，静置5分钟，弃上清，洗涤三次， 以除去各种盐离子，然后将沉淀用玛瑙研钵充分研磨，加入无水乙醇悬浮，进行HRTEM和纳 米区域电子衍射联合分析。实验结果如下：
图9为对照组产生的矿物沉淀的高分辨率透射电镜和纳米选区电子衍射图，其中a 为对照组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀的高分辨率透射电镜图，b为对照组在含钙 镁培养基乙中形成的矿物沉淀的高分辨率透射电镜图，c为对照组在含钙镁培养基丙中形 成的矿物沉淀的纳米选区电子衍射图，d为对照组在含钙镁培养基丁中形成的矿物沉淀的 纳米选区电子衍射图，e为对照组在含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀的纳米选区电子衍 射图。
对照组在含钙镁培养基甲中形成的矿物的晶面距离d值为3.0305、2.5001、2.8531(图9中a)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中方解石的晶面间距3.0355、2.4946、和2.8437十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(104)、(110)、(006)和(0012)，表明该矿物为方解石。这一结果与X射线衍射结果相吻合。对照组在含钙镁培养基乙中形成的矿物的晶面距离d值为2.4433,2.8368和2.2864(图9中b)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中方解石的晶面间距2.4945、2.8437和2.2844十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(110)、(006)和(113)，表明该矿物为方解石。这一结果与X射线衍射结果相吻合。对照组在含钙镁培养基丙、含钙镁培养基丁和含钙镁培养基戊中所产生的矿物沉淀，在高分辨率透射电镜下分析时，均不稳定而分解，分别得到图9中c、图9中d和图9中e的纳米选区电子衍射图。这一结论表明晶体结晶度低，与图5中a中衍射峰强度低的结论相吻合。
图10为实验组产生的矿物沉淀的的高分辨率透射电镜和纳米选区电子衍射图，其 中a为实验组在含钙镁培养基甲中形成的矿物沉淀的纳米选区电子衍射图，b和c为实验组 在含钙镁培养基乙中形成的矿物沉淀的纳米选区电子衍射图，d为实验组在含钙镁培养基 丙中形成的矿物沉淀的高分辨率透射电镜图，e为实验组在含钙镁培养基丙中形成的矿物 沉淀的纳米选区电子衍射图，f为实验组在含钙镁培养基丁中形成的矿物沉淀的高分辨率 透射电镜图，g为实验组在含钙镁培养基丁中形成的矿物沉淀的纳米选区电子衍射图，h和i 为在含钙镁培养基戊中形成的矿物沉淀的高分辨率透射电镜图。
实验组在含钙镁培养基甲中形成的矿物的晶面距离d值为2.8524、2.4982、2.0776和3.0201(图10中a)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中方解石的晶面间距2.8437、2.4945、2.0942和3.0355十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(006)、(110)、(202)和(104)，表明该矿物为方解石。这一结果与X射线衍射结果相吻合。实验组在含钙镁培养基乙中形成的矿物有两种，其中一种矿物的晶面距离d值为3.4474和2.4201(图10中b)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中单水方解石的晶面间距3.4585和2.4334十分接近，因此所对应的晶面指数分别为(120)和(103)，表明该矿物是单水方解石；另外一种矿物的晶面距离d值为5.0642、3.1328、2.5261和1.6094(图10中c)，这一实验结果与PDF#70-1433卡片数据中三水菱镁矿的晶面间距4.9076、3.1297、2.5343和1.6090十分接近，因此所对应的晶面指数分别为(011)、(210)、(120)和(-231)，表明该矿物是三水菱镁矿。这一实验结果与X射线衍射结果相吻合。实验组在含钙镁培养基丙中形成的矿物也有两种，其中一种矿物的晶面距离d值为1.9920、2.9792、1.8413和1.7968(图10中d)，这一实验结果与PDF#70-1433卡片数据中三水菱镁矿的晶面间距2.0036、2.9839、1.8468和1.7989十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(313)、(-113)(-314)和(025)，表明该矿物是三水菱镁矿；另外一种矿物的晶面距离d值为2.4282和3.4513(图10中e)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中单水方解石的晶面间距2.4334和3.4585十分接近，因此所对应的晶面指数分别为(103)和(120)，表明该矿物是单水方解石。这一实验结果与X射线衍射结果相吻合。实验组在含钙镁培养基丁中形成的矿物也有两种，其中一种矿物的晶面距离d值为1.9301、1.9587、2.2635和2.1016(图10中f)，这一实验结果与PDF#70-1433卡片数据中三水菱镁矿的晶面间距1.9371、1.9465、2.2726和2.1196十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(223)、(-124)(311)和(115)，表明该矿物是三水菱镁矿；另外一种矿物的晶面距离d值为3.1413和1.6070(图10中g)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中单水方解石的晶面间距3.1460和1.6061十分接近，因此所对应的晶面指数分别为(121)和(151)，表明该矿物是单水方解石。这一实验结果与X射线衍射结果相吻合。实验组在含钙镁培养基戊中形成的矿物也有两种，其中一种矿物的晶面距离d值为2.6168、2.2401、1.9915、2.3668(图10中h)，这一实验结果与PDF#70-1433卡片数据中三水菱镁矿的晶面间距2.6202、2.2354、2.0036和2.3726十分相近，因此所对应的晶面指数分别为(021)、(023)(313)和(204)，表明该矿物是三水菱镁矿；另外一种矿物的晶面距离d值为1.9601、1.9261和1.7919(图10中i)，这一实验结果与PDF#35-0730卡片数据中单水方解石的晶面间距1.9580、1.9308和1.7897十分接近，因此所对应的晶面指数分别为(402)、(411)和(313)，表明该矿物是单水方解石。这一实验结果与X射线衍射结果相吻合。