本发明提供模板固定的β-发夹肽模拟物，其具有CXCR4拮抗活性， 并且包含在WO2004/096840A1的一般公布中，但非专门地只公布于 WO2004/096840A1。
本发明的β-发夹肽模拟物为Cyclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala -DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-DPro-Pro)及其药学可接 受的盐，Cys4和Cys11之间为二硫键，其中X为Ala或Tyr。
根据本发明，前述的β-发夹模拟物及药学可接受的盐可以通过包 含以下步骤的过程而制备
(a)将适当官能化的固体支持物与Pro的具有适当N-保护的衍生 物相偶联；
(b)从步骤(a)中得到的产物上去除N-保护基团；
(c)将如此得到的产物与DPro的具有适当N-保护的衍生物相偶 联；
(d)从如此得到的产物上去除N-保护基团；
(e)将如此得到的产物与位于所需终产物14号位的氨基酸，即Lys 的具有适当N-保护的衍生物相偶联，该侧链上的氨基基团也同样有适 当的保护；
(f)从如此得到的产物上去除N-保护基团；
(g)实施基本上对应于步骤(e)和(f)的步骤，但使用位于所需终 产物13-1号位的氨基酸，即Gln，Tyr，Cys，Tyr，Arg，Dab，DPro，Ala， Ser，Cys，Ala或Tyr，His和Tyr的具有适当N-保护的衍生物，所述N- 保护的氨基酸衍生物上可能存在的任何官能团都同样有适当的保护；
(h)在4号及11号位Cys残基的侧链之间形成二硫β链连接；
(i)将如此得到的产物从固体支持物上分离；
(j)环化从固体支持物上切割下的产物；
(k)去除在氨基酸残基链的任一成员的官能团上存在的任何保护 基团；以及
(l)如果需要，将如此得到的产物转化为药学可接受的盐，或者 将如此得到的药学可接受或不可接受的盐转化为相应的游离化合物或 转化为不同的药学可接受的盐。
前述过程中的步骤可通过肽化学领域中任何适当技术人员所熟知 的方法而施行。
本发明的β-发夹肽模拟物可广泛应用于预防健康个体HIV感染 或应用于减慢及阻止已感染患者中的病毒进程；或者用于由CXCR4受 体活性介导或导致的癌症之中；或者用于由CXCR4受体活性介导或导 致的免疫学疾病之中；或者用于治疗免疫抑制；或者用于治疗炎症或 尤其是用于外周血干细胞及/或间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)及/或依赖于CXCR4-受体得以保留的其他干细胞的干细胞动员。
本发明的β-发夹肽模拟物可以以自身进行给药或与本领域熟知 的载体、稀释剂或赋形剂一起形成合适的制剂而应用。
具体而言，本发明的β-发夹肽模拟物可用于处理以增加用于同种 异体或自体移植中从骨髓释放的造血干细胞(HSC，hematopoetic stem cell)。
输注HSC进行急性治疗广泛用于在患者中恢复免疫系统，这些患 者在治疗恶性疾病如多发性骨髓瘤及非霍奇金淋巴瘤的过程中接受了 清髓性疗法。用HCS动员剂，如本发明的化合物，治疗患者或捐献者， 接着从外周血中用单采术(apharesis)收集细胞。在例如化疗治疗之 后将HCS移植回患者(自体移植)或将其从捐献者移植入接受者(异 体移植)，这样促进了免疫功能的重建(Frühauf等人，Br.J. Haematol.122，360-375(2003))。
HSC治疗的其他应用包括但不限于在例如心脏病发作情况下的治 疗性血管生成(Shepherd RM等人，Blood 2006 108(12)：3662-3667)。
本发明的β-发夹肽模拟物还可以用于治疗或预防HIV感染或癌 症，例如乳腺癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、非 霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、胰 腺癌、黑色素瘤、血管生成和造血组织；或炎症性病症如哮喘、过敏 性鼻炎、超敏性肺部疾病、超敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、迟发型超 敏反应、间质性肺炎(interstitial lung disease(ILD))、特发 性肺纤维化、风湿性关节炎关联性ILD、全身性红斑狼疮、脊椎炎、 末梢血管疾病、全身性硬化症、干燥综合症、von Hippel Lindau病、 全身性过敏反应或超敏反应应答、药物过敏、风湿性关节炎、牛皮癣 关节炎、口眼生殖器综合症、粘膜炎、克隆氏病、多发性硬化、重症 肌无力、青少年型糖尿病、肾小球性肾炎、自身免疫性甲状腺炎、移 植排斥(包括同种异体移植排斥或移植物抗宿主病)、炎症性肠病、 炎症性皮肤病；或用来治疗免疫抑制，包括由移植物/抑制排斥诱发的 免疫抑制。
本发明的β-发夹肽模拟物可以以超过一种β-发夹肽模拟物的混 合物形式单独进行给药，在可能的情况下联合其他HSC动员剂、或抗 HIV试剂、或抗微生物试剂、或抗癌试剂、或抗炎试剂、和/或联合其 他药学活性试剂进行给药。
包含本发明的β-发夹肽模拟物的药学组合物可以借助于常规的 混合、溶解、造粒、包衣片制作、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过 程而制造。药学组合物可以以常规方式制剂，使用一种或多种生理学 可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂，其促进加工活性β-发夹肽模 拟物成可作药用的制备物。恰当的制剂依赖于所选择的给药方法。
对于局部给药，本发明的β-发夹肽模拟物可以制剂为溶液、凝胶 剂、软膏剂、霜剂、混悬剂等，这些在本领域已经熟知。
全身性制剂包括设计为通过注射给药的制剂，例如，皮下、静脉 内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射，以及设计用于透皮、透粘膜、口服 或肺部给药。
对于注射，本发明的β-发夹肽模拟物在合适的溶液中进行制剂， 优选地为在生理适应性缓冲液如Hank′s溶液、Ringer′s溶液、生理 盐水缓冲液。这些溶液可以含有制剂性试剂如悬浮、稳定和/或分散试 剂。
备选地，在使用前，本发明的β-发夹肽模拟物可以与适当的载体 ——例如，灭菌无热原的水——联合以粉末形式存在。
对于透粘膜给药，在制剂时如本领域熟知地使用适合于待渗透屏 障的穿透剂。
对于口服给药，这些化合物能通过将本发明的活性β-发夹肽模拟 物与本领域熟知的药学可接受载体联合而容易地进行制剂。这种载体 使得本发明的β-发夹肽模拟物可以制剂为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、 液剂、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬剂等，使之能被待治疗的患者口服 摄取。对于口服制剂，如，粉剂、胶囊及片剂，合适的赋形剂包括填 充剂如糖类，例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备物如 玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤 维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；粒化剂；及粘合剂。如 果需要，可以添加分裂剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂糖或海藻 酸或其盐，如海藻钠。如果需要，固体制剂形式可以使用标准技术进 行糖衣或肠衣化。
对于口服液体制备物如，例如，混悬剂、酏剂及溶液，合适的载 体、赋形剂或稀释剂包括水、二醇类、油类、醇类等。另外，可以添 加香味剂、防腐剂、着色剂等。
对于颊部给药，该组合物可以采用片剂、含片剂等形式，按常规 方法制剂。
对于吸入给药，本发明的β-发夹肽模拟物可以方便地以来自压缩 包装或喷雾器中气溶胶喷雾的形式递送，其中使用适当的挥发剂，例 如二氯二氟甲烷、三氯二氟甲烷、二氧化碳或适当的气体。在压缩气 雾剂的情况下，通过提供阀门以确定剂量单位从而递送一定计量的量。 在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒，可以制剂为含有 本发明的β-发夹肽模拟物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末 混合物。
这些化合物还可以制剂为直肠或阴道组合物，如连同合适栓剂基 质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂。
除上述的制剂之外，本发明的β-发夹肽模拟物还可以制剂为沉淀 制备物。这些长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉 内注射进行给药。对于这些沉淀制备物的制备，本发明的β-发夹肽模 拟物可与适当的聚合物或疏水材料(例如可接受油类中的乳化物)或 离子交换树脂或以难溶盐进行制剂。
此外，可以采用其他药学递送系统，如本领域熟知的脂质体和乳 化剂。也可以采用某些有机溶剂如二甲基亚砜。另外，本发明的β- 发夹肽模拟物还能通过缓释系统进行递送，如含有治疗剂的固相聚合 物的半透性基质。已确定有多种缓释材料，且是本领域技术人员熟知 的。根据其化学性质，缓释胶囊可以在几周到超过100天的时间内释 放化合物。根据治疗剂的化学性质和生物学稳定性，可能采用附加的 策略以稳定蛋白质。
由于本发明的β-发夹肽模拟物含有带电残基，所以它们可以照原 样或作为药学可接受的盐包含于任何上述制剂当中。药学可接受的盐 比其相应的游离形式倾向于在水性或其他质子溶剂中更易溶解。尤其 合适的药学可接受的盐包括具有以下物质的盐，羧酸、磷酸、磺酸及 氨基磺酸，例如醋酸、丙酸、辛酸、癸酸、正十二烷酸、乙醇酸、乳 酸、延胡索酸、琥珀酸、脂肪酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、 酒石酸、柠檬酸、氨基酸，如谷氨酸或氨基丁二酸、顺丁烯二酸、羟 基顺丁烯二酸、甲基顺丁烯二酸、环己烷羧酸、金刚烷甲酸、苯甲酸、 水杨酸，4-氨基水杨酸、邻苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸、桂皮酸、甲 烷-或乙烷-磺酸，2-羟乙基磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘 磺酸、1，5-萘二磺酸钠、2-，3-或4-对甲苯磺酸、甲基硫酸、乙基 硫酸、十二烷基硫酸、N-环己氨磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-正丙 基-氨基磺酸，及其他有机质子酸，如抗坏血酸。合适的无机酸例如是 氢卤酸，如盐酸、硫磺酸和磷酸。
在游离形式或药学可接受的盐形式下的本发明的β-发夹肽模拟 物，或其组合物，通常以实现预定的目的的有效量来使用。需要理解 的是所使用的量应当取决于具体的应用。
对于局部给药以治疗或预防HIV感染，治疗有效剂量可以通过使 用例如实施例中提供的体外测定法来确定。当HIV感染可见或甚至不 可见时都可以应用这种治疗。普通的技术专家就能够确定治疗局部 HIV感染的治疗有效剂量，无需过度实验。
对于全身性给药，治疗有效剂量一开始可以由体外测定法来估计。 例如，可以在动物模型中配制剂量以实现如下的循环β-发夹肽模拟物 浓度范围，该范围包括在细胞培养物中确定的IC50值(即对50％细胞 培养物致死的测试化合物的浓度)。这些信息可用于更精确地确定用 于人的剂量。
还可以由体内数据，例如动物模型，使用本领域熟知的技术确定 初始剂量。本领域普通技术人员可以容易地根据动物数据最佳化对人 类的给药。
对于抗-HIV试剂的应用，其剂量可以个别地调整以提供足以维持 疗效的本发明的β-发夹肽模拟物的血浆水平。可以通过每天多次给药 而达到治疗有效的血清水平。
在局部给药或选择性摄取的情况下，本发明的β-发夹肽模拟物的 有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域普通技术人员即能够最佳 化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
所给药的β-发夹肽模拟物的量当然依赖于接受治疗的受试者，依 赖于受试者的体重、痛苦的严重性、给药的方式以及处方医师的判断。
当感染可检测或者甚至不可检测时可间歇地重复的抗-HIV疗法。 该疗法可以单独提供或者与其他药物，例如其他抗-HIV试剂或抗癌试 剂，或其他抗微生物试剂联合提供。
通常，本文所述的β-发夹肽模拟物的治疗有效剂量能提供治疗益 处而不会引起实质上的毒性。
本发明的β-发夹肽模拟物的毒性可以通过标准药学步骤在细胞 培养物或实验动物中确定，例如，通过确定LD50(对50％群体致死的剂 量)或LD100(对100％群体致死的剂量)。毒性及治疗效果之间的剂量 比值为治疗指数。显示出高的治疗指数的化合物是优选的。从这些细 胞培养测定法及动物研究中得到的数据可以用于配置对人使用无毒的 剂量范围。本发明的β-发夹肽模拟物的剂量优选地在包含有效剂量而 只有很少或没有毒性的循环浓度范围内。取决于所采用剂型和所用给 药途径，剂量在所述的范围内变化。确切的配方、给药途径和剂量可 以由个别药剂师根据患者状况选择(见，例如Fingl等人1975，于： The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ch.1，p.1)。
以下实施例更详细地示例说明了本发明，而无意于以任何方式限 制其范围。这些实施例中使用了下列缩写：
HBTU：1-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(Knorr等人. Tetrahedron Lett.1989，30，1927-1930)；
HOBt：1-羟基苯并三唑
DIEA：二异丙基乙胺
HOAT：7-氮杂-1-羟基苯并三唑
HATU：O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟 磷酸盐(Carpino等人.Tetrahedron Lett.1994，35，2279-2281)。
1.肽合成
第一个保护的氨基酸残基与树脂的偶联
将0.5g 2-氯三苯甲基氯树脂(100-200筛，共聚(苯乙烯 -1％DVB)聚合物基体，Cat.No.01-64-0114，Novabiochem，Merck Biosciences Ltd.)(Barlos等人Tetrahedron Lett.1989，30， 3943-3946)(1.4mMol/g，0.7mmol)填入干燥烧瓶。将树脂悬浮于 CH2Cl2(2.5ml)中，并且使之在室温下膨胀，持续搅拌30min。用0.49 mMol(0.7eq)第一个受到恰当保护的氨基酸残基及CH2Cl2(2.5ml) 中488μl(4eq)二异丙基乙胺(DIEA)处理树脂，将混合物在25℃振 荡4小时。振荡树脂(CH2Cl2/MeOH/DIEA：17/2/1)，30ml，30min；然 后以下面顺序洗涤，分别用CH2Cl2(1x)，DMF(1x)，CH2Cl2(1x)， MeOH(1x)，CH2Cl2(1x)，MeOH(1x)，CH2Cl2(2x)，Et2O(2x)洗涤且于真 空干燥6小时。
上样通常为0.6-0.9mMol/g。
制备以下预上样树脂：Fmoc-Pro-2-氯三苯树脂。
完全保护肽片段的合成
在Syro-肽合成仪(MultiSynTech GmbH)上进行合成，使用24到 96个反应容器。在每个容器中放置大约60mg(上样前树脂重量)上述 树脂。设定下列反应循环并进行反应：
步骤 试剂 时间
1 CH2Cl2，洗涤并膨胀(手工) 1×3min.
2 DMF，洗涤并膨胀 1×60min.
3 40％哌啶/DMF 2×5min.
4 DMF，洗涤 5×1min.
5 5equiv.Fmoc氨基酸/DMF
+5eq.HBTU
+10eq.DIEA 2×60min.
6 DMF，洗涤 5×1min.
7 40％哌啶/DMF 2×5min.
8 DMF，洗涤 5×1min.
9 CH2Cl2，洗涤(在合成结束时) 3×1min.
重复步骤3-6以加入各个氨基酸。
分析方法：
使用Jupiter Proteo 90A 柱，150×2.0mm，(cod.00F-4396-B0- Phenomenex)测定分析型HPLC保留时间(RT，以分钟计)，使用下列 溶剂A(H2O+0.1％TFA)和B(CH3CN+0.1％TFA)并且梯度为：0min： 95％A，5％B；0.5min：95％A，5％B；20min：40％A，60％B；21min：0％A， 100％B；23min：0％A，100％B；23.1min：95％A，5％B；31min：95％A， 5％B。
形成二硫β链连接
合成完成后，将树脂在3ml干燥DMF中膨胀1h。接着将10eq.溶于 DMF(6ml)的碘溶液加入反应器中，随后搅拌1.5h。过滤树脂，并加 入溶于DMF(6ml)的碘(10eq.)的新鲜溶液，接着再搅拌3h。过滤树 脂并用DMF(3x)及CH2Cl2(3x)洗涤。
肽的切割、骨架环化、去保护及纯化
形成二硫β链连接之后，将树脂悬浮于1ml(0.14mMol)溶于 CH2Cl2(v/v)中的1％TFA以3分钟，并过滤，滤出液用1ml(1.15mMol) 溶于CH2Cl2(v/v)中的20％DIEA中和。此步骤重复两次以保证切割完 全。树脂用1ml CH2Cl2洗涤三次。CH2Cl2层蒸发至干燥。
移除挥发物，并向管中加入8ml干燥的DMF。接着将溶于干燥DMF (1ml)的2eq.的HATU及溶于干燥DMF(1ml)的4eq.DIPEA加到肽中， 接着搅拌16h。挥发物蒸发至干燥。将粗品环化肽溶解于7ml的CH2Cl2中并用溶于H2O(4.5ml)的10％乙腈提取三次。CH2Cl2层蒸发至干燥。 为完全去保护肽，加入3ml的切割混合物TFA∶TIS∶H2O(95∶2.5∶2.5)， 混合物放置2.5h。挥发物蒸发至干燥，并将粗品肽溶解于溶于水(7ml) 的20％AcOH中，并用异丙醚(4ml)提取三次。收集水相层并蒸发至干 燥，通过制备型反相HPLC纯化残基。
冷冻干燥后得到白色粉末状产物，并使用上述的HPLC-ESI-MS分析 方法对其分析。得出制备型HPLC及ESI-MS后的包括纯度的分析数据。
实施例1：由植入树脂的氨基酸L-Pro开始进行肽合成。起始树脂 为按上述方法制备的Fmoc-脯氨酸-2-氯三苯树脂。依照上述步骤在固 体支持物上，按下列顺序合成线性肽：Resin-Pro-DPro- Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Ala-His-Tyr。如 上所述，引入了一种二硫β链连接。产物从树脂上切割下来、进行环 化、去保护并如文所述通过制备型反相LC-MS而纯化。冷冻干燥后得到 白色粉末状产物，并使用上述的HPLC-ESI-MS分析方法对其分析 ([M+2H]2+：933.1；RT：10.47；UV-纯度：72％)。
实施例2：由植入树脂的氨基酸L-Pro开始进行肽合成。起始树脂 为按上述方法制备的Fmoc-脯氨酸-2-氯三苯树脂。依照上述步骤在固 体支持物上，按下列顺序合成线性肽：Resin-Pro-DPro- Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Tyr-His-Tyr。如 上所述，引入二硫β链连接。产物从树脂上切割下来、进行环化、去 保护并如文所述通过制备型反相LC-MS而纯化。冷冻干燥后得到白色粉 末状产物，并使用上述的HPLC-ESI-MS对其分析([M+2H]2+：978.6；RT： 10.95；UV-纯度：82％)。
2.生物学方法
2.1.肽的制备。
冻干的肽在微天平(Mettler MT5)上称重并溶于无菌水，如无其他 说明，终浓度为1mM。储备液保存于+4℃，避光。
2.2.Ca2+-测定法：肽的CXCR4-拮抗活性。
使用Flexstation 384(Molecular Devices，Sunnyvale，CA) 监视细胞内钙离子的增加以在稳定转染了人类CXCR4的小鼠pre-B细胞 系300-19中就CXCR4拮抗作用测定肽[见参考文献1，2和3，下文]。在 测定缓冲液(Hanks平衡盐溶液，HBSS，20mM HEPES，pH 7.4，0.1％BSA) 中，使用Calcium 3 Assay kit(Molecular Devices)批量加样细胞， 置于室温1h再将200,000个标记的细胞分散到黑色96孔测定板 (Costar No.3603)中。将测定缓冲液中肽的20倍浓缩溶液加到细胞， 并将整个板子离心使细胞沉到孔底。由10nM基质衍生因子-1 (stromal-derived factor-1(SDF-1))诱导的钙离子动员在 Flexstation384(激发波长，485nM；发射波长，525nM)中90秒进 行测量。基线以上的荧光反应最大变化用于计算拮抗剂活性。使用 SoftmaxPro 4.6(Molecular Devices)将剂量应答曲线的数据(拮抗 剂浓度比％最大应答)拟定为一个四参数的对数方程，据此可以计算出 IC50％值。
2.3.FIGS-测定法TM
按参考文献5进行该项测定法。通过室温下溶解于10μM Tris-HCl 而制备肽的储备稀释液(10μM)。储备液保存于+4℃，避光。在磷酸缓 冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline(PBS))进行序列稀释临时 制备工作稀释液，以终体积10μl直接加入细胞培养物中。48小时的共 培养之后，用PBS漂洗培养物，接着暴露于溶于PBS的戊二醛/甲醛 (0.2％/2％)五分钟。对于光度计定量，接着将固定的培养物与邻硝基 酚苯半乳糖苷(ONPG)孵育，ONPG为β-半乳糖苷酶底物，能被酶催化转 化为邻硝基酚发光团(ONP)。通过在iEMS96孔板读取器中测量各个孔的 405nm处吸光度而得到直接读数。
2.4.细胞毒性测定
使用MTT还原测定法确定了肽对HELA细胞(Acc57)及COS-7细胞 (CRL-1651)的细胞毒性[见参考文献6和7，下文]。简言之，这个方 法如下：将HELA细胞及COS-7细胞分别以每孔7.0×103和4.5×103个细 胞接种，在37℃、5％ CO2下于96孔微量滴定板中生长24小时。在这点 上，通过MTT还原来测定时间零点(Tz)(见下文)。弃去其余孔的上 清，并将新鲜培养基和序列稀释的12.5、25和50μM的肽吸入孔中。每 种肽浓度都一式三份测定。细胞的孵育在37℃、5％ CO2下继续48小时。 之后用PBS对孔进行一次洗涤，接着向孔中加入100μl MTT试剂(0.5 mg/mL分别溶于培养基RPMI1640和DMEM中)。将其于37℃下孵育2小 时，接着吸去培养基，并向每个孔中加入100μl的异丙醇。测量溶解 产物在595nm处的吸光值(OD595肽)。对于每个浓度计算一式三份的平 均值。生长百分数如下计算：(OD595肽-OD595Tz-OD595空白孔)/(OD595Tz- OD595空白孔)×100％，对每个肽浓度作出曲线。
使用关于浓度(50、25、12.5和0μM)的EXCEL(Microsoft Office 2000)趋势线函数、相应的生长百分比和值-50，(＝TREND(C50:C0， ％50:％0，-50))测定每个肽的LC 50值(致死浓度，定义为杀灭50％ 细胞的浓度)。使用关于浓度(50、25、12.5和0μg/ml)的趋势线 函数、相应的百分比和值50(＝TREND(C50:C0，％50:％0，50))计算 每个肽的GI 50(生长抑制)浓度。
2.5.细胞培养
将′CCR5′细胞培养在含有4500mg/ml葡萄糖、10％胎牛血清(FBS)， 补加50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Pen/Strept.)的DMEM培养基 中。将Hut/4-3细胞培养在含有10％FBS，补加Pen/Strept和10mM HEPES的RPMI培养基中。将HELA细胞及CCRF-CEM细胞培养在添加5％ FBS、Pen/Strept和2mM L-谷氨酸的RPMI1640培养基中。将Cos-7细 胞培养在含有4500mg/ml葡萄糖且补加10％FCS，Pen/Strept和2mM L- 谷氨酸的DMEM培养基中。所有细胞系都培养在37℃、5％ CO2下。细胞 培养基、培养基补充物、PBS-缓冲液、HEPES，Pen/Strept.，L-谷氨 酸及血清均购自Gibco(Pailsey，UK)。所有精细化学品购自Merck (Darmstadt，Germany)。
2.6.溶血
就其针对人类红细胞(hRBC)的溶血活性测试肽。通过2000×g下离 心10min，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)将新鲜hRBC洗涤三次。将100μM 浓度的肽与20％v/v hRBC在37℃下孵育1小时。最终的红细胞浓度大约 为0.9×109个细胞每毫升。细胞裂解值0％和100％分别由hRBC在只有PBS 存在时和0.1％Triton X-100水溶液的孵育情况确定。将样本离心并用 PBS缓冲液20倍稀释上清，测量样本在540nM处的吸光度(OD)。100％ 裂解值(OD540H2O)得到OD540大约为1.3-1.8。溶血的百分比用以下公式计 算：(OD540肽/OD540H2O)×100％。
2.7.趋化性测定法(细胞迁移测定法)
使用来自Neuroprobe的一次性测定板(孔径尺寸为5μ) (Gaithersburg，MD)，按照生产商的说明书和其中的参考文献[尤其是 参考文献8，见下文]测量CCRF-CEM细胞对基质细胞衍生因子 -1α(SDF-1)梯度的趋化反应。简言之，用Dubecco′s磷酸盐缓冲盐溶 液(DPBS)洗涤175cm3培养瓶一次，用胰酶消化10分钟或消化至细胞 浮起来。加入含血清新鲜培养基来中和胰酶，并将细胞沉淀，在DPBS 中洗涤一次，并以1-0.5×107个细胞/ml的浓度重悬于RPMI+0.5％牛 血清白蛋白(BSA)中。将45μl细胞悬液与5μl稀释于相同测定培养基 中的10倍浓缩的PEM肽相混合。将35μl这种混合物加到测定滤器顶 部。使细胞迁移(37℃下)到含有1nM SDF-1的测定板的底部小室。4 小时后，移去滤器并向迁移的细胞添加MTT，至终浓度为0.5mg/ml， 再孵育4小时。在用MTT标记后，移去所有培养基并向细胞添加100μl 的异丙醇+10mM HCl。使用Tecan Genios板读取器和Magellan软件 读出595nm处的吸光度(ABS595)。迁移细胞的数量通过将ABS595值与标 准曲线比较而得到，并用此细胞数量对SDF-1作图以得到反曲线并确定 IC50值，标准曲线是使用已知测定板上细胞数目而产生的。IC50值是 使用Microsoft Excel对于平均数据点引入对数曲线的趋势线功能而 确定的。
2.8.血浆稳定性
将405μl的血浆/白蛋白溶液置于聚丙烯(PP)管中并掺入45μl来 自100μM溶液B的化合物，溶液B由135μl PBS和15μl溶于PBS，pH 7.4的1mM肽衍生而来。向10kDa过滤板(Millipore MAPPB 1010Biomax 膜)的每个孔中转移150μl等分试样。对于″0分钟对照″：在PP管中放 入270μl PBS，再加入30μl储存溶液B并振荡。将150μl对照溶液置 于过滤板的一个孔，作为“过滤对照”。
进一步将150μl对照溶液直接放入接收孔(为滤出液保留)并作 为“非过滤对照”。整个板子加上蒸发盖都在37℃下孵育60min。血浆 样品(大鼠血浆：Harlan Sera实验室UK，人类血浆： Blutspendezentrum Zürich)在15℃、4300rpm(3500g)下离心至 少2h以获得100μl的滤出液。对于“血清白蛋白”-样品(新鲜制备的 人类白蛋白：Sigma A-4327，大鼠白蛋白：Sigma A-6272，都以40mg/ml 的浓度溶于PBS)离心大约1小时是足够的。接收PP板中的滤出液通过 LC/MS按如下方法进行分析：柱子：Jupiter C18(Phenomenex)，流 动相：(A)水中0.1％蚁酸和(B)乙腈，梯度：2分钟内5％-100％(B)， 电喷射离子化，MRM检测(三重四极杆)。测定峰面积并计算一式三份 值的平均值。通过：100-(100×T60/T0)以对照1和2的百分比(滤过的 和非滤过的时间点0min)来表示结合情况。随后计算这些值的平均数 (见参考文献9，下文)。
3.0.体内研究
3.1.小鼠的最大耐受量
a)实施例1中的化合物分散于注射用水或0.9％生理盐水中，在初 步研究中通过i.v.注射，对由一雄一雌小鼠(Cr1:CD1(ICR))组成的各 组进行给药，剂量水平为35、50、70、85、100、150、250或500mg/kg。 另外，包含两只雄鼠两只雌鼠的两组接受剂量水平分别为90和100 mg/kg，50mg/kg的剂量水平在包含一只雄鼠一只雌鼠的组别中进行重 复。
b)用实施例2中的化合物进行了最大耐受量研究(MTD)，使用的是 CD1小鼠(3只鼠/组)，进行了i.v.、ip和sc给药。
3.2.小鼠中重复毒性研究
在每天i.v.注射小鼠之后对实施例1的化合物的毒性及毒物动力 学进行研究，至少持续14天。12只雄鼠和12只雌鼠Cr1:CD1(ICR)组 成的各组接受含有对照物(50mM磷酸二氢钠缓冲液，含有0.9％w/v氯 化钠)的剂量制备物或8、24或40mg/kg/天的POL6326，剂量体积为5 mL/kg。每性别每组24个动物的卫星组在每个剂量水平都有。毒性评估 是基于死亡率、临床症状、摄食量、眼科检查、临床及解剖病理学及 毒物动力学评估。
3.3干细胞动员
a)小鼠模型：
本研究的目标是评价实施例1和实施例2的化合物动员造血祖细胞 从小鼠骨髓进入外周血的能力，使用的是体外造血克隆测定法 (hematopoietic colony assay)。在人类当中，关于祖细胞动员的 准确信息由单核粒细胞克隆形成单位粒细胞-单核细胞(CFU-GM)测定 法提供或由FACS分析确定CD34(+)细胞丰度而提供(见下文参考文献 10)。在小鼠中，CD34不是干细胞的有效标记物；相反CFU-GM用得更 普遍(见下文参考文献11)。
为评定实施例1和实施例2的化合物动员小鼠干细胞的能力 (CFU-GM)，对C3H/HeJ雌鼠(Jackson Laboratory)s.c注射5mg/kg的 实施例1和实施例2的化合物并且AMD3100(Broxmeyer，等人J Exp Med 201，1307-1318)作为参考用于干细胞动员，(目前正在进行III期 临床试验)。在每个时间点从每个测试组的5只动物中采集外周血样本， 并进行有核细胞的计数作为标准测定。
b)猴模型：
在猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))中进行了外周血造血干 细胞动员的评估。将实施例1的化合物对4只猴(2雄2雌)给药，给药 方式是在2分钟内进行慢速推注i.v.注射，通过FACS分析确定CD34(+) 细胞。还进行毒物动力学血液采样。
4.0.结果
以上2.2-2.8中描述的实验结果显示于下列表1和2当中。
表1
Ex. IC50(nM) Ca2+测定法 FIGS IC50(nM) 细胞毒性 LC50/GI50 Hela细胞 100μM的 溶血作用 IC50(μM) 细胞迁移测定法 1 5.5 n.d. ＞50 0.6 n.d. 2 4.1 24.7 94 0.3 0.5
n.d.：未测定
表2
Ex. 人血浆稳定性t1/2(min) 大鼠血浆稳定性t1/2(min) 1 ＞240 ＞240 2 ＞300 ＞300
3.1-3.3所述实验结果在此处下文给出。
4.1：小鼠中的MTD研究
a)MTD研究，实施例1的化合物
发现小鼠中实施例1的急性最低致死静脉内剂量水平超过90 mg/kg。
b)MTD研究，实施例2的化合物
三种给药途径所测试的最高剂量均为120mg/kg推注。在此剂量， 所有动物都存活并且只观察到温和的症状。所表现的症状为轻微的行 为抑郁、轻微紫绀以及呼吸深度增加和肌肉松弛。
4.2：14-天静脉内注射的毒性和毒代动力学研究
小鼠中i.v.给药之后.实施例1的化合物的NOAEL水平为40mg/kg/ 天。
对体重、体重变化或摄食量、或者在给药期最后一周中的眼科观 察，该治疗都没有显著的影响。
对于给予40mg/kg/天的雌鼠，实施例1化合物的给药与白细胞及 绝对淋巴细胞计数的轻微升高相联系。给予40mg/kg/天的雄鼠没有受 到相似的影响，而且不认为这些轻微的影响是不利的。临床化学结果 不受实施例1的化合物给药的影响。器官重量的增加(给予8mg/kg/天 的雄鼠的肾脏及给予24或40mg/kg/天的雄鼠的储精囊)被认为是偶发 的且与治疗无关。没有记录到测试物相关的肉眼可见损害。三只动物 (1只对照组雌鼠、1只8mg/kg/天的雄鼠和1只24mg/kg/天的雌鼠) 在注射点(尾巴)产生集中的红色硬皮区域，这是皮下注射器穿刺的 结果。也没有观察到测试物相关的显微镜下损伤。
4.3：干细胞动员
a)小鼠中的干细胞动员，实施例1的化合物
实施例1的化合物以5mg/kg进行给药增加了CFU-GM血细胞数目， 最大作用发生在120分钟，给药后6h回复到基线水平(图1)。在同样的 测定中，AMD3100(目前正在进行干细胞动员的III期临床试验)用作比 较物。在随访研究中，测定了实施例1对CFU-GM释放的剂量反应(图 1)。实施例1对小鼠中的CFU-GM释放具有明显的剂量反应作用，峰水平 增加为5mg/kg。
图1.对于实施例1化合物(5mg)及参考化合物AMD3100二者，每 毫升血液(CFU-GM)的克隆形成单位随时间的增加情况。
b)小鼠中的干细胞动员，实施例2的化合物
实施例2的化合物以5mg/kg进行给药在给药后长达6小时之内增 加了CFU-GM血细胞数目，最大作用发生在240分钟，而AMD3100的给药 与30和60分钟时相对于对照小鼠其祖细胞的频率和数目产生增加有关 (图2)。
图2.对于实施例2的化合物及参考化合物AMD3100二者，每毫升血 液(CFU-GM)的克隆形成单位随时间的增加情况
c)猴中的干细胞动员，实施例1的化合物：
实施例1的化合物给药在猕猴中诱导了CD34(+)造血细胞的动员。 如小鼠中所观察的，动员的起始非常迅速，在2小时达到峰水平。动员 也是暂时性的，外周血干细胞数目随着实施例1的化合物血浆水平下降 而回复到基线水平(图3)。
图3.对于实施例1的化合物，随时间每微升血液中CD34(+)细胞 的平均数目。
参考文献
1.Oberlin E，Amara A，Bachelerie F，Bessia C，Virelizier J-L，Arenzana-Seisdedos F， Schwartz O，Heard J-M，Clark-Lewis I，Legler DF，Loetscher M，Baggiolini M，Moser B.Nature.1996，382：833-835
2.Loetscher M，Geiser T，O’Reilly T，Zwalen R，Baggiolini M，Moser B.J.Biol.Chem. 1994.269：232-237
3.D’Apuuo M，Rolink A，Loetscher M，Hoxie JA，Clark-Lewis I，Melchors F， Baggiolini M，Moser B.Eur.J.Immunol.1997.27：1788-1793
4.von Tscharner V，Prod′hom B，Baggiolini M，Reuter H.Nature.1986.324：369-72.
5.Hamy F，Felder ER，Heizmann G，Lazdins J，Aboul-ela F，Varani G，Karn J，Klimkait T.Proc.Natl.Acad.Sci.1997.94：3548-3553.
6.Mossman T.J.Immunol.Meth.1983，65：55-63
7.Berridge MV，Tan AS.Arch.Biochem.Biophys.1993，303：474-482
8.Frevert CW，Wong VA，Goodman RV，Goodwin R，Martin TR，J.Immunol.Meth. 1998.213：41-52
9.Singh R.，Chang，S.Y.，Talor，L.C.，Rapid Commun.Mass Spectrom.，1996，10：1019- 1026
10.To LB，Haylock DN，Simmons PJ，Juttner CA.Blood 1997，89(7)：2233-2258.
11.Broxmeyer HE，Orschell CM，Clapp DW，Hangoc G，Cooper S，Plett PA et al..J Exp Med 2005.201(8)：1307-1318.