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1、(10)申请公布号 CN 102676687 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676687 A *CN102676687A* (21)申请号 201210186627.1 (22)申请日 2012.06.08 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238 号 (72)发明人 高天翔 张辉 张朝晖 李鹏飞 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (54) 发明名称 利用 AFLP 指纹技术鉴定中国对虾种群的方 法。
2、 (57) 摘要 本发明涉及一个用于鉴定中国对虾种群的引 物组， 包括有四对引物， 每对引物的正向引物、 反 向引物的序列分别为 ： SEQ ID NO ： 1和SEQ IDNO ： 2、 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7。通 过本发明筛选出的引物组合， 可以确定自然海域 中国对虾种群的来源和归属地， 有利于界定不同 产卵场对中国对虾种群的贡献值。中国对虾在中 日韩共享海域中分布广泛， 根据本发明筛选的引 物组合能够确定来源于不同产卵水域对共管水。
3、域 资源的贡献， 界定资源归属比例和应获捕捞配额， 对于维护我国海洋权益和保护我国渔业资源具有 重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 用于鉴定中国对虾种群的引物组， 其特征在于， 包括有四对引物， 每对引物的正向引 物、 反向引物的序列分别为 ： SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID。
4、 NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7。 2. 权利要求 1 所述的引物组的应用， 是用于对中国对虾种群进行遗传鉴定。 3. 如权利要求 2 所述的遗传鉴定， 包括有如下的步骤 ： 1） 样品基因组 DNA 的提取 ； 2） 酶切反应 ； 用 EcoR I 和 Mse I 对 1） 中的 DNA 进行酶切 3） 连接反应 ： 将 2） 中获得的酶切产物连接上 EcoR I 接头和 Mse I 接头 ； 4） 预扩增反应 ： 用 EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 对 3） 中获得的连接产物进 行预扩增 ； 5） 选择性扩增。
5、 ： 将预扩增产物稀释后， 分别用 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5、 SEQ IDNO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 的引物 对进行扩增 ； 且序列为 SEQ ID NO ： 1、 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 6 的引物的 5用 FAM 荧光 标记 ； 6） 结果分析 ： 将步骤 5） 的扩增产物用 ABI3730 条带分型， 读取结果后进行种群分析。 4. 如权利要求 3 所述的遗传鉴定， 其特征在于， 所述。
6、的 EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9。 权 利 要 求 书 CN 102676687 A 2 1/4 页 3 利用 AFLP 指纹技术鉴定中国对虾种群的方法 技术领域 0001 本发明属于水产生物种群鉴定分子检测技术领域， 具体涉及一种利用 AFLP 指纹 技术鉴定中国对虾种群方法。 0002 背景技术 ： 0003 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism， 扩增长度多态性） 是在 RFLP 和RAPD技术的基础上发明的一种新的DNA。
7、分子标记技术。 其基本原理是先利用限制性内切 酶将基因组 DNA 酶切， 产生不同大小的 DNA 片段后， 将其用双链人工接头相连接， 再以人工 接头的互补链为引物进行预扩增， 选择性扩增所用引物是在接头互补链的基础上添加 1-3 个选择性核苷酸， 对预扩增模板 DNA 进行选择性扩增之后， 根据扩增片段长度的不同， 检测 选择性扩增产物的多态性。 AFLP分子标记技术自开始应用以来， 发展十分迅速， 近几年已经 在海洋生物遗传学研究以及在对海洋生物养殖群体和野生群体的种质资源评估等方面得 到了广泛的应用。同时， 用 AFLP 方法得到的指纹图谱具有稳定、 可靠且多态性丰富等优点， 非常适合于。
8、种群的鉴定。 0004 中国对虾 （Fenneropenaeus chinensis） 是我国黄、 渤海的主要经济虾类。由于中 国对虾野生资源的急剧减少， 从 1986 年开始， 我国每年在渤海、 黄海北部和山东半岛南部 进行人工培育苗种的放流， 年放流规模达 10 亿尾以上。但由于中国对虾的长距离洄游习 性， 不同地点放流的个体会在越冬场形成混合种群。 因此， 明确混合种群中中国对虾来源对 于渔业资源的管理与保护十分重要。 但目前还没有一种有效的鉴定中国对虾种群归属的分 子鉴定方法。 发明内容 ： 0005 本发明的目的是提供一种利用 AFLP 指纹技术鉴定中国对虾种群方法， 从而弥补 现有。
9、技术的不足。 0006 本发明的一个方面是提供一个用于鉴定中国对虾种群的引物组， 包括有四对引 物， 每对引物的正向引物、 反向引物的序列分别为 ： SEQ ID NO ： 1和SEQID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7。 0007 本发明的引物组用于对中国对虾种群进行遗传鉴定， 包括有如下的步骤 ： 0008 1） 样品基因组 DNA 的提取 ； 0009 2） 酶切反应 ； 用 EcoR I 和 Mse I 对 1） 中的 。
10、DNA 进行酶切 0010 3） 连接反应 ： 将 2） 中获得的酶切产物连接上 EcoR I 接头和 Mse I 接头 ； 0011 4） 预扩增反应 ： 用 EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 对 3） 中获得的连接产 物进行预扩增 ； 0012 5） 选择性扩增 ： 将预扩增产物稀释后， 分别用 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5、 SEQ IDNO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 的引 物对进行扩增。
11、 ； 且序列为 SEQ ID NO ： 1、 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 6 的引物的 5用 FAM 荧 光标记 ； 说 明 书 CN 102676687 A 3 2/4 页 4 0013 6） 结果分析 ： 将步骤 5） 的扩增产物用 ABI3730 条带分型， 读取结果后进行种群分 析。 0014 上述的 EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9。 0015 通过本发明筛选出的引物组合， 可以确定自然海域中国对虾种群的来源和归属 地， 有利于界定不同产卵场对中国。
12、对虾种群的贡献值。中国对虾在中日韩共享海域中分布 广泛， 根据本发明筛选的引物组合能够确定来源于不同产卵水域对共管水域资源的贡献， 界定资源归属比例和应获捕捞配额， 对于维护我国海洋权益和保护我国渔业资源具有重要 意义。 具体实施方式 0016 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常可按常规条件， 如 J. 萨姆布鲁 克 （Sambrook） 等编写的 分子克隆实验指南 中所述的条件来进行操作。 0017 申请人在长期的研究中， 通过对不同种群的 AFLP 分析， 筛选到了可以有效的对中 国对虾种群进行鉴定的引物对组合， 利用本发明的引物组对中国对虾种群进行鉴定， 步骤 如下 ： 00。
13、18 1、 基因组 DNA 提取 0019 提取中国对虾的全基因组 DNA， 保存于 -20备用。 0020 2、 酶切反应 0021 酶 切 反 应 体 系 共 20L ： 基 因 组 DNA 约 100ng、 0.1L Trul （10u/l） 、 0.1LEcoR I （10u/l） 以及 4.0L 10Y+/Tango buffer， 加超纯水至 20L， 于恒温设 备中 65酶切， 时间不少于 6h。 0022 酶切反应结束后， 将反应产物置于 75中加热 15min， 使酶失活， 4保存备用。 0023 3、 连接反应 0024 连接反应体系共 10L ： 酶切反应产物 5L、 1。
14、L 的 Solution I、 0.1L EcoRI adapter （序列见表 1） 、 0.1L Mse I adapter （序列见表 1） 以及 0.1L SolutionII （10u/ L） ， 加超纯水至 10L， 室温下反应时间不少于 8h， 于 4保存备用。 0025 4、 预扩增反应 0026 预扩增反应体系共 20L ： 连接产物 1L、 2L10PCR buffer、 2L dNTP、 0.05L 的 EcoR I preprimer（序列见表 1） 、 0.05L 的 Mse I preprimer（序列见表 1） 以及 0.15LTaq DNA 聚合酶。 0027 。
15、预扩增PCR反应条件 ： 942min， 20个循环 （9430s5660s7260s） ， 4 下保温。扩增产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。 0028 预扩增产物用超纯水稀释 10 倍， 置 4下保存备用。 0029 5、 选择性扩增反应 0030 在 避 光 条 件 下， 选 择 性 扩 增 体 系 20L ： 5L 预 扩 增 稀 释 混 合 液、 2L 10PCRbuffer plus Mg2+、 2L dNTP、 0.05L EcoR I 引物 （5 端添加 FAM 荧光标记） （序 列见表1） 、 0.05LMse I引物 （序列见表1） ， 0.15LTaq DNA聚合酶，。
16、 加超纯水至总体积为 20L。 说 明 书 CN 102676687 A 4 3/4 页 5 0031 PCR 反 应 条 件 ： 先 94 2min， 再 94 30s， 65 30s，（Touch down 至 56 ） ， 72 60s， 10 个循环后变为 ： 94 30s， 56 30s， 72 60s， 26 个循环。反应结束后用 2% 琼 脂糖电泳检测选择性扩增效果， 并将产物浓度稀释到 Marker 亮度的 1/10。扩增反应产物 4保存备用。 0032 6、 ABI3730 条带分型 0033 将浓度调整后的选扩增产物转移到 96 孔板中， 按照每个反应中 9L 稀释产物、 。
17、0.1L 内标 （LIZ-500Size Standard， Applied Biosystems） 及 0.9L Hidi 甲酰胺进行混 合。后将上述混合物至于 -20冰中冷却 5 分钟后， 迅速转移至 95加热， 使混合物彻底变 性。最后， 将载有混合物的 96 孔板置于 ABI3730 测序仪中进行分型。 0034 7、 运用 Genemapper 4.0 进行条带读取与分析。 0035 表 1 本发明引物序列信息 0036 0037 0038 利用本发明的引物组合对中国对虾种群的 AFLP 指纹技术鉴定结果如表 2 所示。 0039 根据表2， 可以快速、 准确地对中国对虾种群进行鉴定。
18、。 例如， 在E-AGT/M-CTG引物 组合扩增得到的条带中， 如果某群体中所有个体均在 97bp 和 257bp 两个位点均出现条带， 则该群体为威海放流群体。依此法可对中国对虾种群进行判定。 0040 表 2AFLP 指纹技术对中国对虾种群的鉴定结果 （仅列出有特异性条带群体） 0041 说 明 书 CN 102676687 A 5 4/4 页 6 0042 0043 同时， 为了验证本发明的可靠性， 我们在样品库中随机选择了 10 尾 （来自同一个 群体） 进行抽样检查， 每个样品均用 4 对引物组合进行选择性扩增。结果表明， 在引物组合 E-AGT/M-CTG中， 10尾样品均在97bp中出现条带， 根据表2， 将样品缩小至营口亲虾、 威海放 流两个群体。在引物组合 E-AGT/M-CTT 中， 所有样品在 58bp 中出现特异性条带。在引物组 合 E-AGT/M-CTT 和 E-AGT/M-CTT 中并未出现特异性条带。综上， 判定随机抽取的样品应为 营口亲虾样品。 说 明 书 CN 102676687 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102676687 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102676687 A 8 。