天然香料2苯乙醇的制备方法.pdf

本发明公开了一种天然香料2-苯乙醇的制备方法，通过选择克鲁斯假丝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母，经培养制备成的种子液或活性干酵母粉接种于发酵培养基，以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为底物，在发酵摇瓶或发酵罐中进行液体好氧发酵，再在发酵过程中加入固相吸附介质、L-苯丙氨酸和葡萄糖，发酵结束后以过滤或离心方式获得固相吸附介质，再采用洗脱溶剂对吸附介质进行洗脱，洗脱液进一步蒸馏得到纯度为97.5％～99.5％的天然2-苯乙醇。本发明将2-苯乙醇的发酵与吸附分离结合在一起，生产成本低，产品香气品质优良。

1.  天然香料2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：选取克鲁斯假丝酵母(krusei Candida)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中的一种酵母菌，接入种子培养基，经过培养制备成种子液，将所述种子液或活性干酵母粉接种于发酵培养基，以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为底物，在发酵摇瓶或发酵罐中进行液体好氧发酵，在发酵过程中向发酵液加入固相吸附介质、L-苯丙氨酸和葡萄糖，发酵过程温度控制在25～37℃，转化18～72h，转化结束后采用过滤或离心方式获得固相吸附介质，再采用洗脱溶剂对所述固相吸附介质进行洗脱，洗脱液进一步蒸馏得到天然2-苯乙醇，其中，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以发酵液体积计为5～30g/L，所述的固相吸附介质包括活性炭、人造沸石、大孔吸附树脂或纤维素，所述的洗脱溶剂为无水乙醇或95％乙醇。

2.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述种子培养基组成为：葡萄糖10～30g/L，麦芽汁3～5g/L，豆芽汁2～5g/L，蛋白胨4～6g/L，酵母膏2～5g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。

3.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为3～12％，所述活性干酵母粉接种于发酵培养基按重量计为0.2～3.0％。

4.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基组成为：葡萄糖20～200g/L，蛋白胨3～25g/L，酵母膏2～20g/L，K₂HPO₄.3H₂O  0.5～1.5g/L，MgSO4.7H₂O 0.3～2.0g/L，NH₄Cl0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。

5.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述固相吸附介质的用量与发酵培养基的重量与体积比为0.01～0.15∶1。

6.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述固相吸附介质在使用前进行灭菌，其灭菌方式为紫外灭菌、60～121℃湿热灭菌或150～200℃高温干热灭菌，灭菌时间10～120min。

7.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：所述好氧培养过程，发酵摇瓶转速100～300r/min，发酵罐搅拌转速100～800r/min，通气量按照通气速率比发酵液体积为0.3～1.5V/V·min。

8.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：整个发酵过程控制发酵培养基水相中2-苯乙醇的浓度小于3.5g/L，L-苯丙氨酸的浓度大于1.0g/L，葡萄糖的浓度0.5～30.0g/L。

9.  如权利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制备方法，其特征在于：洗脱液蒸馏的温度为78～160℃。

天然香料2-苯乙醇的制备方法
技术领域
本发明涉及一种通过酵母菌或活性酵母粉发酵制备天然香料2-苯乙醇的方法。
技术背景
2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)，又名β-苯乙醇、二苯基乙醇，是一种具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅细腻，多存在于玫瑰、百合、水仙、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、饼干、奶酪、葡萄酒等食品中的风味物质，该物质在碱性环境以及对空气的氧化作用稳定，其衍生酯类物质，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香产品。由于2-苯乙醇香气轻柔甜和，不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，还具有协同增效作用，是多种香型配方所需成分。目前2-苯乙醇广泛应用于食品、烟草、化妆品和洗涤日化用品中，其用量仅次于香兰素，为第二大香料产品。
目前全球2-苯乙醇年消耗量近万吨，多采用化学合成方法生产，极少部分从植物精油中提取，天然2-苯乙醇价格与合成2-苯乙醇相差很大。尽管合成2-苯乙醇成本较低，但化学合成2-苯乙醇采用原料多为苯或苯乙烯，这些合成原料可能的残留会对人体健康和环境带来危害，尤其是作为食品添加剂时其安全性越来越受到关注。天然2-苯乙醇可通过物理提取、酶或微生物法获得，按欧美相关规定，生物转化终产品定义为天然物质的前提是参与代谢的原料须为天然物质，目前生物转化2-苯乙醇的前体L-苯丙氨酸和葡萄糖、蔗糖等原料已可满足上述要求，由于物理方法从玫瑰等植物提炼油中获得天然2-苯乙醇产量低成本昂贵，因此微生物转化天然2-苯乙醇就成为极具研究价值和前景的生产方法。
国内外研究表明2-苯乙醇可作为微生物杀菌剂，其浓度介于2～3g/L就能完全抑制多种细菌和真菌的生长，包括酵母菌其自身生长，例如浓度为2.0g/L的2-苯乙醇就能完全抑制马克斯克鲁维酵母的生长，对于酿酒酵母，达到相同的抑制效果时，2-苯乙醇浓度需4.0g/L。
采用液液两相体系生物转化2-苯乙醇，即将发酵产生的2-苯乙醇转入油酸或油醇等组成的有机相中，可以部分解除产物产生的抑制与毒害，从而获得较高浓度2-苯乙醇累积。但采用液液两相体系工业生产2-苯乙醇过程存在诸多困难，例如，产物分离过程困难，由于2-苯乙醇被转移到有机相，产物分离无法采用吸附层析、有机溶剂萃取分离方法，同时油酸、油醇及其发酵过程形成的氧化物破坏2-苯乙醇香气品质。其次，油水两相乳化难于完全分相，采用膜渗透技术等使油水两相分开，在工业放大时遇到困难。此外，针对油水两相，生产中需要不同分离操作单元与设备。第三，发酵转化过程条件控制苛刻，由于发酵液引入粘度很高的有机相，其发酵过程需要很高的溶解氧控制条件，包括搅拌转速和通气等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过固液两相原位分离体系发酵制备天然香料2-苯乙醇的方法。
本发明技术方案，天然香料2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：选取克鲁斯假丝酵母(krusei Candida)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中的一种酵母菌，接入种子培养基，经过培养制备成种子液，将所述种子液或活性干酵母粉接种于发酵培养基，以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为底物，在发酵摇瓶或发酵罐中进行液体好氧发酵，在发酵过程中向发酵液加入固相吸附介质、L-苯丙氨酸和葡萄糖，发酵过程温度控制在25～37℃，转化18～72h，转化结束后采用过滤或离心方式获得固相吸附介质，再采用洗脱溶剂对所述固相吸附介质进行洗脱，洗脱液进一步蒸馏得到天然2-苯乙醇，其中，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以发酵液体积计为5～30g/L，所述的固相吸附介质包括活性炭、人造沸石、大孔吸附树脂或纤维素，所述的洗脱溶剂为无水乙醇或95％乙醇。
所述种子培养基组成为：葡萄糖10～30g/L，麦芽汁3～5g/L，豆芽汁2～5g/L，蛋白胨4～6g/L，酵母膏2～5g/L，K₂HPO₄.3H₂O  0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。
所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为3～12％，所述活性干酵母粉接种于发酵培养基按重量计为0.2～3.0％。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖20～200g/L，蛋白胨3～25g/L，酵母膏2～20g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5～1.5g/L，MgSO4.7H₂O 0.3～2.0g/L，NH₄Cl 0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。
所述固相吸附介质的用量与发酵培养基的重量与体积比为0.01～0.15∶1。
所述固相吸附介质在使用前进行灭菌，其灭菌方式为紫外灭菌、60～121℃湿热灭菌或150～200℃高温干热灭菌，灭菌时间10～120min。
所述好氧培养过程，发酵摇瓶转速100～300r/min，发酵罐搅拌转速100～800r/min，通气量按照通气速率比发酵液体积为0.3～1.5V/V·min。
整个发酵过程控制发酵培养基水相中2-苯乙醇的浓度小于3.5g/L，L-苯丙氨酸的浓度大于1.0g/L，葡萄糖的浓度0.5～30.0g/L。
洗脱液蒸馏的温度为78～160℃。
发明的有益效果，本发明在发酵过程中加入的固相吸附介质对2-苯乙醇有吸附作用，可解除2-苯乙醇对酵母菌的抑制与毒害。本发明将酵母菌发酵产物2-苯乙醇生物合成累积与产物吸附过程在发酵罐或发酵摇瓶中一起完成，是采用固液两相体系转化2-苯乙醇将发酵转化与产物的吸附分离过程结合在一起，在克服2-苯乙醇对酵母菌毒害与抑制的同时，又减少提取的工业化操作工序，提高了产品的香气品质。本发明对生物转化其自身对微生物产生抑制或毒害作用的同类天然香料有指导作用，操作方便，生产成本低，应用前景广阔。
附图说明
附图1是本发明的方法工艺流程图；
附图2是实施例7蒸馏粗品的气相色谱图；
附图3是实施例7蒸馏粗品的气相质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述，如图1所示，天然香料2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：自由选克鲁斯假丝酵母(kruseiCandida)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中的一种酵母菌，将其接入种子培养基，经过培养制备成种子液，所述的种子液或市售活性干酵母粉接种于发酵培养基，以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为底物，在发酵摇瓶或发酵罐中进行液体好氧发酵，在发酵过程中向发酵液加入固相吸附介质、L-苯丙氨酸和葡萄糖，发酵过程温度控制在25～37℃，转化18～72h，转化结束后采用过滤或离心方式获得固相吸附介质，再采用洗脱溶剂对所述固相吸附介质进行洗脱，洗脱液进一步蒸馏得到天然2-苯乙醇。
本发明所述的L-苯丙氨酸加入浓度以发酵液体积计为5～30g/L。所述的固相吸附介质包括选活性炭、人造沸石、大孔吸附树脂或纤维素。所述的洗脱溶剂包括无水乙醇或95％乙醇。
本发明所述天然2-苯乙醇种子培养步骤为：将自由选的酵母菌无菌操作条件下接入种子培养基，25～37℃摇床培养18～40h，摇床转速100～300r/min，所述种子培养基组成为：葡萄糖10～30g/L，麦芽汁3～5g/L，豆芽汁2～5g/L，蛋白胨4～6g/L，酵母膏2～5g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为3～12％。市售活性干酵母粉接种于发酵培养基按重量计为0.2～3.0％。
本发明所述发酵培养基组成为：葡萄糖20～200g/L，蛋白胨3～25g/L，酵母膏2～20g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5～1.5g/L，MgSO4.7H₂O 0.3～2.0g/L，NH₄Cl 0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然。发酵过程温度控制在25～37℃，转化时间18～68h。所述发酵过程为好氧培养过程，发酵摇瓶转速100～300r/min，发酵罐搅拌转速100～800r/min，通气量按照通气速率比发酵液体积为0.3～1.5V/V·min，L-苯丙氨酸加入浓度为5～30g/L。
本发明所述固相吸附介质中活性炭、人造沸石、大孔吸附树脂和纤维素的任何一种固相吸附介质，可采用的灭菌方式包括紫外灭菌、60～121℃湿热灭菌或150～200℃高温干热灭菌，灭菌时间10～120min，对于不同固相吸附介质自由选一种灭菌的方式，所选灭菌方式对介质吸附量影响较小为宜。所述选择的固相吸附介质对酵母菌基本没有毒性，不影响酵母菌生长，可以将生物合成的天然2-苯乙醇吸附，降低发酵培养基水相中的2-苯乙醇浓度。所述固相吸附介质的用量与发酵培养基的重量与体积比为0.01～0.15∶1。
本发明所述发酵过程中可一次性或间歇加入固相吸附介质、L-苯丙氨酸和葡萄糖，整个发酵过程控制发酵培养基水相中2-苯乙醇的浓度小于3.5g/L，L-苯丙氨酸的浓度大于1.0g/L，葡萄糖的浓度0.5～30.0g/L。
本发明所述发酵过程完成后可采用过滤或离心方式获得固相吸附介质，固相吸附介质中的2-苯乙醇可采用无水乙醇或95％乙醇的任何一种进行洗脱或解吸，包括搅拌解吸、振荡解吸或上柱洗脱，洗脱过程pH值为3.5～10.0。
本发明所述固相吸附介质得到的洗脱液可采用蒸馏法获得天然2-苯乙醇的制品，蒸馏的方法包括常压蒸馏、减压蒸馏和精馏，蒸馏的温度为78～160℃，得到的产品通过气相色谱分析或高效液相色谱分析纯度在97.5％～99.5％。
本发明中所述发酵转化2-苯乙醇的酵母菌采用如下方法获得：对自由选克鲁斯假丝酵母(krusei Candida)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中的任何一种或市售活性酵母粉，采用所述种子培养步骤和发酵转化步骤，最终获得的发酵液通过气相色谱分析或高效液相色谱分析，发酵液中2-苯乙醇的浓度大于1.0g/L，即可采用所述固液两相原位分离体系发酵制备天然2-苯乙醇。
实施例1
本发明实施例1的酵母菌为克鲁斯假丝酵母(krusei Candida)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 1674，该酵母菌培养温度28～30℃，为高温生香酵母。
种子培养基：葡萄糖15g/L，豆芽汁4g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子培养基冷却到28℃后，将克鲁斯假丝酵母CICC 1674接种于所述种子培养基，摇床培养24h，摇床转速150r/min，所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为5％。
发酵摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏6g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 0.5g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵过程温度控制在28℃，发酵时间18h时加入L-苯丙氨酸6g/L，发酵摇瓶转速160r/min，发酵转化68h结束。
发酵液中2-苯乙醇的高效液相色谱法(HPLC)分析：将待测发酵液样品进行离心，5000r/min，离心后的上清液再用0.45μm微孔滤膜过滤处理，滤液立即上RP-HPLC分析，色谱柱为C18柱(Dikma DiamonsilC18，250mm×4.6mm，5μm)，DAD检测器，检测波长260nm，柱温30℃，流动相为甲醇∶水＝60∶40(v/v)，流动相流速1mL/min，进样10μL，外标法定量。经过HPLC分析，上述条件下生物转化天然2-苯乙醇的浓度为2.56g/L。
固液两相体系发酵转化：按照实施例1所述种子培养和发酵培养方法，在发酵培养18h时加入L-苯丙氨酸4.5g/L，经过20h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为2.48g/L，在50ml的发酵液中加入树脂HZ816(购于上海华震树脂公司)1.50g，树脂HZ816预先在80℃湿热灭菌，加入树脂过程在超净操作台上完成。发酵摇瓶加入树脂HZ816后，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速160r/min，0.5h后取样，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.63g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸4.5g/L，经过26h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.53g/L。
固相吸附介质的2-苯乙醇解吸：采用0.3mm的筛网对50ml发酵液进行过滤，将树脂HZ816滤出，再以去离子水洗涤2次，将获得的树脂HZ816抽滤，得到的树脂重量为1.56g，将所述树脂加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度50r/min，时间2h。振摇结束后，采用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为2.69g/L。对上述树脂滤出，再加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度50r/min，时间2h。振摇结束后，采用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为0.41g/L。本实施例1中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为84.5％。
实施例2
本发明实施例2的酵母菌为克鲁斯假丝酵母(krusei Candida)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 1674，该酵母菌培养温度28～30℃，为高温生香酵母。
种子培养基：葡萄糖15g/L，麦芽汁3g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子培养基冷却到28℃后，将克鲁斯假丝酵母CICC 1674接种于所述种子培养基，摇床培养24h，摇床转速150r/min，所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为5％。
发酵摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏8g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 0.3g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵过程温度控制在28℃，发酵时间18h时加入L-苯丙氨酸6g/L，发酵摇瓶转速160r/min，发酵转化62h结束。
按实施例1中发酵液中2-苯乙醇的高效液相色谱法(HPLC)分析，上述条件下生物转化天然2-苯乙醇的浓度为2.47g/L。
固液两相体系发酵转化：按照实施例2所述种子培养和发酵培养方法，在发酵培养20h时加入L-苯丙氨酸5.0g/L，经过22h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为2.31g/L，在50ml的发酵液中加入活性炭769型(购于上海活性炭厂有限公司)0.75g 0.75g，活性炭预先在160℃干热处理，摇瓶加入活性炭过程在超净操作台上完成。发酵摇瓶加入活性炭后，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速180r/min，0.5h后取样，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.47g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸5.0g/L，经过30h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.23g/L。
固相吸附介质的2-苯乙醇解吸：采用0.4mm的筛网对50ml发酵液进行过滤，将活性炭滤出，再以去离子水洗涤3次，将获得的活性炭抽滤，得到的树脂重量为0.83g，将所述树脂加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度75r/min，时间2h。振摇结束后，采用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为3.82g/L。将上述活性炭滤出，再加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度75r/min，时间2h。振摇结束后，采用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为0.53g/L。本实施例2中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为88.9％。
实施例3
本发明实施例3中选择的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 1394，该酵母菌培养温度28～30℃，主要用于酿造葡萄酒(玫瑰香)。
种子培养基：葡萄糖10g/L，豆芽汁5g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏3g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子培养基冷却到28℃后，将酿酒酵母CICC 1394接种于所述种子培养基，摇床培养24h，摇床转速150r/min，所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为5％。
发酵摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏8g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 0.3g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵过程温度控制在28℃，发酵时间18h时加入L-苯丙氨酸8g/L，发酵摇瓶转速160r/min，发酵转化60h结束。
按实施例1中发酵液中2-苯乙醇的高效液相色谱法(HPLC)分析，上述条件下生物转化天然2-苯乙醇的浓度为3.46g/L。
固液两相体系发酵转化：按照实施例3所述种子培养和发酵培养方法，在发酵培养20h时加入L-苯丙氨酸6.0g/L，经过20h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为2.77g/L，在50ml的发酵液中加入人造沸石(购于国药集团化学试剂有限公司)2.0g，人造沸石预先121℃高温灭菌，摇瓶加入人造沸石过程在超净操作台上完成。发酵摇瓶加入人造沸石后，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速180r/min，1.0h后取样，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.83g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸5.0g/L，经过14h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.36g/L。在按上述操作加入人造沸石2.0g，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速200r/min，1.0h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.57g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸3.0g/L，经过14h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.27g/L。
固相吸附介质的2-苯乙醇解吸：采用0.3mm的筛网对50ml发酵液进行过滤，将人造沸石滤出，再以去离子水洗涤3次，将获得的人造沸石抽滤，得到的人造沸石重量为4.33g，将所述树脂加入到装有100ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为2.54g/L。将上述人造沸石滤出，再加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为0.71g/L。本实施例3中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为77.8％。
实施例4
本发明实施例4中选择的酵母菌为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号2.1978，该酵母菌培养温度25℃。
种子培养基：葡萄糖15g/L，麦芽汁4g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏3g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子培养基冷却到25℃后，将马克斯克鲁维酵母2.1978接种于所述种子培养基，摇床培养24h，摇床转速160r/min，所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为5％。
发酵摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏8g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 0.3g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵过程温度控制在25℃，发酵时间20h时加入L-苯丙氨酸8g/L，发酵摇瓶转速160r/min，发酵转化64h结束。
按实施例1中发酵液中2-苯乙醇的高效液相色谱法(HPLC)分析，上述条件下生物转化天然2-苯乙醇的浓度为3.52g/L。
固液两相体系发酵转化：按照实施例4所述种子培养和发酵培养方法，在发酵培养20h时加入L-苯丙氨酸6.0g/L，经过20h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为2.95g/L，在50ml的发酵液中加入树脂AB-8(购于天津南开大学化工厂)2.0g，树脂预先预先在80℃湿热灭菌，摇瓶加入树脂AB-8过程在超净操作台上完成。发酵摇瓶加入树脂AB-8后，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速250r/min，1.0h后取样，采用HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.91g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸5.0g/L，经过15h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.29g/L。在按上述操作加入树脂2.0g，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速250r/min，1.0h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.57g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸3.0g/L，经过16h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.30g/L。
固相吸附介质的2-苯乙醇解吸：采用0.3mm的筛网对50ml发酵液进行过滤，将树脂AB-8滤出，再以去离子水洗涤2次，将获得的树脂抽滤，得到的树脂重量为4.12g，将所述树脂加入到装有100ml 95％乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为2.83g/L。将上述树脂滤出，再加入到装有50ml95％乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为0.42g/L。本实施例4中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为80.9％。
实施例5
本发明实例5中选择的酵母菌为高活性干酵母粉(耐高糖型，湖北安琪酵母股份有限公司生产)。
发酵摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏6g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。活性酵母粉的接入发酵培养基按重量比为1.0％，发酵过程温度控制在35℃，发酵摇瓶转速220r/min，发酵时间2h后，加入L-苯丙氨酸8g/L，发酵转化56h结束。
按实施例1中发酵液中2-苯乙醇的高效液相色谱法(HPLC)分析，上述条件下生物转化天然2-苯乙醇的浓度为2.26g/L。
固液两相体系发酵转化：按照实施例4所述种子培养和发酵培养方法，在发酵培养2h后加入L-苯丙氨酸4.0g/L，经过20h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为1.93g/L，在50ml的发酵液中加入树脂HZ816(购于上海华震树脂公司)1.5g，树脂预先采用紫外照射灭菌，照射时间1h，摇瓶加入树脂过程在超净操作台上完成。发酵摇瓶加入树脂后，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速220r/min，1.0h后取样，采用HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.42g/L，再向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸3.0g/L，经过12h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为1.76g/L。再按上述操作加入树脂1.0g，继续在摇床上进行发酵转化，发酵摇瓶转速220r/min，1.0h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.37g/L，向发酵摇瓶中加入L-苯丙氨酸2.0g/L，经过16h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.01g/L。
固相吸附介质的2-苯乙醇解吸：采用0.3mm的筛网对50ml发酵液进行过滤，将树脂滤出，再以去离子水洗涤2次，将获得的树脂抽滤，得到的树脂重量为4.12g，将所述树脂加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为2.65g/L。将上述树脂滤出，再加入到装有50ml无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，振摇速度100r/min，时间3h。振摇结束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇浓度为0.44g/L。本实施例5中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为76.6％。
实施例6
本发明实施例6中选择的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 1394，该酵母菌培养温度28～30℃，主要用于酿造葡萄酒(玫瑰香)。
种子培养基和种子液培养方法按实施例4，所述种子液接种到发酵培养基的接种量以体积计为5％。
发酵罐培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.75g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 0.3g/L，溶剂为水，pH自然，将所述3.5L发酵培养基装入5L机械搅拌发酵罐(NBS BIOFLO 3000)中，121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵过程温度控制在30℃，酵母菌经过发酵培养20h后，第一次加入L-苯丙氨酸4.5g/L，发酵罐搅拌转速300r/min，通气量按照通气速率比发酵液体积为1.25V/V·min。
固液两相体系发酵转化：在所述第一次加入L-苯丙氨酸4.5g/L，经过6.5h后，采用所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为2.51g/L，2-苯乙醇的合成速率0.39g.L^-1.h^-1，在发酵液中第一次加入树脂HZ816(购于上海华震树脂公司)85g，树脂预先80℃湿热灭菌。发酵罐转速升至350r/min，1h后取样，按实施例1中所述HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.42g/L，向发酵罐中第二次加入L-苯丙氨酸4.0g/L，经过7h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.64g/L。向发酵罐中第二次加入树脂90g，1h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.61g/L，再向发酵罐中第三次加入L-苯丙氨酸4.0g/L，经过8h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.47g/L。向发酵罐中第三次加入树脂85g，1h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.53g/L，再向发酵罐中第四次加入L-苯丙氨酸3.5g/L，发酵罐转速升至400r/min，经过8h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.19g/L。向发酵罐中第四次加入树脂75g，1h后取样，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇的浓度为0.65g/L，再向发酵罐中第五次加入L-苯丙氨酸3.0g/L，经过15h后，HPLC分析发酵液中2-苯乙醇浓度为2.33g/L，停止发酵。
固相吸附介质的2-苯乙醇洗脱：采用0.3mm的筛网对发酵液进行过滤，将树脂滤出，再以去离子水洗涤3次，将获得的树脂抽滤，得到的树脂重量为368.9g。将所述树脂装柱，柱内径3.5cm，柱高65cm，柱体积580ml。采用无水乙醇洗脱，流速2.0ml/min，当无水乙醇洗脱收集液为2.6L时，取柱下端流出液样进行HPLC分析，2-苯乙醇的浓度为0.16g/L，结束洗脱。将所述收集的2.6L洗脱液摇匀，取样进行HPLC分析，洗脱液2-苯乙醇的浓度为13.23g/L，换算为发酵液2-苯乙醇的终浓度为12.16g/L，本实施例6中L-苯丙氨酸发酵转化为2-苯乙醇的总摩尔转率为86.5％。
实施例7
2-苯乙醇洗脱液的蒸馏方法：本发明实施例6中收集到的2.6L洗脱液进行常压蒸馏，蒸馏温度80℃，将所述洗脱液蒸馏浓缩到约500ml时，蒸馏瓶内壁可见少量粘稠物附着，将浓缩液转入另外一个2L烧瓶中，取样按本发明实施例1的方法进行HPLC分析，2-苯乙醇浓度为63.78g/L，继续常压蒸馏，直到蒸馏塔顶温度达到95℃，停止常压蒸馏。将所述常压蒸馏残留液76ml进行下一步的减压蒸馏，采用油泵对蒸馏釜内抽真空，蒸馏温度从80℃缓慢升温，到130℃基本粗蒸完毕，获得蒸馏粗品液A为51ml，采用HPLC分析蒸馏粗品中2-苯乙醇浓度为618.39g/L，所述蒸馏粗品液A准备进行精馏操作。
发酵液水相中2-苯乙醇的吸附与解吸：将实施例6通过0.3mm的筛网的3.5L发酵液进行离心，3500r/min离心20min，去除菌体，加入80g树脂HZ816，搅拌吸附1h，温度25℃，再采用0.3mm的筛网过滤出树脂HZ816，以去离子水洗涤2次，将树脂抽滤，获得湿树脂86.1g。向所述86.1g湿树脂中第一次加入2倍重量的95％乙醇，搅拌解吸，解吸温度35℃，时间1h，结束后抽滤出树脂，树脂重量为82.9g，采用HPLC分析解吸液样品的2-苯乙醇浓度为17.89g/L。向所述82.9g湿树脂中第二次加入2倍重量的95％乙醇，搅拌解吸，解吸温度35℃，时间1h，结束后抽滤出树脂，树脂重量为81.2g，采用HPLC分析解吸液样品的2-苯乙醇浓度为10.73g/L。向所述81.2g湿树脂中第三次加入1倍重量的95％乙醇，搅拌解吸，解吸温度35℃，时间1h，结束后抽滤出树脂，树脂重量为80.7g，采用HPLC分析解吸液样品的2-苯乙醇浓度为4.81g/L。将上述三次解吸液合并，准备蒸馏。
按本实施例2-苯乙醇洗脱液的蒸馏方法，对上述三次解吸液进行蒸馏，获得蒸馏粗品液B为23ml，采用HPLC分析蒸馏粗品中2-苯乙醇浓度为232.18g/L，将本实施例中所述蒸馏粗品液A和蒸馏粗品液B合并，准备进行精馏操作。
2-苯乙醇气相分析与质谱分析：采用气相质谱7890A(美国安捷伦科技有限公司)对蒸馏粗品分析，分析条件为：柱温32℃--240℃(10min)、10℃/min，分流比50∶1，进样量0.2μL，溶剂延迟3min，扫描参数20-450amu，EI源70ev，进样口温度250℃，离子源温度230℃，MS四级杆温度150℃，柱流量1mL/min。采用所述气相质谱分析，产品纯度98.6％(附图2)，确定产物分子量为122.1(附图3)，产物分子量与2-苯乙醇完全相同。
产品精馏与产品纯度：将待精馏粗品进料后，油泵预真空，先将表压力降至-0.05MPa以下，缓慢升高蒸馏釜温度，先将粗品中少量水蒸出，连续抽真空，压力可至-0.098MPa，收集115℃馏分。，按所述气相分析方法，产品纯度99.3％。
所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。