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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310736719.7 (22)申请日 2013.12.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/558(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 天津国际旅行卫生保健中心 地址 300456 天津市塘沽区新港 2 号路 2-1126 (72)发明人 关淳 王馨 祁军 左锋 刘寅 韩静娜 姜智贤 叶正 吕沁风 等 . 嗜肺军团菌环介导等温扩增检 测法的建立 . 浙江大学学报 （医学版） .2010, 第 。
2、39 卷 ( 第 3 期 ),305-310. Lee Murray 等 .Detection of capripoxvirus DNA using a novel loop-mediated isothermal amplifi cation assay.BMC Veterinary Research .2013, 第 9 卷 1-8. 王蔚芳 等 . 胶体金免疫层析快速检测技术 及其在水产养殖业中的应用前景 .渔业科学进 展 .2010, 第 31 卷 ( 第 3 期 ),113-118. (54) 发明名称 一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检 测试剂 (57) 摘要 本发明涉及一种新。
3、型等温环介导嗜肺军团菌 核酸标记检测试剂， 该试剂通过对等温环介导扩 增所使用的引物组中的前内引物标记一种抗原同 时对后内引物标记另一种抗原， 能够在扩增嗜肺 军团菌特异性目的基因的同时对该基因进行标 记。标记后使用配套的胶体金试纸能够快速检测 目的基因的扩增产物， 从而检测嗜肺军团菌。本 发明的检测试剂操作简单快速、 特异性强、 灵敏度 高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 韦炜 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 103667501 B 2016.04.20 CN 103667501 B 1.一种。
4、新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂， 其特征在于， 所述的检测试剂 包括嗜肺军团菌等温环介导核酸标记扩增反应液， 该反应液中含有： dNTPs溶液、 具有链置 换活性的BstDNA聚合酶、 MgSO4、 无菌双蒸水、 环介导等温扩增的缓冲液， 以及前外引物、 后 外引物、 前促环引物、 后促环引物、 5 端标记生物素基团的前内引物、 5 端标记异硫氰酸荧 光素基团的后内引物， 上述各引物的具体序列如下： SEQIDNO:15 -AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC-3 , SEQIDNO:25 -AGCAGTACGTTTTGCCATCA-3 , SEQIDNO:35 -CCGA。
5、TGCCACATCATTAGCTACAGACA-3 , SEQIDNO:45 -TTGGCTTTAACCGAACAGCA-3 , SEQIDNO:5 5 -TCGGCACCAATGCTATAAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC-3 , SEQIDNO:6 5 -GGCTAAAGGCATGCAAGACGTTTCTGAAACTTGTTAAGAACG-3 。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103667501 B 2 一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂 技术领域 0001 本发明涉及一种应用于核酸检测的试剂， 具体讲， 涉及一种新型等温环介导嗜肺 军团菌核酸标记检测。
6、试剂。 背景技术 0002 1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病， 参加者中超 过200人发生肺炎， 其中34人遇难。 经研究， 发现一种细菌命名为嗜肺军团菌。 随后， 许多有 关细菌暂被列入这一属， 且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例。 现已提出了 超过30种军团杆菌， 至少19种是人类肺炎的病原。 其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例 的85%90%)， 这次事件反映了嗜肺军团菌并非小面积的人与人的传染。 加强水资源管理及 人工输水管道和设施的消毒处理， 防治军团菌造成空气和水源污染， 是预防军团菌病扩散 的重要措施， 嗜肺军团菌的快速检测对该疾病的。
7、防控具有重要的意义。 0003 环介导等温扩增技术 （Loop-mediatedisothermalamplification） 是一种新型 的核酸检测技术， 其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物， 在链置换DNA聚合酶 (BstDNApolymerase)的作用下， 在6065恒温扩增， 60分钟左右即可实现1091010 倍的核酸扩增， 具有操作简单、 特异性强等特点。 该技术的优势除了高特异性、 高灵敏度外， 操作十分简单， 对仪器设备要求低， 一台水浴锅或恒温箱就能实现反应。 其扩增结果可以通 过凝胶电泳、 肉眼观察焦磷酸镁沉淀或加入荧光物质后的颜色改变来做初步的判断。 但该 。
8、方法也有一定的缺陷， 主要表现在扩增结果检测环节， 凝胶电泳检测容易造成污染， 焦磷酸 镁沉淀检测灵敏度较差， 荧光物质变色方法受到荧光物质的成本或者需要使用检测仪器的 限制。 因此， 在产物检测环节的限制， 影响了该技术的推广应用。 0004 本发明公开了一种新型的等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂。 该方法具有 本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高， 结果判断更准确的优势。 发明内容 0005 本发明的首要发明目的在于提供一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测 试剂。 0006 本发明的第二发明目的在于提供一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测 方法。 0007 本发。
9、明的第三发明目的在于提供这种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测 试剂盒的应用。 0008 发明的主要技术方案为： 0009 1.等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂的组成为： 0010 （1） 核酸恒温标记扩增反应试剂 0011 核酸恒温扩增反应液中含有前外引物、 后外引物、 前促环引物、 后促环引物、 前内 引物、 后内引物、 dNTPs溶液、 具有链置换活性的DNA聚合酶 （如： BstDNA聚合酶等） 、 MgSO4、 说明书 1/5 页 3 CN 103667501 B 3 无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。 0012 环介导等温扩增的缓冲液的最终工作浓度为20mMTris-HC。
10、l、 10mMKCl、 10mM (NH4)2SO4、 2mMMgSO4以及质量浓度为0.1%TritonX-100， 缓冲液的pH值为8.8。 0013 其中前外引物、 后外引物、 前促环引物、 后促环引物、 前内引物、 后内引物均为人工 合成的脱氧核糖核酸分子， 其中前外引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1、 后外引物的核苷酸 序列为SEQIDNO:2、 前促环引物的核苷酸序列为SEQIDNO:3、 后促环引物的核苷酸序列 为SEQIDNO:4、 前内引物的核苷酸序列为SEQIDNO:5、 后内引物的核苷酸序列为SEQID NO:6， 上述引物分别与待测基因的相应位置互为反义互补序列， 上。
11、述引物能够在等温条件 下以环介导的方式检测待测基因。 将前内引物的5 端标记上生物素基团， 将后内引物的5 端标记上异硫氰酸荧光素基团。 0014 各引物的具体核苷酸序列如下： 0015 SEQIDNO:15 -AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC-3 , 0016 SEQIDNO:25 -AGCAGTACGTTTTGCCATCA-3 , 0017 SEQIDNO:35 -CCGATGCCACATCATTAGCTACAGACA-3 , 0018 SEQIDNO:45 -TTGGCTTTAACCGAACAGCA-3 , 0019 SEQIDNO:55 -TCGGCACCAATGCTAT。
12、AAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC-3 , 0020 SEQIDNO:65 -GGCTAAAGGCATGCAAGACGTTTCTGAAACTTGTTAAGAACG-3 。 0021 （2） 标记核酸胶体金检测试纸条 0022 该试纸条的组成包括样品垫、 金胶垫、 醋酸纤维素膜 （膜上由相应的抗体组成的检 测线和质控线） 和吸水垫等， 具体组成参见附图1。 该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记 后抗生物素抗体的金颗粒， 胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗 体， 胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二 抗。 0023 。
13、2.使用等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂的具体步骤为： 0024 （1） 将待检测的DNA溶液， 加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中； 在对照PCR管中 分别加入阳性对照试剂和阴性对照试剂， 将上述PCR管在6065下扩增反应3060分钟， 优选条件为62下扩增反应60分钟。 0025 （2） 利用标记核酸胶体金检测试纸条， 检测PCR管中反应后的核酸扩增产物。 0026 下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明： 0027 等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂能够在6065下将嗜肺军团菌的DNA 进行扩增， 在扩增的同时， 由于前内引物和后内引物分别标记有生物素基团和异硫氰酸荧 光素。
14、基团， 因此在DNA扩增产物上同时含有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。 0028 上述扩增产物滴加在核酸胶体金检测试纸条的样品垫上， 在层析作用下， 扩增产 物在经过金胶垫时双标记的核酸扩增产物由于携带有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团， 因此能够和标记有金颗粒的抗生物素抗体结合形成核酸抗体复合物； 核酸抗体复合物在醋 酸纤维素膜上层析， 经过检测线时该复合物由于带有异硫氰酸荧光素基团， 因此能够和检 测线上的抗异硫氰酸荧光素抗体结合， 形成复合物， 该复合物由于携带有有色的标记物 （纳 米金颗粒呈红色） ， 此时检测线呈现红色； 当核酸抗体复合物或者单独的标记抗生物素抗体 经过质控线时， 由于。
15、质控线上含有能够结合抗生物素抗体的二抗， 所以只要有标记的抗生 说明书 2/5 页 4 CN 103667501 B 4 物素抗体层析至质控线， 无论该抗体是否结合有标记的核酸， 均能够形成二抗和标记抗体 的复合物， 该复合物由于携带有有色的标记物 （纳米金颗粒呈红色） ， 此时质控线呈现红色。 0029 本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高， 结果判断更准确的 优势。 首先， 本发明的新型恒温环介导核酸标记检测试剂， 使用标记的引物， 使得环介导等 温扩增后， 扩增产物携带了两种抗原标记物。 这样的双标记核酸扩增产物， 能够被制备好的 胶体金试纸条检测出来。 当含有双标记扩增。
16、产物的样本在胶体金试纸上层析时， 双标记产 物能够结合携带有有色颗粒标记的抗体， 在检测线上呈现红色， 这样目的扩增产物可以通 过试纸上检测线的颜色改变显示出来。 即使有很少的扩增产物也能够进行准确的检测， 因 此有效地提高了检测灵敏度。 其次， 检测反应的结果通过胶体金检测试纸的检测线得到， 相 对于浊度观察法和荧光燃料变色法读取结果更加准确， 避免了由于检验人员主观判断带来 的结果偏差。 上述检测方法扩大了该检测试剂的应用范围， 使之可以广泛应用于野外现场 等特殊环境。 此方法操作简单、 时间短， 同时也降低了检测成本， 使得检测结果更加快速、 可 靠， 具有免疫与核酸诊断试剂各自的优点。。
17、 该技术由于操作简单、 快速、 低廉的成本和防止 核酸扩增物对实验室的污染， 对于病原体的检测具有重大意义。 附图说明 0030 附图1胶体金试纸条的组成。 0031 该试纸条的组成包括样品垫 （1） 、 金胶垫 （2） 、 醋酸纤维素膜 （3） 、 质控线 （4） 、 检测 线 （5） 和吸水垫 （6） 。 该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒， 胶 体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体， 胶体金检测试纸层析膜的 质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。 0032 附图2嗜肺军团菌标记扩增检测结果 0033 加入的扩增DNA模板如下， 1。
18、号条为嗜肺军团菌DNA模板标准品其中含目的基因约 105拷贝； 2号条为嗜肺军团菌DNA模板标准品其中含目的基因约100拷贝； 3号条为待测样品； 4号条为肺炎链球菌DNA模板标准品； 5号条为加入的双蒸水进行阴性对照。 0034 下面结合具体实施例， 进一步详细地阐述本发明。 具体实施方式 0035 本发明的具体实施方式仅对本发明做进一步的解释和说明， 并不对本发明的内容 进行限制。 0036 实施例1： 嗜肺军团菌DNA基因组梯度稀释标记扩增检测 0037 取浓度已知的嗜肺军团菌DNA基因组对其进行10倍梯度稀释， 稀释至嗜肺军团菌 DNA中的目的基因终浓度为100拷贝/ L， 取嗜肺军团。
19、菌DNA模板标准品制备的阳性参照物， 阴性参照物， 以及嗜肺军团菌DNA梯度稀释液 （在PCR管中嗜肺军团菌特异性目的基因的终 浓度分别为103拷贝、 102拷贝、 101拷贝和100拷贝） ， 做为模板进行标记扩增检测。 0038 等温扩增中的各组分构成比例如下： 说明书 3/5 页 5 CN 103667501 B 5 0039 0040 1倍缓冲液中各物质组成如下： 20mMTris-HCl、 10mMKCl、 10mM(NH4)2SO4、 2mM MgSO4以及质量浓度为0.1%TritonX-100， 缓冲液的pH值为8.8， 10倍缓冲液的各组份浓度 是1倍缓冲液中各组份浓度的10。
20、倍。 0041 将上述混合物加入到PCR管中， 在水浴锅中进行等温扩增， 扩增步骤为： 62， 30分 钟； 80， 2分钟。 0042 将扩增产物加于胶体金检测试纸条上， 在15分钟之内读取结果， 当检测线和质控 线都呈现红色时为阳性结果； 当检测线无色、 质控线呈现红色时为阴性结果； 当质控线无色 时， 实验失败， 需要重新进行实验。 0043 浓度已知的嗜肺军团菌DNA基因组进行梯度稀释， 分别加入为嗜肺军团菌DNA模板 标准品制备的阳性参照物、 103-100拷贝目的基因的嗜肺军团菌DNA和用于做参照的无菌水， 扩增结果为其中阳性参照物和103-100拷贝目的基因的扩增产物均为阳性， 。
21、阴性参照物的扩 增结果为阴性。 0044 实施例2： 嗜肺军团菌的检测 0045 样本： 某DNA样本怀疑为嗜肺军团菌。 0046 取该样本进行等温标记扩增检测扩增， 扩增的同时使用嗜肺军团菌DNA模板标准 品其中含目的基因约105拷贝的DNA样本； 嗜肺军团菌DNA模板标准品其中含目的基因约100 拷贝的DNA样本； 枯草芽孢杆菌DNA模板标准品； 地衣芽孢杆菌DNA模板标准品； 苏云金枯草 芽孢杆菌DNA模板标准品和无菌双蒸水的阴性对照同时进行检测。 0047 等温扩增中的各组分构成比例如下： 说明书 4/5 页 6 CN 103667501 B 6 0048 0049 1倍缓冲液中各物质。
22、组成如下： 20mMTris-HCl、 10mMKCl、 10mM(NH4)2SO4、 2mM MgSO4以及质量浓度为0.1%TritonX-100， 缓冲液的pH值为8.8， 10倍缓冲液的各组份浓度 是1倍缓冲液中各组份浓度的10倍。 0050 将上述混合物加入到PCR管中， 在水浴锅中进行等温扩增， 扩增步骤为： 60， 30分 钟； 80， 2分钟。 0051 将扩增产物加于胶体金检测试纸条上， 在15分钟之内读取结果， 当检测线和质控 线都呈现红色时为阳性结果； 当检测线无色、 质控线呈现红色时为阴性结果； 当质控线无色 时， 实验失败， 需要重新进行实验。 0052 实施例2的结。
23、果见附图2所示， 各扩增产物中加入的DNA模板如下， 1号条为嗜肺 军团菌DNA模板标准品其中含目的基因约105拷贝； 2号条为嗜肺军团菌DNA模板标准品其中 含目的基因约100拷贝； 3号条为待测样品； 4号条为肺炎链球菌DNA模板标准品； 5号条为加 入的双蒸水进行阴性对照。 说明书 5/5 页 7 CN 103667501 B 7 天津国际旅行卫生保健中心 一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂 6 patentversion2.1 1 23 DNA 人工序列 1 AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC 2 20 DNA 人工序列 2 AGCAGTACGTTTTGCCATC。
24、A 3 27 DNA 人工序列 3 CCGATGCCACATCATTAGCTACAGACA 4 20 DNA 人工序列 4 TTGGCTTTAACCGAACAGCA 5 46 DNA 序列表 1/2 页 8 CN 103667501 B 8 人工序列 5 TCGGCACCAATGCTATAAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC 6 42 DNA 人工序列 6 GGCTAAAGGCATGCAAGACGTTTCTGAAACTTGTTAAGAACG 序列表 2/2 页 9 CN 103667501 B 9 图1 图2 说明书附图 1/1 页 10 CN 103667501 B 10 。