技术领域
本发明涉及一种制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子和制备黄孢原毛平革 菌的厚垣孢子制剂的方法，以及利用该方法制备的黄孢原毛平革菌的厚垣孢 子制剂。
背景技术
黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）具有很强且广谱的降解 异生物质的能力。自20世纪80年代初《Science》首次报道了P. chrysosporium的降解作用，便引起了环境界的广泛关注，开展了对白腐真菌 生物学特性、理化特性、应用等方面的大量研究，成为污水处理、废气污染 处理和土壤生物修复的有用工具。
P.chrysosporium在其生长周期内可以产生三种繁殖体，包括菌丝体、厚 垣孢子和分生孢子。目前P.chrysosporium的发酵生产主要采用液体发酵菌 丝生产漆酶、过氧化物酶等代谢产物，或者采用固体培养生产分生孢子制备 分生孢子制剂。由于其菌丝或分生孢子不易保存，在保存和运输过程中，菌 剂中有效微生物大量死亡或活性降低，导致产品的效力减小或功能下降，限 制了P.chrysosporium菌剂的大规模生产应用。厚垣孢子是真菌产生的一种 细胞壁加厚的具有抵抗能力的孢子，能抗御不良外界环境，如高温、低温、 紫外线、pH值和其他化学物质，产品的货架期长，易于保存。因此开发P. chrysosporium的厚垣孢子制剂，对于P.chrysosporium的商品化开发利用具 有重要意义。
CN102140425A公开了一种黄孢原毛平革菌厚垣孢子的培养方法，但该 方法采用摇瓶培养发酵P.chrysosporium，菌丝团需要冷冻后研磨处理制备菌 剂，该方法的发酵培养仅为摇瓶水平，从摇瓶到大罐的不断放大生产过程中 还有许多技术难题，且该方法操作步骤复杂，与大规模生产的技术要求有一 定的距离。
因此，亟需开发一种操作简单且适用于发酵罐大规模生产黄孢原毛平革 菌厚垣孢子的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子操 作步骤复杂、不适于大规模生产的缺陷，提供一种操作方法简单且可大规模 生产黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法，一种制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢 子制剂的方法，以及利用该方法得到的黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种制备黄孢原毛平革菌的 厚垣孢子的方法，其中，该方法包括如下步骤：
（1）将黄孢原毛平革菌的发酵种子接种到发酵培养基中；所述发酵种 子为黄孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌丝体；
（2）将接种了所述黄孢原毛平革菌的发酵种子的培养基进行液体深层 发酵，以产生黄孢原毛平革菌的厚垣孢子；
其中，步骤（1）中，所述发酵培养基含有0.5-3.5重量%的碳水化合物、 0.1-2重量%的酵母粉、2-8重量%的玉米浆、0.05-1重量%的CaCO3、0.005-0.05 重量%的ZnSO4、0.005-0.05重量%的MgSO4、0.01-0.05重量%的MnSO4和 余量的水；
步骤（2）中，所述液体深层发酵的条件包括：发酵的温度为25-31℃， 通气量为1:0.5-1体积:(体积·分钟)，搅拌速度为150-200rpm，发酵的时间为 100-120小时。
第二方面，本发明提供了一种制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方 法，其中，该方法包括：
（1）按照本发明提供的方法制备含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的发 酵液；
（2）将所述含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的发酵液与助滤剂混合， 得到混合后的物料；
（3）将步骤（2）中所述的混合后的物料进行固液分离，得到含有黄孢 原毛平革菌的厚垣孢子制剂。
第三方面，本发明提供了如上所述的方法制备的黄孢原毛平革菌的厚垣 孢子制剂。
通过上述技术方案，实现了操作方法简单且可大规模生产黄孢原毛平革 菌的厚垣孢子的目的。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法， 其中，该方法包括如下步骤：
（1）将黄孢原毛平革菌的发酵种子接种到发酵培养基中；所述发酵种 子为黄孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌丝体；
（2）将接种了所述黄孢原毛平革菌的发酵种子的培养基进行液体深层 发酵，以产生黄孢原毛平革菌的厚垣孢子；
其中，步骤（1）中，所述发酵培养基含有0.5-3.5重量%的碳水化合物、 0.1-2重量%的酵母粉、2-8重量%的玉米浆、0.05-1重量%的CaCO3、0.005-0.05 重量%的ZnSO4、0.005-0.05重量%的MgSO4、0.01-0.05重量%的MnSO4和 余量的水；
步骤（2）中，所述液体深层发酵的条件包括：发酵的温度为25-31℃， 通气量为1:0.5-1体积:(体积·分钟)，搅拌速度为150-200rpm，发酵的时间为 100-120小时。
优选的，步骤（1）中，所述发酵培养基含有1-1.5重量%的碳水化合物、 0.5-1重量%的酵母粉、3-5重量%的玉米浆、0.1-0.5重量%的CaCO3、0.01-0.02 重量%的ZnSO4、0.01-0.03重量%的MgSO4和0.02-0.04重量%的MnSO4。
本发明中，步骤（1）中所述的发酵培养基中含有的碳水化合物为本领 域常规的各种可以为培养基提供碳源的碳水化合物，优选的，所述碳水化合 物为淀粉、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种；所述发酵培养基的pH值为培养 基的自然pH值，优选为6.5-6.8。
本发明中，所述黄孢原毛平革菌的来源没有特别的限制，例如，可以在 工业微生物菌种保藏管理中心通过商购获得，例如，编号可以为CICC40299， 也可以为CICC40719。
根据本发明，所述黄孢原毛平革菌的发酵种子的接种量可以为常规的接 种量，优选以每升所述发酵培养基为基准，所述发酵种子的接种量为5-10 体积%。
其中，步骤（2）中，所述液体深层发酵的操作可以按照常规的液体深 层发酵方法进行，优选情况下，所述液体深层发酵的操作包括如下步骤：（1） 接种步骤，在所述接种步骤中，将如上所述的黄孢原毛平革菌的分生孢子和 /或菌丝体接种到液体培养基中；（2）发酵步骤，在所述发酵步骤中，将接种 了黄孢原毛平革菌分生孢子和/或菌丝体的液体培养基在发酵罐中进行发酵。
其中，所述黄孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌丝体可以使用常规的斜 面培养法获得，例如，可以将如上所述的黄孢原毛平革菌的菌丝体接种在 PDA培养基（含有马铃薯180-220g/L，葡萄糖18-22g/L，琼脂10-25g/L，pH 值6.8-7.0）上，在29-31℃下培养5-7天，即可得到大量附着在培养基上的 分生孢子和/或菌丝体，可以将斜面培养结束的培养基挖块以得到用于接种的 分生孢子和/或菌丝体。其中，也可以将斜面培养结束的培养基挖块并接种于 液体培养基中扩大培养，得到扩大培养的菌丝体，将扩大培养的菌丝体作为 用于发酵生产的接种体。
所述扩大培养的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以将斜面培养 结束的培养基挖块并接种于摇瓶培养基（含有淀粉5-15g/L、葡萄糖5-15g/L、 酵母粉3-7g/L、CaCO33-5g/L，pH值6.5-6.8）中，在温度为29-35℃、转速 为150-250rpm的条件下培养20-30小时，得到大量的菌丝体；并将所述得到 的菌丝体接种于种子罐培养基（含有淀粉5-15g/L、葡萄糖5-15g/L、酵母粉 3-7g/L、CaCO33-5g/L，pH值自然）中，在温度为29-31℃、转速为150-200rpm 的条件下培养20-30小时，得到用于发酵培养基接种的大量的菌丝体。
其中，所述发酵的条件可以为常规的液体深层发酵条件，例如，发酵的 温度可以为25-31℃，通气量可以为1:0.5-1体积:(体积·分钟)，搅拌速度可以 为150-200rpm。尽管在这样的发酵条件下，即可实现大规模生产黄孢原毛平 革菌的厚垣孢子的目的，但为了进一步提高黄孢原毛平革菌厚垣孢子的产 量，优选情况下，发酵第0-40小时的温度为29-31℃，发酵第40小时以后 的温度为27-29℃；发酵第0-10小时的通气量为1:0.5-0.8体积:(体积·分钟)， 发酵第10-40小时的通气量为1:0.8-1体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后 的通气量为1:0.5-0.8体积:(体积·分钟)；搅拌速度为175-185rpm。发酵周期 为100-120小时，此时，80%以上的菌丝体都形成了厚垣孢子。
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培 养液的空气体积比来表示（V／V·min-1），例如通气比为1:0.1-1，简称通气 量为0.1-1体积：（体积·分钟）。
第二方面，本发明提供了一种制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方 法，其中，该方法包括：
（1）按照本发明提供的方法制备含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的发 酵液；
（2）将所述含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的发酵液与助滤剂混合， 得到混合后的物料；
（3）将步骤（2）中所述的混合后的物料进行固液分离，得到含有黄孢 原毛平革菌的厚垣孢子制剂。
所述助滤剂的种类和加入量没有特别的限制，只要可促进厚垣孢子的分 散和发酵液的固液分离，并且对厚垣孢子没有毒害作用即可。优选地，所述 助滤剂为硅藻土和/或轻质碳酸钙，以每升发酵液为基准，所述助滤剂的加入 量为3-5重量%。其中，所述“助滤剂”是一种为防止滤渣堆积过于密实， 使过滤顺利进行，而使用的细碎程度不同的不溶性惰性材料。
其中，所述固液分离的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以使用 板框压滤过滤或离心的方法得到含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂。
根据本发明，为了便于含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的保存，优 选情况下，该方法还包括将固液分离得到的固体滤饼或离心沉淀物进行干燥 并粉碎得到含有黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的干制剂。
其中，所述干燥的条件包括：干燥的温度可以为60-80℃；干燥的时间 为可以为16-20小时。
第三方面，本发明提供了如上所述的方法制备的黄孢原毛平革菌的厚垣 孢子制剂。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中，通过血球计数板计数的方法计算产孢量。
黄孢原毛平革菌购自工业微生物菌种保藏管理中心，编号为 CICC40299。
制备例1
取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，将汁与2g葡萄糖、1.5g琼脂 和水配成100ml，装瓶灭菌后冷却得到PDA培养基。
将5g淀粉、5g葡萄糖、2.5g酵母粉、0.15g CaCO3和水配制成500mL， 装瓶（每瓶100mL）灭菌后冷却得到摇瓶培养基。
将5kg淀粉、5kg葡萄糖、2.5kg酵母粉、1.5kg CaCO3和水配制成500L， 装入种子罐中灭菌后得到种子罐培养基。
制备例2
将黄孢原毛平革菌接种于制备例1中的PDA培养基上，30℃下培养5 天；将接种并培养后的PDA培养基挖块接种于制备例1中的摇瓶液体培养 基中（100ml液体培养基接种PDA培养基生长的菌苔1cm2），在30℃和转 速200rpm的条件下，培养24小时，作为发酵种子罐接种体；将培养好的摇 瓶接种体接入灭菌后的种子罐培养基中（接种量0.5%（v/v）），在30℃和转 速180rmp的条件下，培养24小时，成为发酵种子。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
（1）发酵培养基的制备：将以每升发酵液为基准，淀粉含量为1.5重量 %、酵母粉含量为0.5重量%、玉米浆含量为4重量%、CaCO3含量为0.3重 量%、ZnSO4的含量为0.02重量%、MgSO4的含量为0.025重量%和MnSO4 的含量为0.03重量%的6500升培养基进行灭菌得到发酵培养基，自然pH 值。
（2）将制备例2中得到的发酵种子，按5%（体积/体积）的接种量接 种于本实施例步骤（1）中的发酵培养基中。发酵罐中的发酵条件为：发酵 第0-40小时的发酵温度为30℃；发酵第40小时以后的发酵温度为28℃； 发酵第0-10小时的通气量为1:0.6体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通 气量为1:1体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.6体积:(体 积·分钟)；搅拌速度为180rpm。
（3）发酵第110小时时，90%以上菌丝都形成厚垣孢子，发酵液变稀， 加入325kg硅藻土，搅拌混匀，将此时的发酵液通过板框压滤，收集滤饼， 将得到滤饼干燥及粉碎得到黄孢原毛平革菌厚垣孢子制剂。其中，所述干燥 的温度为60℃，干燥的时间为20小时。产孢量为5.6×107个厚垣孢子/mL。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
（1）发酵培养基的制备：将以每升发酵液为基准，葡萄糖含量为1重 量%、酵母粉含量为1重量%、玉米浆含量为5重量%、CaCO3含量为0.1 重量%、ZnSO4的含量为0.01重量%、MgSO4的含量为0.03重量%和MnSO4的含量为0.04重量%的6500升培养基进行灭菌得到发酵培养基。
（2）将制备例2中得到的发酵种子，按7%（体积/体积）的接种量接 种于本实施例步骤（1）中的发酵培养基中。发酵罐中的发酵条件为：发酵 第0-40小时的发酵温度为31℃；发酵第40小时以后的发酵温度为29℃； 发酵第0-10小时的通气量为1:0.8体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通 气量为1:0.9体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.5体积:(体 积·分钟)；搅拌速度为185rpm。
（3）发酵第110小时时，90%以上菌丝都形成厚垣孢子，发酵液变稀， 加入325kg轻质碳酸钙，搅拌混匀，将此时的发酵液通过板框压滤收集厚垣 孢子，收集滤饼，并干燥及粉碎即为黄孢原毛平革菌厚垣孢子制剂。其中， 所述干燥的温度为65℃，干燥的时间为19小时。产孢量为3.2×107个厚垣孢 子/mL。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
（1）发酵培养基的制备：将以每升发酵液为基准，蔗糖含量为1.3重量 %、酵母粉含量为0.8重量%、玉米浆含量为3重量%、CaCO3含量为0.5重 量%、ZnSO4的含量为0.015重量%、MgSO4的含量为0.01重量%和MnSO4的含量为0.02重量%的6500升培养基进行灭菌得到发酵培养基。
（2）将制备例2中得到的发酵种子，按10%（体积/体积）的接种量接 种于本实施例步骤（1）中的发酵培养基中。发酵罐中的发酵条件为：发酵 第0-40小时的发酵温度为29℃；发酵第40小时以后的发酵温度为27℃； 发酵第0-10小时的通气量为1:0.5体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通 气量为1:0.8体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.8体积:(体 积·分钟)；搅拌速度为175rpm。
（3）发酵第110小时时，90%以上菌丝都形成厚垣孢子，发酵液变稀， 加入325kg轻质碳酸钙，搅拌混匀，将此时的发酵液通过板框压滤收集厚垣 孢子，收集滤饼，并干燥及粉碎即为黄孢原毛平革菌厚垣孢子制剂。其中， 所述干燥的温度为80℃，干燥的时间为16小时。产孢量为2.1×107个厚垣孢 子/mL。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
按照实施例1的方法进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的制备以及黄孢原 毛平革菌的厚垣孢子制剂的制备，不同的是，进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢 子制备的发酵培养基的成分为以每升发酵液为基准，淀粉含量为3.5重量%、 酵母粉含量为0.1重量%、玉米浆含量为8重量%、CaCO3含量为0.05重量 %、ZnSO4的含量为0.05重量%、MgSO4的含量为0.005重量%和MnSO4的 含量为0.05重量%。产孢量为7.1×106个厚垣孢子/mL。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
按照实施例1的方法进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的制备以及黄孢原 毛平革菌的厚垣孢子制剂的制备，不同的是，进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢 子制备的发酵培养基的成分为，以每升发酵液为基准，淀粉含量为0.5重量 %、酵母粉含量为2重量%、玉米浆含量为2重量%、CaCO3含量为1重量 %、ZnSO4的含量为0.005重量%、MgSO4的含量为0.05重量%和MnSO4的 含量为0.01重量%。产孢量为6.6×106个厚垣孢子/mL。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的发酵培养基、制备黄孢原毛平革菌的厚 垣孢子的方法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
按照实施例1的方法进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的制备以及黄孢原 毛平革菌的厚垣孢子制剂的制备，不同的是，发酵的过程中发酵第0-40小 时的发酵温度为31℃；发酵第40小时以后的发酵温度为25℃。产孢量为 9.2×106个厚垣孢子/mL。
实施例7
本实施例用于说明本发明提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的方 法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法。
按照实施例1的方法进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的制备以及黄孢原 毛平革菌的厚垣孢子制剂的制备，不同的是，发酵的整个过程中发酵的温度 为30℃。产孢量为1.2×107个厚垣孢子/mL。
对比例1
本实施例用于说明现有技术提供的制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的 方法以及制备黄孢原毛平革菌的厚垣孢子制剂的方法
按照实施例7的方法进行黄孢原毛平革菌的厚垣孢子的制备以及黄孢原 毛平革菌的厚垣孢子制剂的制备，不同的是，发酵的整个过程中发酵的温度 为33℃。产孢量为2.3×106个厚垣孢子/mL。
通过上述采用本发明技术方案的实施例1-7与采用现有技术提供的技术 方案的对比例1相比，采用本发明的发酵培养基，发酵工艺，产孢量可大大 提高。将实施例1-3与实施例4和5进行比较可以看出，当发酵培养基中各 物质的含量在本发明优选的范围内时，其产孢量较高。将实施例1-3与实施 例6和7进行比较可以看出，当发酵条件在本发明优选的范围内时，其产孢 量较高。因此，采用本发明的方法可大规模的生产黄孢原平革菌的厚垣孢子； 且发酵结束后，制备黄孢原平革菌的厚垣孢子制剂的操作方案简单。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。