技术领域
本发明涉及一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法。
背景技术
化学合成寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从 而将多个核苷酸单元连接为寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合 成。
目前通用的寡核苷酸合成方法采用的是固相合成法，首先将核苷酸上的 5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护， 3’-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂 结合在一起，并脱去5’-OH上的保护基，使裸露的5’-OH与第二个核苷酸的 用氨基亚磷酸化合物进行活化的3’-OH之间形成一个亚磷酸三酯，亚磷酸三 酯经碘氧化形成磷酸三酯，再加入三氯乙酸除去第二个核苷酸的5’-OH上的 保护基。至此，寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延 伸反应。经过若干轮的延伸反应，整个寡核苷酸片段合成完毕之后，用浓氢 氧化铵将寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来，经过脱保护和纯化得到寡核 苷酸。
上述固相合成法的优点在于：1)自动化，合成反应全部由合成仪自动 完成；2)合成周期短；3)产率高，单步的缩合反应一般产率大于98％。但 是固相合成法也存在一些缺点：1)合成规模小，目前较大规模的固相合成 规模一般不超过100微摩尔，远远满足不了用于药物原料的要求；2)难于 达到高纯度，由于合成方法的限制，得到的寡核苷酸不可避免的含有碱基数 N-1，N-2等非目标的寡核苷酸片段，这对于药物应用是十分不利的；3)浪 费严重，为充分反应，每个合成循环中，往往需加入数倍于反应实际消耗量 的亚磷酰胺单体以达到过量，且循环结束后需使用大量有机溶剂作为冲洗溶 剂，洗去未反应的亚磷酰胺单体，4)成本高，反应所需的固相载体和亚磷 酰胺单体价格昂贵，使合成的寡核苷酸成本高昂。
因为寡核苷酸在生命活动中的重要功能和目前核酸研究技术的高速发 展，尤其是RNA干扰技术的发展及其潜在的临床应用价值，大规模寡核苷 酸的合成意义十分重大。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前的寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本 高，不便于进行各种化学修饰等缺点，提供一种能够大规模合成带有特殊化 学修饰的寡核苷酸的方法。
本发明提供了式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸：
其中，R1表示O或S；
R2表示氢，R4表示-OR9、卤素或酰胺基，R5表示氢，或者R2、R4和与 它们相连的碳原子一起形成杂环结构，或者R4、R5和与它们相连的碳原子 一起形成杂环结构；
R9表示任选取代的烷基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的烯丙基、 硝基苯基、任选取代的二氢核黄素或具有位阻型硅烷结构的基团；
R3为氢或卤素；
R6表示卤素原子、硝基或任选取代的烷氧基；
R7表示氢或R72，R72表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯 甲基或三甲氧基三苯甲基；
R8表示单键或不存在；
B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤 基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基；
n为1-100的整数，
各个重复单元中的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8和B相同或不同，并 且在至少一个重复单元中，R4、R1和R8不同时表示-OR9(R9表示具有位阻 型硅烷结构的基团)、O和单键。
其中，所述位阻型硅烷结构的基团可以为叔丁基二甲基硅基、苯基二甲 基硅基、叔丁基二苯基硅基或三异丙基硅基。
其中，所述酰基可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；卤素原子可以为 氯或溴。
本发明提供的式(1)的化合物中，当R7为H时，式(1)与如下所述 的x大于等于1时的式(2)等价；当R7为R72时，式(1)与如下所述的式 (4)等价。
本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在 于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物 与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式(4) 的化合物；
其中，
R11表示O或S；
R21表示氢，R41表示-OR91、卤素或酰胺基，R51表示氢，或者R21、R41和与它们相连的碳原子一起形成杂环结构，或者R41、R51和与它们相连的碳 原子一起形成杂环结构；
R91表示任选取代的烷基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的烯丙基、 硝基苯基、任选取代的二氢核黄素或具有位阻型硅烷结构的基团，并且当 R91表示具有位阻型硅烷结构的基团时，R11表示S；
R31为氢或卤素；
R61表示卤素原子、硝基或甲氧基；
R81表示单键或不存在；
R12表示O或S；
R22表示氢，R42表示-OR92、卤素或酰胺基，R52表示氢，或者R22、R42和与它们相连的碳原子一起形成杂环结构，或者R42、R52和与它们相连的碳 原子一起形成杂环结构；
R92表示任选取代的烷基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的烯丙基、 硝基苯基、任选取代的二氢核黄素或具有位阻型硅烷结构的基团，并且当 R92表示具有位阻型硅烷结构的基团时，R12表示S；
R32为氢或卤素；
R62表示卤素原子、硝基或甲氧基；
R82表示单键或不存在；
R72表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基 三苯甲基；
B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保 护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基；
A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；
x为0-50的整数；y为1-50的整数，
各个重复单元中的R11、R21、R31、R41、R51、R61、R81、B1、R12、R22、 R32、R42、R52、R62、R82和B2相同或不同，并且在至少一个重复单元中，R41、 R11和R81不同时表示-OR91(R91表示具有位阻型硅烷结构的基团)、O和单 键，或者R42、R12和R82不同时表示-OR92(R92表示具有位阻型硅烷结构的 基团)、O和单键。
本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，可以具有生物活性， 可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。
本发明提供的液相合成制备核苷酸和/或寡核苷酸的方法，包括了一种 核苷酸和/或寡核苷酸保护基组合方法和化学修饰方法，通过在2’-羟基被保 护或被其他化学基团修饰的前提下，用β-氰乙基直接保护核苷酸和/或寡核 苷酸的3’磷酸基团，而不使用固相载体，使得式(4)化合物在脱去β-氰乙 基后能够直接参与下一轮的合成，且合成产物与固相合成法脱保护程序一 致，纯度更高。
本发明由于在液相中进行反应，不需要使用固相载体，又由于底物不需 数倍过量，节省了原料，降低了成本。本发明采用保护的核苷酸和/或寡核苷 酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪 的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。并且，本发明提供的是修 饰的核苷酸和/或寡核苷酸，通过对核苷酸的糖环结构进行适当的修饰，可以 改良所合成的寡核苷酸的性质，使其具有更优的生物功能或化学功能，如增 加其稳定性，增强其生物活性等，并可引入一些特殊的官能团，使人工合成 的寡核苷酸具有特殊的性质，如可以引入荧光基团等。
附图说明
图1为实施例2制得的产物的质谱图；
图2为实施例2制得的产物与标准样品的电泳图；
图3为表示实施例1和实施例2制得的产物经退火后得到的双链siRNA 的干扰活性的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸。
在式(1)中：
R1可以为O或S。
R2可以为氢，R4可以为-OR9、卤素或酰胺基，且R5可以为氢。R9可以 为任选取代的烷基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的烯丙基、硝基苯基、 任选取代的二氢核黄素或具有位阻型硅烷结构的基团。
所述酰胺基可以为苯甲酰胺、乙酰胺或异丁酰胺。
在本发明中，“任选取代的”是指所述基团可以被取代或者没有被取代。 取代基可以为卤素。烷基的碳原子数可以为1-10，优选为1-6，烷基的优选 的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。烷 氧基烷基的碳原子数可以为2-20，优选为2-10，烷氧基烷基的优选的例子包 括甲氧基乙基、乙氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基丙基。所述硝基苯基可以 为2，4-二硝基苯基。具有位阻型硅烷结构的基团可以为各种具有位阻和保护 功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基硅基、苯基二甲基硅基、叔丁基二苯 基硅基或三异丙基硅基，更优选为叔丁基二甲基硅基。
或者R2和R4可以和与它们相连的碳原子一起形成杂环结构。该杂环结 构可以为5-7元环。该杂环结构中的杂原子可以为O、S和N中的一者以上。
或者R4、R5可以和与它们相连的碳原子一起形成杂环结构。该杂环结 构可以为3-7元环。该杂环结构中的杂原子可以为O、S和N中的一者以上。
R3可以为氢或卤素。
R6可以为卤素原子、硝基或任选取代的烷氧基。烷氧基的碳原子数可以 为1-10，优选为1-6，烷氧基的优选的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。 R6在苯环上的位置没有限制，可以为邻位、间位或对位。
R7可以为氢或R72，R72表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三 苯甲基或三甲氧基三苯甲基。
R8可以为单键或不存在。当R8不存在时，式(1)中的戊环形成为开环 结构。
n理论上可以为任意正整数，优选为1-100的整数，更优选为1-50的整 数，更进一步优选为1-30的整数。
B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤 基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。
在式(1)中，n＝1时，上述式(1)表示的是核苷酸，R4和R1不同时 表示-OR9(R9表示具有位阻型硅烷结构的基团)和O。n为大于1的整数时， 上述式(1)表示的是寡核苷酸，各个重复单元的R1、R2、R3、R4、R5、R6、 R8可以相同也可以不同，并且在至少一个重复单元中，R4、R1和R8不同时 表示-OR9(R9表示具有位阻型硅烷结构的基团)、O和单键。也就是说，至 少一个重复单元是修饰的核苷酸。在式(1)表示的寡核苷酸中，修饰的核 苷酸即R4、R1和R8不同时表示-OR9(R9表示具有位阻型硅烷结构的基团)、 O和单键的重复单元的个数可以为一个或多个。
当n为大于1的整数时，式(1)表示的寡核苷酸的一端的核苷酸具有 R7，而另一端的核苷酸具有-OC2H4CN，每一核苷酸的糖环的5’位的氧与相 邻的核苷酸的磷相连。
在式(1)中，作为保护基的各个所述酰基可以相同或不同，各自可以 为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
在本发明中，所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
本发明提供的式(1)的化合物中，当R7为H时，式(1)与如下所述 的x大于等于1时的式(2)等价；当R7为R72时，式(1)与如下所述的式 (4)等价，而且，当R7为R72时，式(1)与如下所述的式(6)等价。
本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在 于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物 与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物。
在式(2)、式(3)或式(4)中：
x理论上可以为任意非负整数，优选为0-50的整数，更优选为0-25的 整数，更进一步优选为0-15的整数；y理论上可以为任意正整数，优选为 1-50的整数，更优选为1-25的整数，更进一步优选为1-15的整数。
B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保 护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基； 所述酰基的定义如式(1)中所述。
R11和R12的定义与式(1)中的R1相同。
R21和R22的定义与式(1)中的R2相同。
R31和R32的定义与式(1)中的R3相同。
R41和R42的定义与式(1)中的R4相同。
R51和R52的定义与式(1)中的R5相同。
R61和R62的定义与式(1)中的R6相同。
R72的定义与式(1)中的R72相同。
R81和R82的定义与式(1)中的R8相同。
R91和R92的定义与式(1)中的R9相同。
在式(2)中，在至少一个重复单元中，R41、R11和R81不同时表示-OR91(R91表示具有位阻型硅烷结构的基团)、O和单键，和/或在式(3)中，在 至少一个重复单元中，R42、R12和R82不同时表示-OR92(R92表示具有位阻 型硅烷结构的基团)、O和单键。式(2)和式(3)中的至少一个重复单元 是修饰的核苷酸。
A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；所述的三烷基铵离子或二烷基铵 离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有 1-4个碳原子。
所述缩合反应所使用的缩合剂以及缩合反应的条件是本领域普通技术 人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，可以使用1-均三甲苯磺酰 三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基 苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑 中的一种或多种作为缩合剂；可以使用吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和 四氢呋喃中的一种或多种作为所述第一液态反应介质；
所述缩合反应条件可以包括：相对于1摩尔的式(3)的化合物，在x 等于0时，即式(2)的化合物为3-羟基丙腈时，式(2)的化合物的用量可 以为1-5摩尔，优选可以为1.2-3摩尔，更优选可以为1.5-2摩尔；在x大于 等于1时，式(2)的化合物的用量可以为0.3-1.25摩尔。
相对于1摩尔的式(3)的化合物，缩合剂的用量可以为2-20摩尔，优 选可以为2-5摩尔。
相对于1摩尔的式(3)的化合物，第一液态反应介质的用量可以为2-50 升，优选可以为2-30升。
反应温度可以为0-50℃，优选可以为20-40℃；反应时间可以为0.5-100 小时，优选可以为1-10小时。
缩合反应完成之后，可以终止缩合反应，并分离出产物。所述终止缩合 反应的方法以及分离出产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对 其没有特别的限制。
例如，所述终止缩合反应的方法，可以为在0-15℃下，将反应溶液与 水混合5-30分钟，相对于1升的第一液态反应介质，水的用量可以为0.05-0.2 升。
所述终止缩合反应的方法，也可以为将反应溶液与饱和碳酸氢钠溶液混 合，在0-50℃下，在搅拌条件下保持5-10分钟。饱和碳酸氢钠溶液与所述 第一液态反应介质的体积比可以为0.05-0.2∶1。
所述分离的方法，在需要将式(4)的化合物进行如下所述的置换反应 时，可以包括：将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂，再溶于有机溶剂， 用酸调节pH值到3-5，用水洗涤一次或多次，相对于1升的第一液态反应 介质，有机溶剂的用量为2-20升，洗涤用的水的用量为2-20升，用无水硫 酸钠干燥有机相后，再次旋转蒸除溶剂，常压柱分离即得产物。所述的有机 溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种，所述的酸可以 是浓度为1-10重量％的草酸和/或醋酸。
所述分离的方法，在需要将式(4)的化合物进行如下所述的水解反应 或脱去全部保护基时，可以包括将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂后与 有机溶剂混合，加入饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤，将有机相干燥、过滤、浓 缩、常压柱分离，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷 和乙酸乙酯中的一种或多种。所述有机溶剂与所述第一液态反应介质的体积 比可以为2-20∶1。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的饱和碳酸氢钠 溶液的总体积与所述第一液态反应介质的体积比可以为2-20∶1。所述干燥、 过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
因此，根据本发明的第一种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸 和/或寡核苷酸的方法，还可以包括在第二液态反应介质中，在三烷基胺或二 烷基胺存在下，在水解反应的条件下，将式(4)的化合物与水接触发生水 解反应，脱去β-氰乙基，得到脱去β-氰乙基的水解后的产物。
其中，所述水解反应的条件可以包括：相对于1摩尔的式(4)的化合 物，三烷基胺或二烷基胺的用量可以为1-200摩尔，优选为40-150摩尔；第 二液态反应介质的用量可以为5-50升，优选为5-40升；水的用量可以为2-20 升，优选为2-15升；反应温度可以为0-50℃，优选为10-35℃；反应时间可 以为0.25-2小时，优选为0.25-1小时。
其中，所述的第二液态反应介质优选为吡啶和/或乙腈。
所述的三烷基胺或二烷基胺中的各个烷基相同或不同，并且各自具有 1-6个碳原子。例如，所述三烷基胺可以为三甲胺、三乙胺和二异丙基乙基 胺中的一种或多种，所述二烷基胺可以为二甲胺、二乙胺和二异丙基胺中的 一种或多种。
所述水解反应完成之后，可以分离出水解反应后的产物。分离出水解反 应后的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限 制，例如，该分离方法可以包括：将反应液旋转蒸除溶剂，再用有机溶剂溶 解，加入洗涤溶液进行洗涤，分液得到有机相，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去 溶剂，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯 中的一种或多种，所述有机溶剂与所述第二液态反应介质的体积比可以为 1-10∶1。所述的洗涤溶液可以为0.1-1摩尔/升浓度的三乙胺碳酸氢盐(TEAB) 水溶液或饱和碳酸氢钠溶液。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的TEAB 水溶液的总体积与所述第二液态反应介质的体积比可以为1-10∶1。
然后，可以将分离出的所述水解后的产物作为所述式(3)的化合物， 与所述式(2)的化合物再次进行如前所述的缩合反应。
根据本发明的第二种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸和/或 寡核苷酸的方法，还可以包括在第三液态反应介质中，在有机酸存在下，在 置换反应条件下，将式(4)的化合物的R72基团置换为氢，得到R72基团被 置换为氢的产物。
其中，所述的置换反应条件可以为：相对于1摩尔的式(4)的化合物， 有机酸的使用量可以为2-20摩尔，优选为2-10摩尔；第三液态反应介质的 用量可以为10-150升，优选为10-130升；反应温度可以为-10℃至40℃，优 选为-10℃至30℃；反应时间可以为1-60分钟，优选为1-20分钟；所述有机 酸优选选自甲苯磺酸、苯磺酸、三氯乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸中的一种或 多种；所述的第三液态反应介质可以为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和甲醇中 的一种或多种。
其中，所述的置换反应完成之后，可以分离出R72基团被置换为氢的产 物。分离出R72基团被置换为氢的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的， 本发明对其没有特别的限制，例如，该分离纯化的方法可以包括用碱溶液中 和置换反应所得的混合物，分液得到有机相，再用碱溶液洗涤一次到多次， 将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到纯化的置换反应后的产 物。相对于1升的第三液态反应介质，洗涤用的碱溶液用量可以为0.2-1升， 所述的碱溶液可以为饱和的碳酸氢钠水溶液、饱和的碳酸氢钾水溶液或饱和 的碳酸钠溶液。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术 人员所公知，在此不再赘述。
然后，可以将分离出的R72基团被置换为氢后的产物作为所述式(2)的 化合物，与所述式(3)的化合物再次进行如前所述的缩合反应。
当x大于等于1时，式(2)的化合物可以通过将式(6)的化合物的 R72基团置换为氢而得到；
其中，x、B1、R21、R31、R41、R51、R61、R71、R81、R91的定义如式(2) 中所述，但x大于等于1；R72的定义如式(3)中所述。
所述的将式(6)的化合物的R72基团置换为氢的方法，按照将式(4) 的化合物的R72基团置换为氢的方法进行，不同的是用式(6)的化合物代替 式(4)的化合物。
所述式(6)的化合物的制备方法包括：将式(5)的化合物作为式(3) 的化合物，与x等于0时的式(2)的化合物，即3-羟基丙腈，进行如前所 述的缩合反应。
其中，x、B1、R21、R31、R41、R51、R61、R71、R81、R91的定义如式(2) 中所述，但x大于等于1；R72和A+的定义如式(3)中所述。
当式(3)中的y与式(5)中的x相等时，式(3)等价于式(5)。
以x等于1(或y等于1)为例，式(3)的化合物和/或式(5)的化合 物可以如反应式I所示的反应制备得到，即在催化剂存在下将式(8)的化 合物、式(9)的化合物和三烷基胺在反应介质中反应而得到：
所述催化剂可以选自1，2，4-三唑、三乙胺、吡啶中的一种或几种。
所述反应介质可以选自二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃中的一种或几种，
在式(8)和式(9)中，B1、R21、R31、R41、R51、R61、R71、R81、R91的定义如式(2)中所述；R72和A+的定义如式(3)中所述。R13和R14各自 表示卤素原子(氯或溴)。
反应式I所示的反应的条件可以包括：反应温度可以为-10℃至10℃， 优选在冰浴中进行；反应分为两步进行，第一步反应时间可以为0.5-10小时， 优选为1-3小时。
相对于1摩尔的式(8)的化合物，式(9)的化合物的用量可以为1-5 摩尔，优选为1.5-3摩尔；三烷基胺的用量可以为1-50摩尔，优选为3-20 摩尔；催化剂的用量可以为2-10摩尔，优选为2-6摩尔；所述反应介质的用 量可以为5-200升，优选为10-100升。
反应第一步完成后，将反应溶液与碳酸氢三乙胺盐的水溶液混合，在搅 拌条件下保持10-90分钟，碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.1-1摩 尔/升，碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为0.2-2；然 后直接将有机相和水相分开，有机相用碳酸氢三乙胺盐的水溶液洗涤，将所 有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。洗涤用的碳酸氢 三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.1-1摩尔/升，所述洗涤可以进行一次或多 次，洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为 0.5-5。
式(8)表示的非修饰的核苷化合物可以为：
R’表示位阻型硅烷保护基团。
式(8)表示的修饰的核苷化合物的具体例子可以包括(X表示A，U， C，G中的一种)：
对于长片段的小核酸，本发明提供了模块化的合成策略，例如对于21 聚的核酸链，将其拆分成4个并行的5-6聚的片段，5-6聚短片段再拆分成 并行的更多的2-3聚短片段。经过合成所述的2聚短片段，然后可以合成所 述的3聚到n聚(n为目的长度)的寡核酸链。因此，理论上，采用本发明 提供的方法可以合成任意长度的寡核酸链，以下实施例仅以最长为21聚体 为例对本发明进行说明。
通过本发明所提供的方法，可以合成具有式(4)的全保护的核苷酸和/ 或寡核苷酸。所述全保护的核苷酸和/或寡核苷酸的全部保护基团包括：式(4) 中的酰基、β-氰乙基、式(10)和式(11)的基团、R72、以及R41和R42(其 中，R41和R42分别为-OR91和-OR92，且R91和R92为具有位阻型硅烷结构的 基团)。
其中R3的定义与式(4)相同。
可以分2步将所述全保护的核苷酸和/或寡核苷酸脱去所述的全部保护 基团：
第1步，将式(4)化合物在第四液态反应介质中，在第一脱保护反应 条件下，与氨水接触，脱去部分类别的保护基团，得到脱去部分类别的保护 基团的产物；所述的部分类别的保护基团为式(4)中的酰基、β-氰乙基、 式(10)和式(11)的基团中的一种或多种。
其中，所述的第四液态反应介质可以为二氧六环、乙腈、吡啶、乙醇和 甲醇中的一种或多种；所述的第一脱保护反应条件包括，相对于1克的式(4) 的化合物，氨水的用量可以为0.02-0.5L，优选为0.05-0.3L；第四液态反应 介质的用量可以为0.01-0.2L，优选为0.02-0.1升；反应温度可以为10-60℃， 优选为10-30℃；反应时间可以为5-100小时，优选为10-60小时；其中所述 氨水的浓度为25-28质量％。第一脱保护反应完成后，可以通过减压浓缩， 除去溶剂至完全干燥，得到的固体即为脱去部分类别的保护基团的产物。
第2步，在第五液态反应介质中，在第二脱保护反应条件下，将所述脱 去部分类别的保护基团的产物与三乙胺三氢氟酸(TEA·3HF)接触，脱去剩 余类别的保护基，得到脱去全部保护基团的产物；所述剩余类别的保护基为 R1和R2，其中R1和R2的定义与式(4)相同。
其中，所述的第五液态反应介质为二甲基亚砜；所述的第二脱保护反应 条件包括：相对于1克的脱去部分保护基团的产物，三乙胺三氢氟酸的用量 为0.002-0.05L，优选为0.005-0.03L；第五液态反应介质的用量为0.002-0.05L， 优选为0.005-0.03L；反应温度为40-85℃，优选为50-75℃；反应时间为1-5 小时，优选为2-4小时。
所述脱保护反应完成之后，可以分离出脱保护反应后的产物。分离出脱 保护反应后的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特 别的限制，例如，分离的方法可以为：向反应液中加入预冷的正丁醇，沉淀 核苷酸和/或寡核苷酸，离心收集沉淀，得到核苷酸和/或寡核苷酸粗品。
可以对得到的核苷酸和/或寡核苷酸粗品进行纯化，纯化核苷酸和/或寡 核苷酸粗品的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限 制，例如，纯化的方法可以为：将核苷酸和/或寡核苷酸粗品上样于反相十八 烷基硅烷键合硅胶填料(ODS)色谱，收集流出液，然后将流出液冷冻干燥， 得到目标产物。
本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，具有生物活性，可以 用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。
在本发明中所使用的气体和液体体积均指1个标准大气压下、20℃时的 体积。
下面通过实施例更详细地描述本发明。
实施例中所用到的原料的获取方式如下：
以上各种保护的核苷单体或修饰的核苷单体购自上海吉玛制药技术有 限公司或中国医药研究开发中心有限公司；
三乙胺：购自天津市北方天医化学试剂厂；
1，2，4-三唑：购自Alfa Aesar；
2-氯苯基二氯代磷酸酯：购自Alfa Aesar；
1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑(MSNT)购自上海共价化学科技有限公 司。
实施例1
该实施例合成核苷酸。
注：中括号内A、U、C、G、T五个字母表示核苷的碱基种类，用字母 右上角的标注表示核苷修饰的种类，其环外氨基已用苯甲酰基保护，2’位羟 基已被叔丁基二甲基硅甲烷基保护或其他官能团修饰，略去碱基之间的磷酸 酯及磷酸苯酚酯保护基；
中括号左边的基团表示5’末端的保护基，为二对甲氧三苯甲基(DMTr)， 中括号左边的基团也可以为羟基(HO)；
中括号右边的基团表示3’末端的磷酸丙腈酯保护基(OE)，中括号右边 的基团也可以为磷酸盐(PO-)。
(1)合成式(3)的化合物单体DMTr[A]PO-：
在1L圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(13.8g，200mmol)和无水吡啶(31.6g， 400mmol)，用130ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下滴加2-氯苯基二氯代磷酸 酯(19.6g，80mmol)的二氯甲烷溶液65ml，搅拌反应0.5h，再滴加保护的 腺嘌呤核糖核苷酸(39.4g，50mmol)的二氯甲烷溶液150ml，冰浴条件下 搅拌反应2h后加入150ml浓度为1M的TEAB溶液，继续搅拌10分钟后， 用1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次90ml)后，全部有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸除去溶剂，得到产品54.0g，产率100％。产率是产物的 重量与按保护的腺嘌呤核糖核苷酸计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)δ-6.09， 与五价磷酸二酯的31PNMR理论值范围相符(请见参考文献Tetrahedron 1980 (36)P3075-3085)，证明该产物确实具有式(3)的结构。
用ESI-MS检测得到产物M-为976.2915，与目标产物的M-理论值完全 相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(2)合成式(3)的化合物单体DMTr[U]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的尿嘧啶核 糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(3)合成式(3)的化合物单体DMTr[G]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的鸟嘌呤核 糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(4)合成式(3)的化合物单体DMTr[C]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的胞嘧啶核 糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(5)合成式(3)的化合物单体DMTr[CLNA]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为CLNA修饰的胞嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(6)合成式(3)的化合物单体DMTr[UMe]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为UMe修饰的尿嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(7)合成式(3)的化合物单体DMTr[CMe]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为Cme修饰的胞嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(8)合成式(3)的化合物单体DMTr[UF]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为UF修饰的尿嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(9)合成式(3)的化合物单体DMTr[CF]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为CF修饰的胞嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(10)合成式(3)的化合物单体DMTr[Cthio]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为Cthio修饰的胞嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(11)合成式(3)的化合物单体DMTr[UUNA]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护且带有表示 为UUNA修饰的尿嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(12)合成式(2)的化合物单体HO[A]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(17.3g，16mmol)， 无水吡啶(100ml)溶解后，加入3-羟基丙腈(1.70g，24mmol)，再加入 MSNT(13.3g，44.8mmol)。20℃反应2h，薄层层析色谱(TLC)显示完全 反应，加入水(10ml)终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于CH2Cl2(200ml)， 加入适量5重量％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分液得到有机相，再用水 (100ml)洗一次，有机相无水Na2SO4干燥，再次旋蒸除去溶剂，加入2重 量％的对甲苯磺酸(TsOH)的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液(700ml)， 0℃强烈搅拌5分钟，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分液得到有机相，再 用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗一次，有机相用无水Na2SO4干燥后除去溶 剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得到产物10.9g， 产率93.4％。产率是产物的重量与按DMTr[A]PO-计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)δ-7.66， -7.79，与五价磷酸三酯的31PNMR理论值相符，证明该产物确实具有式(2) 的结构。
用ESI-MS检测得到该产物的M-为728.1956，与目标化合物的M-理论 值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(13)合成式(2)的化合物单体HO[U]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到 的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(14)合成式(2)的化合物单体HO[G]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(3)得到 的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(15)合成式(2)的化合物单体HO[C]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(4)得到 的DMTr[C]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(16)合成式(2)的化合物单体HO[UMe]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(6)得到 的DMTr[UMe]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(17)合成式(2)的化合物单体HO[Cthio]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(10)得到 的DMTr[Cthio]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(18)合成式(2)的化合物单体HO[UF]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(8)得到 的DMTr[UF]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(19)合成式(2)的化合物单体HO[UUNA]OE：
按照与步骤(12)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(11)得到 的DMTr[UUNA]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
步骤(20)至(40)：
合成全保护的DMTr[CLNACUUMeGAGGCmAUMeACUUCthioAAAUUUNA]OE
(20)合成式(4)的二聚体DMTr[AA]OE：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(2.59g， 2.40mmol)，步骤(12)得到的HO[A]OE(1.46g，2.00mmol)，10ml无水吡 啶溶解后，加入MSNT(1.66g，5.60mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反 应，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于50ml的 CH2Cl2中，饱和NaHCO3溶液洗涤2次(每次30ml)，有机相用无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化， 得到产品3.26g。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)δ-7.36， -7.46，-7.55，-7.90，与含有2个五价磷酸三酯结构的31PNMR理论值相符， 证明该产物确实具有式(4)的结构。
用ESI-MS检测得到该产物的M-为1687.64，与目标化合物的M-理论值 相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
(21)合成二聚体DMTr[AA]PO-：
将步骤(20)纯化出的DMTr[AA]OE溶于60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶ v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应，将反应液旋蒸除去溶 剂后再溶于100ml的CH2Cl2中，用浓度为1M的TEAB溶液洗涤三次(每 次50ml)，分液得到有机相，无水Na2SO4干燥有机相后除去溶剂，得到产 品3.20g，步骤(20)和步骤(21)反应总产率93.9％。产率是产物的重量 与按HO[A]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(22)合成二聚体DMTr[GG]PO-：
按照与步骤(20)和步骤(21)相同的方法进行合成，不同的是，用步 骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(14) 得到的HO[G]OE代替步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(23)合成二聚体DMTr[AC]PO-：
按照与步骤(20)和步骤(21)相同的方法进行合成，不同的是，用步 骤(15)得到的HO[C]OE代替步骤(12)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(24)合成二聚体HO[AUMe]OE
在500ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(16.2g，15mmol)， 100ml无水吡啶溶解后，加入步骤(16)得到的HO[UMe]OE(6.26g，12.5mmol)， 加入MSNT(10.4g，35mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入10ml 水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于300ml CH2Cl2，加入适量5％的草酸水 溶液调节pH值到3-4，分液得到有机相，再用150ml水洗涤一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去溶剂，加入2重量％的甲苯磺酸(TsOH)的 CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液(700ml)，0℃强烈搅拌5分钟，立即用 饱和NaHCO3溶液中和，分液得到有机相，再用饱和NaHCO3溶液(300ml) 洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为 CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得产品12.1g。产率83.2％。产率是产 物的重量与按HO[UMe]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(25)合成二聚体HO[CU]OE：
按照与步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(4)得到 的DMTr[C]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(13)得到的 HO[U]OE代替步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(26)合成二聚体HO[GA]OE：
按照与步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(3)得到 的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(12)得到的 HO[A]OE代替步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(27)合成二聚体HO[UCthio]OE：
按照与步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到 的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(17)得到的 HO[Cthio]OE代替步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(28)合成二聚体HO[UUUNA]OE：
按照与步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到 的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(19)得到的 HO[UUNA]OE代替步骤(16)得到的HO[UMe]OE
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(29)合成三聚体DMTr[CLNACU]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(5)得到的DMTr[CLNA]PO-(2.86g， 3.00mmol)，步骤(25)得到的HO[CU]OE(3.09g，2.50mmol)，20ml无水 吡啶溶解后，加入MSNT(2.08g，7.00mmol)，室温反应2h，TLC显示完全 反应，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于100ml CH2Cl2，用50ml饱和NaHCO3溶液洗涤，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1)) 纯化。经纯化的产品溶于60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅 拌30分钟，TLC显示完全反应后，将反应液旋蒸除去溶剂后，再溶于100ml CH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相，无水 Na2SO4干燥后除去溶剂，得产品4.82g，产率91.3％。产率是产物的重量与 按HO[CU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(30)合成三聚体HO[UMeGA]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(6)得到的DMTr[UMe]PO-(8.95g， 10.5mmol)，步骤(26)得到的HO[GA]OE(12.0g，8.76mmol)，50ml无水 吡啶溶解后，分3次加入MSNT(7.31g，24.5mmol)，室温反应2h，TLC显 示完全反应，加入5ml水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于200ml CH2Cl2， 加入适量5％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分出有机相，再用100ml水洗 一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去容积，加入550ml 2％的TsOH 的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌5分钟后，立即用饱和 NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用200ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有 机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶ v＝10∶1))纯化。得到产品12.8g，产率81.3％。产率是产物的重量与按 HO[GA]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(31)合成三聚体HO[CMcAUMe]OE：
按照与步骤(30)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(7)得到 的DMTr[CMe]PO-代替步骤(6)得到的DMTr[UMe]PO-，用步骤(24)得到 的HO[AUMe]OE代替步骤(26)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(32)合成三聚体HO[UUCthio]OE：
按照与步骤(30)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到 的DMTr[U]PO-代替步骤(6)得到的DMTr[UMe]PO-，用步骤(27)得到的 HO[UCthio]OE代替步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(33)合成三聚体HO[AUUUNA]OE：
按照与步骤(30)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-代替步骤(6)得到的DMTr[UMe]PO-，用步骤(28)得到的 HO[UUUNA]OE代替步骤(26)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(34)合成六聚体DMTr[CLNACUUMeGA]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(29)得到的DMTr[CLNACU]PO-(4.0g， 1.89mmol)，步骤(30)得到的HO[UMeGA]OE(2.84g，1.58mmol)，10ml 无水吡啶溶解后，再加入MSNT(1.31g，4.42mmol)，室温反应3h，TLC显 示完全反应后，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后柱 层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化。将纯化后的产物溶于 60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完 全反应后，将反应液旋蒸除去溶剂后再溶于100ml CH2Cl2，1M浓度的TEAB 溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，得 产品4.75g，产率78.2％。产率是产物的重量与按HO[UMeGA]OE计算的理论 产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(35)合成五聚体DMTr[ACUUCthio]PO-：
按照与步骤(34)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(23)得到 的DMTr[AC]PO-代替步骤(29)得到的DMTr[CLNACU]PO-，用步骤(32) 得到的HO[UUCthio]OE代替步骤(30)得到的HO[UMeGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(36)合成五聚体HO[GGCMeAUMe]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(22)得到的DMTr[GG]PO-(5.72g， 3.36mmol)，步骤(31)得到的HO[CMeAUMe]OE(4.79g，2.80mmol)，15ml 无水吡啶溶解后，加入MSNT(2.34g，7.84mmol)，室温反应2h，TLC显示 完全反应，加入1.5ml水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于100ml CH2Cl2， 加入适量5％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分出有机相，再用50ml水洗 一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去容积，加入170ml 2％的TsOH 的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌5分钟后，立即用饱和 NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用80ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有 机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶ v＝10∶1))纯化。得到产品5.3g，产率63.6％。产率是产物的重量与按 HO[CMeAUMe]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(37)合成五聚体HO[AAAUUUNA]OE：
按照与步骤(36)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(21)得到 的DMTr[AA]PO-代替步骤(22)得到的DMTr[GG]PO-，用步骤(33)得到 的HO[AUUUNA]OE代替步骤(31)得到的HO[CMeAUMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(38)合成十一聚体DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMe]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(34)得到的DMTr[CLNACUUMeGA]PO-(4.62g，1.20mmol)，步骤(36)得到的HO[GGCMeAUMe]OE(3.10g，1.0mmol)， 10ml无水吡啶溶解后，再加入MSNT(0.83g，2.80mmol)，室温反应4h， TLC显示完全反应，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入 100mlCH2Cl2，再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，再用50ml水洗一次， 无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶ v＝10∶1))纯化，纯化产品溶于40ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)， 室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应，将反应液旋蒸除去溶剂后再溶于 100mlCH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相， 无水Na2SO4干燥有机相，除去溶剂，得产品2.89g，产率42.7％。产率是 产物的重量与按HO[GGCMeAUMe]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(39)合成十聚体HO[ACUUCthioAAAUUUNA]OE
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(35)得到的DMTr[ACUUCthio]PO-(4.28g， 1.43mmol)，步骤(37)得到的HO[AAAUUUNA]OE(3.70g，1.19mmol)，10ml 无水吡啶溶解后，再加入MSNT(0.99g，3.33mmol)，室温反应4h，TLC显 示完全反应，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入100ml CH2Cl2， 再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干 燥有机相，旋蒸除去溶剂，过柱分离，得到的产品加入150ml 2％的TsOH的 CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌10分钟，立即用饱和NaHCO3 溶液中和，分出有机相，再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有机相无水 Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1)) 纯化得产品4.6g。产率63.5％。产率是产物的重量与按HO[AAAUUUNA]OE 计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(40)合成二十一聚体DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMeACUUCthioAAAUUUNA]OE：
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(38)得到的 DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMe]PO-(2.80g，0.40mmol)，步骤(39)得到 的HO[ACUUCthioAAAUUUNA]OE(2.10g，0.36mmol)，10ml无水吡啶溶解 后，再加入MSNT(321mg，1.08mmol)，室温反应10h，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入100ml CH2Cl2，用50ml的饱和NaHCO3溶液洗一次， 再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干燥有机相，旋蒸除去溶剂，柱层析(淋 洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化，得到产物2.46g，产率51.3％。 产率是产物的重量与按HO[ACUUCthioAAAUUUNA]OE计算的理论产量的百 分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
至此，用液相法合成得到了全保护的二十一聚体核糖核酸 DMTr[[CLNACUUMeGAGGCMeAUMeACUUCthioAAAUUUNA]OE。
(41)脱保护：
将10mg步骤(40)得到的全保护的二十一聚体核糖核酸 DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMeACUUCthioAAAUUUNA]OE溶于0.5ml的二 氧六环中，再加入1ml 25质量％浓度的氨水，振荡混匀，室温放置40h。反 应完成后，减压浓缩，除去溶剂至完全干燥。将残余的固体重溶于100μl二 甲基亚砜，再加入125μl TEA·3HF，混匀后，加热至65℃，反应2.5h后， 加入1ml预冷至-20℃的正丁醇，沉淀寡核苷酸，离心收集沉淀，得到3mg 粗品。经过反向ODS柱色谱精制纯化，具体的操作步骤参照文献(分子克 隆实验指南(第三版)，科学出版社2002年9月出版)进行，然后冷冻干燥， 得到1.8mg目标产物。
实施例2
该实施例合成脱保护的，并且具有目标序列为 5’-UUMeUGAAGUFAUGCCUCFAAGGUU-3’的寡核苷酸。
(1)合成具有式(2)的二聚体HO[UMeU]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(6)得到的DMTr[UMe]PO-代替实施例1中的步骤(1)得 到的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(13)得到的HO[U]OE代替实施 例1中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(2)合成具有式(2)的二聚体HO[GA]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(12)得到的HO[A]OE代替实施例1 中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(3)合成具有式(2)的二聚体HO[AU]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(13)得到的HO[U]OE代替实施例1中的步骤(16)得到 的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(4)合成具有式(2)的二聚体HO[CC]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(4)得到的DMTr[C]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(15)得到的HO[C]OE代替实施例1 中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(5)合成具有式(2)的二聚体HO[CFA]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(9)得到的DMTr[CF]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(12)得到的HO[A]OE代替实施例1 中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(6)合成具有式(2)的二聚体HO[GG]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(14)得到的HO[G]OE代替实施例1 中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(7)合成具有式(2)的二聚体HO[UU]OE：
按照与实施例1中的步骤(24)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到 的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(13)得到的HO[U]OE代替实施例1 中的步骤(16)得到的HO[UMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(8)合成二聚体DMTr[AG]PO-：
按照与实施例1中的步骤(20)和步骤(21)相同的方法进行合成，不 同的是，用实施例1中的步骤(14)得到的HO[G]OE代替实施例1中的步 骤(12)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(9)合成三聚体DMTr[UUMeU]PO-：
按照与实施例1中的步骤(29)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替实施例1中的步骤(5)得到 的DMTr[CLNA]PO-，用实施例2中的步骤(1)得到的HO[UMeU]OE代替实 施例1中的步骤(25)得到的HO[CU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(10)合成三聚体DMTr[GCC]PO-：
按照与实施例1中的步骤(29)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(5)得到 的DMTr[CLNA]PO-，用实施例2中的步骤(4)得到的HO[CC]OE代替实施 例1中的步骤(25)得到的HO[CU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(11)合成三聚体DMTr[AGG]PO-：
按照与实施例1中的步骤(29)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(1)得到的DMTr[A]PO-代替实施例1中的步骤(5)得到 的DMTr[CLNA]PO-，用实施例2中的步骤(6)得到的HO[GG]OE代替实施 例1中的步骤(25)得到的HO[CU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(12)合成三聚体HO[UFAU]OE：
按照与实施例1中的步骤(30)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(8)得到的DMTr[UF]PO-代替实施例1中的步骤(6)得到 的DMTr[UMe]PO-，用实施例2中的步骤(3)得到的HO[AU]OE代替实施 例1中的步骤(26)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(13)合成三聚体HO[UCFA]OE：
按照与实施例1中的步骤(30)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替实施例1中的步骤(6)得到 的DMTr[UMe]PO-，用实施例2中的步骤(5)得到的HO[CFA]OE代替实施 例1中的步骤(26)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(14)合成五聚体DMTr[UUMeUGA]PO-：
按照与实施例1中的步骤(34)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(9)得到的DMTr[UUMeU]PO-代替实施例1中的步骤(29) 得到的DMTr[CLNACU]PO-，用实施例2中的步骤(2)得到的HO[GA]OE代 替实施例1中的步骤(30)得到的HO[UMeGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(15)合成五聚体HO[AGUFAU]OE：
按照与实施例1中的步骤(36)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(8)得到的DMTr[AG]PO-代替实施例1中的步骤(22)得 到的DMTr[GG]PO-，用实施例2中的步骤(12)得到的HO[UFAU]OE代替 实施例1中的步骤(31)得到的HO[CMeAUMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(16)合成五聚体DMTr[GCCUCFA]PO-：
按照与实施例1中的步骤(34)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(10)得到的DMTr[GCC]PO-代替实施例1中的步骤(29) 得到的DMTr[CLNACU]PO-，用实施例2中的步骤(13)得到的HO[UCFA]OE 代替实施例1中的步骤(30)得到的HO[UMeGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(17)合成五聚体HO[AGGUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(36)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(11)得到的DMTr[AGG]PO-代替实施例1中的步骤(22) 得到的DMTr[GG]PO-，用实施例2中的步骤(7)得到的HO[UU]OE代替实 施例1中的步骤(31)得到的HO[CMeAUMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的 31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(18)合成十聚体DMTr[UUMeUGAAGUFAU]PO-：
按照与实施例1中的步骤(38)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(14)得到的DMTr[UUMeUGA]PO-代替实施例1中的步骤 (34)得到的DMTr[CLNACUUMeGA]PO-，用实施例2中的步骤(15)得到 的HO[AGUFAU]OE代替实施例1中的步骤(36)得到的HO[GGCMeAUMe]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(19)合成十一聚体HO[GCCUCFAAGGUU]OE
按照与实施例1中的步骤(39)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(16)得到的DMTr[GCCUCFA]PO-代替实施例1中的步骤 (35)得到的DMTr[ACUUCthio]PO-，用实施例2中的步骤(17)得到的 HO[AGGUU]OE代替实施例1中的步骤(37)得到的HO[AAAUUUNA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(20)合成二十一聚体DMTr[UUMeUGAAGUFAUGCCUCFA AGGUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(40)相同的方法进行合成，不同的是，用实 施例2中的步骤(18)得到的DMTr[UUMeUGAAGUFAU]PO-代替实施例1 中的步骤(38)得到的DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMe]PO-，用实施例2 中的步骤(19)得到的HO[GCCUCFAAGGUU]OE代替实施例1中的步骤(28) 得到的HO[ACUUCthioAAAUUUNA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物 的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
至此，用液相法合成得到了全保护的二十一聚体核糖核酸 DMTr[UUMeUGAAGUFAUGCCUCFAAGGUU]OE。
(21)脱保护
按照实施例1中的步骤(41)相同的方法进行脱保护。不同的是，用实 施例2中的步骤(20)得到的DMTr[UUMeUGAAGUFAUGCCUCFA AGGUU]OE代替实施例1中的步骤(40)得到的 DMTr[CLNACUUMeGAGGCMeAUMeACUUCthioAAAUUUNA]OE。
用Waters LCT Prime XE型ESI-TOF质谱分析步骤(21)得到的目标产 物的质量，得到如图1所示的质谱图。
质谱分析结果显示：测定值为6687.1。而理论计算值为6686.7，因此， 质谱分析结果表明：步骤(21)得到的寡核糖核酸质量正确。
分别取300ng的步骤(21)产物和300ng的用ABI3900型RNA固相 合成仪合成的，具有目标序列(5’-UUMeUGAAGUFAUGCCUCFAAGGUU-3’) 的固相合成产物(购自上海吉玛制药技术有限公司)，进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳(PAGE)检测。胶图检测结果如图2所示。电泳结果显示：两种不同 方法合成出的同一序列的寡核糖核苷酸，在胶图上条带位置相同，无明显杂 带。证明两种不同方法合成出的同一目标序列的寡核糖核苷酸具有相同的电 泳迁移率，并且具有较高的纯度。
质谱分析和电泳结果支持步骤(21)的产物的碱基序列确实为目标序列 UUMeUGAAGUFAUGCCUCFAAGGUU。
实施例3
该实施例通过RNA干扰实验检测通过本发明提供的液相合成的方法得 到的产物具有siRNA干扰活性。
将实施例1和实施例2的产物等量(5nmol)混合，加热到75℃，维持 10min，缓慢自然降温至室温，得到双链siRNA。
通过实施定量PCR检测通过本发明提供的液相合成的方法得到的产物 对HEK 293A细胞中HBV-X基因表达的抑制活性：
(1)HEK 293A细胞的培养
用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、DMEM完全培养基，在24 孔细胞培养板上以1×105个细胞/孔的密度接种HEK 293A细胞(购自北京大 学人民医院)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养。
(2)siRNA的转染
使用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000脂质体，将上述双链siRNA， 按照0.06nmol/孔的转染量，转染到本实施例步骤(1)中所述的HEK 293A 细胞中，并同时以灭菌去离子水作为siRNA转染的空对照。具体的操作步骤 参照LipofectamineTM2000说明书进行。
(3)双荧光报告实验
使用Promega公司的双荧光报告试剂盒(Promega，Lot NO.SH30022.01B)按照Dual-Luciferase Reporter Assay Protocol操作，测定 细胞siRNA干扰活性。
siRNA抑制活性＝1-(siRNA转染后的乙型肝炎病毒基因的拷贝数 /siRNA转染后的GAPDH拷贝数)/(空对照孔乙型肝炎病毒基因的拷贝数/ 对照孔GAPDH拷贝数)。
细胞siRNA干扰实验结果如图3所示：在浓度0.1nM至10nM范围， 显示具有很好的RNA干扰活性。