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1、(10)申请公布号 CN 102618527 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618527 A *CN102618527A* (21)申请号 201110029278.8 (22)申请日 2011.01.27 CGMCC No.2377 2008.02.26 C12N 11/14(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 中国科学院生态环境研究中心 地址 100085 北京市海淀区双清路 18 号 (72)发明人 白志辉 满鹏 马安周 金波 王谦 庄国强 (54。
2、) 发明名称 柠檬酸废水资源化生产多粘类芽孢杆菌微生 物菌剂 (57) 摘要 本发明涉及一种柠檬酸废水资源化生产多粘 类芽孢杆菌微生物菌剂的方法， 属于微生物菌剂 和废水资源化技术领域。该方法主要是以柠檬酸 生产过程中产生的高浓度有机废水为主要培养基 原料， 采用液态发酵的方法生产多粘类芽孢杆菌 微生物菌剂。生产工艺包括 ： (1) 柠檬酸废水 pH 调节和灭菌 ； (2) 接种斜面保藏的多粘类芽孢杆 菌， 振荡培养获得液体种子 ； (3) 向装有柠檬酸废 水培养基的发酵罐中接种液体种子， 通无菌空气 培养得到液态发酵产物 ； (4) 发酵液与生物碳混 合获得固体菌剂。该工艺生产的多粘类芽孢杆。
3、菌 微生物菌剂， 具有生产成本低、 环境友好的特点， 产品能明显改善土壤环境质量、 提高作物产量和 品质， 而且能够防治多种植物病害。 同时为柠檬酸 生产过程中产生的大量高浓度废水找到有效的资 源化利用方法， 减少污染物排放。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种利用柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa) 微生物菌剂 的方法， 其特征在于， 该方法是以柠檬酸生产过程中产生的高浓度有机废水为。
4、主要培养基 原料进行液态发酵生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂， 包括如下步骤 ： (1) 柠檬酸废水预处理 ： 用氢氧化钠水溶液调节废水的 pH 到 6.5 7.5， 于 115 126灭菌 10 35 分钟 ； (2) 液体种子制备 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的多粘类 芽孢杆菌， 于 30 37， 120 200 转 / 分振荡培养 24 48 小时， 得到液体种子 ； (3) 液态发酵 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为 2 15的液 体种子， 于 25 35， 通无菌空气培养 12-48 小时 ； 培养好的发酵液经平板细菌计数， 活菌 数达到 510。
5、8CFU/ 毫升以上 ； (4) 菌剂制备 ： 以过 30 目筛的生物碳为载体， 按照发酵液生物碳为 1 1.2 5 的 重量比， 将发酵液添加到生物碳中， 充分混合均匀， 得到固态菌剂， 通风干燥至菌剂含水量 30以下， 包装， 存放在阴凉干燥处。 2. 权利要求 1 中所述的多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)， 其特征在于， 该 菌株于 2008 年 2 月 26 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编 号为 ： CGMCC No.2377。 权 利 要 求 书 CN 102618527 A 2 1/3 页 3 柠檬酸废水资源化生产多粘类。
6、芽孢杆菌微生物菌剂 技术领域 ： 0001 本发明属于微生物菌剂和废水资源化技术领域。 背景技术 ： 0002 柠檬酸作为一种重要的化工原料和食品添加剂被广泛应用于食品、 医药、 化工等 行业。目前， 中国有柠檬酸生产厂近百家， 总年产能力约 80 万吨， 是全球最大的柠檬酸生产 国和出口国， 出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过 60。柠檬酸的生产是以薯干或 玉米为原料， 依次经原料处理、 发酵、 提取、 精制等工序制得产品。 柠檬酸废水主要来自发酵 和提取工序产生的中和液、 洗糖水、 洗罐水和洗滤布水。 废水中主要含有淀粉、 蛋白质、 碳水 化合物、 各种有机酸、 氨氮和脂肪等， COD。
7、浓度为2000030000mg/L， 属于高浓度有机废水。 据统计， 每生产 1 吨柠檬酸， 产生高浓度废水 7.5 15 吨。直接排放会对环境将造成严重 污染， 处理达标排放费用高昂。 0003 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在自然界中分布广泛， 是一种重要的 生防菌， 对多种植物真菌、 细菌病害均有较好的防治作用。 王智文等报道了一株多粘类芽孢 杆菌 Cp-S316 菌株对动植物真菌、 细菌病原物具有广谱抗性， 利用大孔吸附树脂对多粘类 孢杆菌 Cp-S316 产生的抗真菌活性物质的吸附、 解吸性能， 筛选出其最佳解吸剂， 该活性物 质对热、 紫外线稳定， 。
8、对胰蛋白酶、 蛋白酶 K 有一定的耐受性， 对氯仿部分敏感， 对酸稳定， 对碱敏感 ( 王智文， 袁士涛， 何亮等， 多粘类芽孢杆菌 Cp-S316 抗真菌活性物质的提取及其 部分性质研究， 农业环境科学学报， 2007， 26(4) ： 1464-1468)。中国专利 ( 授权公告号 ： CN 1169942C) 中报导培养的 Paenibacillus polymyxa HY96-2 及其发酵上清液可以用来防止 植物细菌性青枯病， 而且还可用来防治植物苗期立枯病， 猝倒病， 以及黄瓜枯萎病， 番茄枯 萎病， 茄子枯萎病， 大豆根腐病， 并且对植物具有十分明显的促进生长作用。中国专利 ( 授。
9、 权公告号 ： CN1186441C) 中公开了 Paenibacillus polymyxa 可以作为微生物肥料菌剂中 的一种成分分解秸秆， 有效解决农业生产中一方面农业垃圾过多， 污染水体和环境， 处理困 难， 另一方面化肥， 农药使用过多， 土壤恶化的矛盾。 中国专利(授权公告号 ： CN 1325635C) 中公开了 Paenibacilluspolymyxa Jaas cd 可以在较低的浓度下进入植物体内， 并能在植 物体内定植， 繁殖和传导 ； 对植物同时具有促进生长， 提高产量， 防病抗病的作用， 特别是对 土传维管束病害具有良好的防治效果。 0004 多粘类芽孢杆菌的生产方法有。
10、多种， 如 ： 中国专利 ( 公开号 ： CN 1844360A) 中 公开了一种多粘类芽孢杆菌的生产方法， 其培养基为豆渣。中国专利 ( 授权公告号 ： CN 1186441C) 中使用庖肉培养基作为多粘类芽孢杆菌发酵培养基。以柠檬酸废水为主要培养 基原料生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂的方法未见文献报道。 发明内容 ： 0005 本发明的目的是提供一种能够资源化利用柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌微生 物菌剂的方法。 说 明 书 CN 102618527 A 3 2/3 页 4 0006 本发明所使用的菌株是由发明人分离筛选出来的一株高效促进植物生长、 拮抗 植物病原菌的多粘类芽孢杆菌 (Paen。
11、ibacillus polymyxa)EBL-06 菌株， 该菌株于 2008 年 2 月 26 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 ： CGMCC No.2377， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮 编 ： 100101。 0007 本发明所述的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂的生产方法如下 ： 0008 1、 柠檬酸废水预处理 ： 用氢氧化钠水溶液调节废水的 pH 到 6.5 7.5， 于 115 126灭菌 10 35 分钟。 0009 2、 液体种子制备 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的。
12、多粘 类芽孢杆菌， 于 30 37， 120 200 转 / 分振荡培养 24 48 小时， 得到液体种子。 0010 3、 液态发酵 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为 2 15的 液体种子， 于 25 35， 通无菌空气培养 12-48 小时 ； 培养好的发酵液经平板细菌计数， 活 菌数达到 5108CFU/ 毫升以上。 0011 4、 菌剂制备 ： 以过 30 目筛的生物碳为载体， 按照发酵液生物碳为 1 1.2 5 的重量比， 将发酵液添加到生物碳中， 充分混合均匀， 得到固态菌剂， 通风干燥至菌剂含水 量 30以下， 包装， 存放在阴凉干燥处。 具体实施方式 ： 00。
13、12 由本发明技术方案生产的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂能够促进作物对养分的吸 收和利用， 减少化肥的使用量， 能有效防治多种真菌类植物病害， 减少农药的使用量， 从而 改善农田环境质量 ； 而且生产成本低， 有效地利用了废水， 减少污染物排放。具体实施方式 如下 ： 0013 实施例 1 ： 柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂 0014 柠檬酸废水预处理 ： 用氢氧化钠水溶液调节废水pH到7.0， 于121灭菌20分钟。 0015 液体种子制备 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的多粘类 芽孢杆菌， 于 32， 150 转 / 分振荡培养 30 小时， 得到液体种子。 00。
14、16 液态发酵 ： 向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种 5 ( 体积比 ) 的液体 种子， 于 32， 通无菌空气培养 16 小时 ； 培养好的发酵液经平板细菌计数， 活菌数达到 3109CFU/ 毫升。 0017 菌剂制备 ： 以过30目筛的生物碳为载体， 按照发酵液生物碳为12的重量比， 将发酵液添加到生物碳中， 充分混合均匀， 得到固态菌剂， 通风干燥至菌剂含水量 30以 下， 包装， 存放在阴凉干燥处。 0018 实施例 2 ： 多粘类芽孢杆菌微生物菌剂应用于油菜生产 0019 采用蔬菜大棚小区实验， 设置 8 个条件完全相同的实验小区， 每个小区 60m2， 2 个 小区为1组平。
15、行试验， 共分成4组， 种植油菜， 在油菜幼苗期， 第1组2个小区不施肥作对照 ； 第 2 组 2 个小区按照 50 公斤 / 亩的用量在油菜完全发芽后和 3 周后各追施多粘类芽孢杆 菌微生物菌剂一次 ； 第 3 组 2 个小区按照 15 公斤 / 亩的施肥量在油菜完全发芽后和 3 周后 各施用尿素一次 ； 第 4 组 2 个按照 15 公斤 / 亩的施肥量在油菜完全发芽后和 3 周后各施用 尿素一次， 并在每次施用尿素后 1 天按照 50 公斤 / 亩的施肥量追施微生物菌剂一次， 各小 说 明 书 CN 102618527 A 4 3/3 页 5 区相同的灌溉和管理方式。油菜生长 5 周后调。
16、查产量和品质。单独施用微生物菌剂和单独 施用尿素的油菜产量基本一致， 都比不施肥的对照小区增产 60左右 ； 两种肥料都施用的 比对照小区增产 90左右 ； 油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量以不施肥和单独施用微生物菌 剂的最低， 还不到国家标准限量值的 1/3， 施用尿素后又施用微生物菌剂的也不到国家标准 限量的1/2， 而单独施用尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量都超标严重。 表明该微生物菌 剂既有良好的增产效果， 又可以明显提高油菜的品质。 0020 实施例 3 ： 多粘类芽孢杆菌微生物菌剂防止黄瓜猝倒病 0021 黄瓜猝倒病是由真菌侵染引起的病害。采集多年种植黄瓜的温室大棚中的土壤， 混合均匀， 装入花盆中， 设置 2 组花盆， 每组 10 盆， 至于 15 16的温室中， 保持较高湿 度和较低的光照强度。第 1 组花盆直接播种黄瓜种子， 每盆 30 粒， 作为对照。第 2 组播种 黄瓜种子前向土壤中拌入重量比为 0.2的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂， 然后每盆播种 30 粒种子。幼苗出土后统计总数， 幼苗长出 1 片真叶后， 2 片真叶前统计倒伏苗总数。结果表 明， 对照幼苗倒伏率超过 50， 而添加菌剂的实验组， 幼苗倒伏率低于 10。 说 明 书 CN 102618527 A 5 。