一种利用重组羰基还原酶催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201210137695.9

申请日:

20120507

公开号:

CN102618590A

公开日:

20120801

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:

IPC分类号:

C12P7/62,C12N15/70,C12N15/66,C12R1/19,C12R1/125

主分类号:

C12P7/62,C12N15/70,C12N15/66,C12R1/19,C12R1/125

申请人:

江南大学

发明人:

倪晔,宿宇宁,李海东,薛天芸

地址:

214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院

优先权:

CN201210137695A

专利代理机构:

无锡市大为专利商标事务所

代理人:

时旭丹;刘品超

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内容摘要

一种利用重组羰基还原酶催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法,属于生物工程技术领域。本方法从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基还原酶(IolS)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因片段,采用双启动子法串联表达IolS基因和GDH基因,构建重组质粒pET24a-G-T7-I,并将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。以该大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂,2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物,葡萄糖为辅底物,在不添加或添加少量NADP+辅因子的条件下,进行生物转化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,产物的对映体过量值高于99.5%。本发明通过IolS和GDH的共表达,实现细胞内辅因子NADP(H)的高效再生,降低了生产成本,具有很好的工业应用前景。

权利要求书

1.一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶,GenBank收录号:JQ782389,或者是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下,由插入、缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶,在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备()-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。 2.一种含权利要求1所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法,其特征在于从枯草芽孢杆菌()CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基还原酶IolS和葡萄糖脱氢酶GDH基因片段,采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因,构建了pET24a-G-T7-I质粒,将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)而获得的大肠杆菌重组质粒,实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达。 3.权利要求2所述方法构建的大肠杆菌重组质粒的应用,其特征在于以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂,2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物,葡萄糖为辅底物,在不添加或添加<0.05 mmol/L NADP辅因子的条件下,进行生物转化制备()-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,值大于99.5%;水相反应:100 mmol/L,pH值6.0的15 mL磷酸钾缓冲液,5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE和0.05 mM的NADP,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h;水/辛醇两相反应:100 mmol/L,pH值6.0的5 mL磷酸钾缓冲液,5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE,0.05mM的NADP以及10mL的辛醇,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌重组质粒无细胞提取物制备普利类药物关键手性中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法,属于生物工程技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的提高,高血压日益危害着人们的健康。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate,(R)-HPBE)是合成众多普利系列血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的关键手性中间体,如赖诺普利,依那普利,卡托普利等[1]。由于ACEI类药物的高效性和低副作用,其已成为目前市场上最畅销的药物之一。

以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯 (OPBE)作为还原反应的潜手性底物,易于合成且价格低廉,以其作为底物进行不对称还原反应获得(R)-HPBE是非常经济有效的制备途径。目前为止,(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成路线主要包括化学法和生物法。

化学法分为化学合成法和化学拆分法。化学合成法往往反应步骤复杂,且需要昂贵的试剂,或者反应条件十分苛刻。化学拆分法存在的问题是以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂,由于其价格昂贵,实用价值不大[2]。

生物法包括脂肪酶拆分法、野生菌催化法和基因工程菌催化法。生物拆分法方面,Lies等利用来自Pseudomonas cepaica的脂肪酶拆分外消旋2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,得到ee值大于99.5%的产物[3]。Inada等用微生物直接作用于2-羟基-4-苯基丁酸乙酯拆分得(R)-HPBE,产率和ee值分别可达42%和95%[4]。然而,外消旋体拆分的理论转化率仅为50%,不利于工业化生产。目前最受关注和研究最多的是生物合成法。野生菌催化方面,Chen 等人利用Candida boidinii成功制备了(R)-HPBE,ee值和产率分别为99%和92%[5]。Oda等用C. holmii还原OPBE,得到产率和ee值分别为58%和90%的(R)-HPBE[6]。由于野生菌中酶系复杂,可能含有多种不同的甚至相反的立体选择性的酶,所以很难达到99%以上的ee值。利用改造的基因工程菌对OPBE进行不对称还原生成(R)-HPBE的报道目前还比较少,Iwona等将所筛选的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因Ypr1p在大肠杆菌中表达纯化后获得的重组蛋白Ypr1P,在外加NAD+和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的条件下将OPBE不对称催化还原成ee值为97%的(R)-HPBE[7]。目前为止,利用重组的基因工程菌催化OPBE不对称还原成(R)-HPBE的报道中,ee值最高为98%。本发明中的重组羰基还原酶IolS可应用于不对称还原制备ee值大于99.5%的(R)-HPBE。

本专利中涉及到的羰基还原酶是醛酮还原酶的一种,全长310个氨基酸,其氨基酸序列如SEQ NO.2所示;编码该蛋白的基因长度为933bp,已提交至Genbank中,收录号为JQ782389,其基因序列如SEQ NO. 1所示。至今尚无关于该羰基还原酶用于OPBE不对称还原(R)-HPBE的公开报道。

【参考文献】

[1]Maruyama S, Nakagomi K, Tomizuka N, et al(1985) Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Agric Biol Chem 49: 1405-1409。

[2]张文(2009)生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯.[硕士学位论文].无锡:江南大学。

[3] Liese A, Kragl U, Kierkels H, et al(2002)Membrane reactor development for the kinetic resolution of ethyl 2-hydroxy-4-phenylbutyrate. Enzyme Microb Technol 30: 673-681。

[4]Inada Y, Oda S (l999) Microbial Manufacture of Optically Active 2-Hydroxycarboxylic Acid Esters.JP, 10304894。

[5]Chen Y Z, Lin H, Xu X Y, et al(2008) Preparation the key intermediate of angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitors: high enantioselective production of ethyl (R)-2-hydroxy -4-phenylbutyrate with Candida boidinii CIOC21. Adv Synth Catal 350: 426-430。

[6]Oda S, Inada Y, Kobayashi A, et al(1998) Production of ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutanoate via reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate in an interface bioreactor. Biosci Biotechnol Biochem 62: 1762-1767。

[7] Kaluzna I, Andrew A A, Bonilla M, et al(2002) Enantioselective reductions of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate by Saccharomyces cerevisiae dehydrogenases. J. Mol. Catal. B: Enzym 17(2): 101-105。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌无细胞提取物作为催化剂,应用于催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。该方法不需要添加或少量添加昂贵的辅酶,极大地降低了生产成本,且产物的光学纯度高,条件温和,易于工业化放大。

为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆出羰基还原酶IolS,氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆出葡萄糖脱氢酶GDH,核酸序列如SEQ NO. 3所示,氨基酸序列如SEQ NO. 4所示。

采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因,构建pET24a-G-T7-I质粒,将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。

一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶,GenBank收录号:JQ782389,或者是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下,由插入、缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶,在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。

一种含所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法,从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基还原酶IolS和葡萄糖脱氢酶GDH基因片段,采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因,构建了pET24a-G-T7-I质粒,将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)而获得的大肠杆菌重组质粒,实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达。

所述大肠杆菌重组质粒的应用,以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂,2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物,葡萄糖为辅底物,在不添加或添加少量NADP+辅因子(<0.05 mmol/L)的条件下,进行生物转化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,ee值大于99.5%;

水相反应:15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE和0.05 mM的NADP+,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h;

水/辛醇两相反应:5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE,0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h。

本发明构建的共表达重组质粒能够实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的高效共表达,可应用于高效催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,ee值大于99.5%。同时,通过采用水/辛醇两相反应体系、分批添加底物等方式,解决了底物和产物对酶的抑制作用,显著提高了转化效果。

本发明的有益效果:本发明首次将氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶应用于不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,取得了较好的效果,粗酶液中羰基还原酶的比酶活达到1.5 U/mg,产物的对映体过量值大于99.5%。通过与葡萄糖脱氢酶共表达,解决了辅因子的再生问题,且对羰基还原酶的酶活没有影响。在水/辛醇两相体系中,不对称还原20g/L的底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯,可获得ee值大于99.5%的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,转化率为70.4%。

附图说明

图1羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶PCR扩增产物电泳图谱。1:DNA marker;2:GDH基因;3:IolS基因。

图2重组质粒pET24a-G-T7-I的构建图。

图3大肠杆菌重组质粒中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图。

1:蛋白Marker;2:E.coliBL21(DE3)空白对照;3:E. coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I诱导后总蛋白;4:E. coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I诱导后可溶蛋白。

具体实施方式

实施例1 羰基还原酶基因的获取

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心,培养基LB(g/L):胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,补水至1 L。将枯草芽孢杆菌接种于50 mL液体培养基中37 ℃培养至对数培养期,使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组。引物序列设计如下:

上游引物IolSf 含有Nde I 

5’-GGAATTCCATATGAAAAAAGCGAAGCTCGG-3’

下游引物IolSr 含有Xho I

5’-CCGCTCGAGTGCGAACAGCTTATCAAT-3’

PCR条件为:95℃变性5 min,按如下参数循环30次:95 ℃变性1 min,62℃退火50 s,72℃延伸1 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR结果如图1所示。

实施例2 羰基还原酶基因的表达

用Nde I和Xho I分别酶切pET20b和羰基还原酶基因,将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,热休克法转化,涂布于含有100 μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12 h。以载体所带氨苄青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。

实施例3 葡萄糖脱氢酶基因的获取

菌株培养和基因提取如实施例1。引物序列设计如下:

上游引物GDHf含有Nde I

5’-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC-3’ 

下游引物GDHr含有Hind III

5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC-3’ 

PCR条件为:95℃变性5 min,按如下参数循环30次:95℃变性1 min,55 ℃退火50 s,72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。PCR结果如图1所示。

实施例4 葡萄糖脱氢酶基因的表达

用Nde I和Hind III 分别酶切pET24a和葡萄糖脱氢酶基因,将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,热休克法转化,涂布于含有50 μg/mL的卡那青霉素的LB平板上,37 ℃培养12 h。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。

实施例5 羰基还原酶酶活的测定 

重组大肠杆菌的粗酶液制备:重组大肠杆菌接种至含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃,180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.4 mmol/L),诱导4 h后测定羰基还原酶活力。取经诱导的菌液离心(4℃,5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min),4℃,11000 r/min离心15 min),测定上清液中羰基还原酶的酶活。

羰基还原酶活力测定:酶反应体系包括100 mM 磷酸钾缓冲溶液(pH 6.0),0.1 mM NADPH,1 mM OPBE,340 nm处测定吸光值的下降。酶活定义为:每分钟消耗1 μmol NADPH 所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。

结果显示粗酶液中羰基还原酶的比酶活为1.5 U/mg。

实施例6 葡萄糖脱氢酶酶活的测定

重组大肠杆菌细胞粗酶液制备:重组大肠杆菌接种至含50 μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基,37℃,180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.8 mmol/L),诱导4 h后测定葡萄糖脱氢酶活力。取经诱导的菌液离心(4 ℃,5 000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min),4 ℃,11 000 r/min离心15 min),测定上清液中葡萄糖脱氢酶的酶活。

葡萄糖脱氢酶活力测定:酶反应体系包括75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),2.0 mmol/L NADP+,0.1 mol/L D-葡萄糖,340 nm处测定吸光值的上升。酶活定义为:每分钟生成1 μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。

结果显示粗酶液中葡萄糖脱氢酶的比酶活为9.5 U/mg。

实施例7 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的共表达

从以构建的重组质粒 pET20b-I上通过PCR 扩增获得连有T7启动子的羰基还原酶基因(T7-iolS)片断。

N端引物含有Not I限制性酶切位点:

T7-IolSf: 5’-AAGGAAAAAA GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAG-3’。

C端引物为IolSr。

将PCR 扩增出的连有T7启动子的羰基还原酶基因(T7-iolS),分别经Not I和Xho I酶切后与进行相同酶切的pET24a-G相连,构建了重组质粒pET24a-G-T7-I (图2)。重组质粒经热休克法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。

实施例8  SDS-PAGE 检测目的蛋白

取诱导后的菌体重悬液超声破碎,离心取上清进行SDS-PAGE分析。采用4%的浓缩胶,15%的分离胶,电泳后凝胶用考马斯亮蓝G250染色(图3)。

实施例9大肠杆菌重组质粒无细胞提取物的制备

重组大肠杆菌接种至含50 μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基,37℃、180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.8 mmol/L),25℃诱导4 h。取经诱导的菌液离心(4℃,5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min)后,4℃,11000 r/min离心15 min,所得上清液作为无细胞提取物用于不对称转化反应。

实施例10 重组大肠杆菌无细胞提取物催化OPBE的不对称还原

水相反应:15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE和0.05 mM的NADP+,37℃在220 r/min 摇床震荡反应15 h。

水/辛醇两相反应:5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE,0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇。37℃在220 r/min 摇床震荡反应15h。 

反应时间进程曲线如下表所示,由表可知,约13 h反应达到平衡,水相中转化率达到52.5%,水/辛醇两相中转化率达到70.5%。

转化率(%) 0 h 1 h 3 h 5 h 7 h 9 h 11 h 13 h 15 h 水相 0 28.3 33.9 38.4 42.6 45.3 49.8 52.5 52.5 水/辛醇两相 0 38.9 45.6 53.9 61.3 65.4 68.3 70.5 70.5

实施例10 产物的检测方法

水相反应:反应结束后,加入等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取三次。离心10 min取上清,保存测样。

水/辛醇两相反应:反应结束后,离心10 min后分离有机层和水层,吸取上层有机相保存测样。

产物(R)-HPBE浓度的测定:使用CP WAX 52CB极性色谱柱(CP8713,30 m×0.25 mm×0.25 μm),分析条件为:进样口温度250℃,检测器温度300℃,柱温140℃保留2 min,以10℃ /min升温至240℃维持2 min,载气为氢气,流量为2.0 mL/min,分流比1:50。

产物(R)-HPBE对映体过量值的测定:使用Chirasil-Dex CB手性色谱柱(CP7502,25 m×0.25 mm×0.25 μm),分析条件为:进样口温度250℃,检测器温度300℃,柱温100℃保留2 min,以10℃ /min升温至160℃维持2 min,载气为氢气,流量为2.0 mL/min,分流比1:50。

<210> SEQ NO. 1

<211> 933

<212> DNA

<213>iolS

 

<400> 1

atgaaaaaag  cgaagctcgg  aaaatcagac  ttgcaggtat  tccctatcgg  attaggaaca    60

aatgctgtcg  gaggacataa  cctctacccg  aacctaaatg  aagaaaccgg  aaaagaattg   120

gtgcgcgagg  cgatccgtaa  tggcgtgaca  atgttagaca  ccgcttacat  ttacgggatc    180

ggccgttccg  aagaattaat  tggtgaagtg  ctgcgtgaat  tcaaccgtga  agatgttgtc     240

atcgcgacaa  aagccgctca  cagaaaacaa  ggcaatgact  ttgtctttga  taattcacca     300

gattttctta  aaaaatcagt  tgatgaaagc  ctgaagcgct  tgaataccga  ttatattgat       360

ttgttctaca  ttcacttccc  tgacgaacat  acgcctaagg  atgaagccgt  taacgcgctg     420

aatgagatga  agaaagccgg  aaaaatccgt  tccatcggtg  tatccaactt  ctctttagag     480

caattgaaag  aagcaaacaa  agacggtttg  gtagatgtat  tgcaaggcga  atacaacctg    540

ttaaaccgtg  aagcggaaaa  aacattcttc  ccgtatacga  aggagcataa  tgtttcattt      600

atcccttact  tccctctcgt  atcaggttta  ttggcaggga  agtatacaga  agatacaacg      660

ttcccagaag  gcgacctgcg  aaacgaacag  gaacacttca  agggtgagcg  tttcaaagaa   720

aatatcagaa  aggtcaacaa  gcttgcgccg  attgccgaaa  aacacaacgt  ggatatccct    780

cacatcgtat  tggcctggta  tttagcaaga  ccggaaattg  atattttaat  cccaggagca      840

aaacgtgccg  atcagctgat  tgataacatc  aaaacagctg  acgtgacgct  ttctcaagag    900

gatatttcat  ttattgataa  gctgttcgca  taa                                 933

 

<210> SEQ NO.2

<211> 310

<212> PRT  

<213> IolS

 

<400> 2

MET Lys Lys Ala Lys  Leu Gly Lys Ser Asp  Leu Gln Val Phe Pro

5                 10                 15

Ile Gly Leu Gly Thr  Asn Ala Val Gly Gly  His Asn Leu Tyr Pro

20                 25                 30

Asn Leu Asn Glu Glu  Thr Gly Lys Glu Leu  Val Arg Glu Ala Ile

35                 40                45

Arg Asn Gly Val Thr  MET Leu Asp Thr Ala  Tyr Ile Tyr Gly Ile

50                  55                 60

Gly Arg Ser Glu Glu  Leu Ile Gly Glu Val  Leu Arg Glu Phe Asn

65                 70                 75

Arg Glu Asp Val Val  Ile Ala Thr Lys Ala  Ala His Arg Lys Gln

80                85                 90

Gly Asn Asp Phe Val  Phe Asp Asn Ser Pro  Asp Phe Leu Lys Lys

95                100                 105

Ser Val Asp Glu Ser  Leu Lys Arg Leu Asn  Thr Asp Tyr Ile Asp

110                115               120

Leu Phe Tyr Ile His  Phe Pro Asp Glu His  Thr Pro Lys Asp Glu

125                130                135

Ala Val Asn Ala Leu  Asn Glu MET Lys Lys  Ala Gly Lys Ile Arg

140                  145               150

Ser Ile Gly Val Ser   Asn Phe Ser Leu Glu  Gln Leu Lys Glu Ala

155                 160                165

Asn Lys Asp Gly Leu  Val Asp Val Leu Gln  Gly Glu Tyr Asn Leu

170                175                180

Leu Asn Arg Glu Ala  Glu Lys Thr Phe Phe  Pro Tyr Thr Lys Glu

185                190                195

His Asn Val Ser Phe  Ile Pro Tyr Phe Pro  Leu Val Ser Gly Leu

200              205                210

Leu Ala Gly Lys Tyr  Thr Glu Asp Thr Thr  Phe Pro Glu Gly Asp

215                220                225

Leu Arg Asn Glu Gln  Glu His Phe Lys Gly  Glu Arg Phe Lys Glu

230                235                240

Asn Ile Arg Lys Val  Asn Lys Leu Ala Pro  Ile Ala Glu Lys His

245               250               255

Asn Val Asp Ile Pro  His Ile Val Leu Ala  Trp Tyr Leu Ala Arg

260               265                270

Pro Glu Ile Asp Ile  Leu Ile Pro Gly Ala  Lys Arg Ala Asp Gln

275              280                 285

Leu Ile Asp Asn Ile  Lys Thr Ala Asp Val  Thr Leu Ser Gln Glu

290                295               300

Asp Ile Ser Phe Ile  Asp Lys Leu Phe Ala

305                310

 

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213>gdh

 

<400> 3

atgtatccgg  atttaaaagg  aaaagtcgtc  gctattacag  gagctgcttc  agggctcgga     60

aaggcgatgg  ccattcgctt  cggcaaggag  caggcaaaag  tggttatcaa  ctattatagt    120

aataaacaag  atccgaacga  ggtaaaagaa  gaggtcatca  aggcgggcgg  tgaagctgtt  180

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aaggagttcg  gcacactcga  tattatgatt  aataatgccg  gtcttgaaaa  tcctgtgcca     300

tctcacgaaa  tgccgctcaa  ggattgggat  aaagtcatcg  gcacgaactt  aacgggtgcc   360

tttttaggaa  gccgtgaagc  gattaaatat  ttcgtagaaa  acgatatcaa  gggaaatgtc     420

attaacatgt  ccagtgtgca  cgcgtttcct  tggccgttat  ttgtccacta  tgcggcaagt      480

aaaggcggga  taaagctgat  gacagaaaca  ttagcgttgg  aatacgcgcc  gaagggcatt  540

cgcgtcaata  atattgggcc  aggtgcgatc  aacacgccaa  tcaatgctga  aaaattcgct   600

gaccctaaac  agaaagctga  tgtagaaagc  atgattccaa  tgggatatat  cggcgaaccg  660

gaggagatcg  ccgcagtagc  agcctggctt  gcttcgaagg  aagccagcta  cgtcacaggc 720

atcacgttat  tcgcggacgg  cggtatgaca  caatatcctt  cattccaggc  aggccgcggt   780

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<210> 4

<211> 260

<212> PRT 

<213> GDH

 

<400> 4

MET Tyr Pro Asp Leu  Lys Gly Lys Val Val  Ala Ile Thr Gly Ala

5                           10                      15

Ala Ser Gly Leu Gly  Lys Ala MET Ala Ile  Arg Phe Gly Lys Glu

20                  25                 30

Gln Ala Lys Val Val  Ile Asn Tyr Tyr Ser  Asn Lys Gln Asp Pro

35                40                  45

Asn Glu Val Lys Glu  Glu Val Ile Lys Ala  Gly Gly Glu Ala Val

50                55                 60

Val Val Gln Gly Asp  Val Thr Lys Glu Glu  Asp Val Lys Asn Ile

65                 70                  75

Val Gln Thr Ala Ile  Lys Glu Phe Gly Thr  Leu Asp Ile MET Ile

80                85                 90

Asn Asn Ala Gly Leu  Glu Asn Pro Val Pro  Ser His Glu MET Pro

95                100                 105

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125               130                135

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140                145                150

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155               160               165

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170                175               180

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185               190               195

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200                205               210

MET Ile Pro MET Gly  Tyr Ile Gly Glu Pro  Glu Glu Ile Ala Ala

215               220               225

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230               235               240

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245                 250                255

Gln Ala Gly Arg Gly     

260 

 

一种利用重组羰基还原酶催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法.pdf_第1页
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1、(10)申请公布号 CN 102618590 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618590 A *CN102618590A* (21)申请号 201210137695.9 (22)申请日 2012.05.07 C12P 7/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 倪晔 宿宇宁 李海东 薛天芸 (74)专利代。

2、理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一 种 利 用 重 组 羰 基 还 原 酶 催 化 制 备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯的方法 (57) 摘要 一 种 利 用 重 组 羰 基 还 原 酶 催 化 制 备 (R)-2- 羟基 -4- 苯 基 丁 酸 乙 酯 的 方 法, 属 于 生物工程技术领域。本方法从枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) CGMCC NO.1.1508 中克隆了 羰基还原酶 (IolS)和葡萄糖脱氢酶 (GDH)基因 片段, 采用双启动子法串联表达 IolS 基因和 GDH 基因, 构建重组质。

3、粒 pET24a-G-T7-I, 并将该质粒 导入大肠杆菌 BL21(DE3)。以该大肠杆菌重组质 粒的无细胞提取物为催化剂, 2- 氧代 -4- 苯基丁 酸乙酯为底物, 葡萄糖为辅底物, 在不添加或添加 少量 NADP+辅因子的条件下, 进行生物转化制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯, 产物的对映体过 量值高于 99.5%。本发明通过 IolS 和 GDH 的共表 达, 实现细胞内辅因子 NADP(H) 的高效再生, 降低 了生产成本, 具有很好的工业应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知。

4、识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种氨基酸序列如 SEQ NO. 2 所示的羰基还原酶, GenBank 收录号 : JQ782389, 或者 是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下, 由插入、 缺失或替换如 SEQ NO. 2 所示的氨基 酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶, 在不对称还原 2- 氧 代 -4- 苯基丁酸乙酯制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯中的应用。 2. 一种含权利要求 1 所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法, 其特征在于从 枯草芽孢杆菌 (B。

5、acillus subtilis) CGMCC NO.1.1508 中克隆了羰基还原酶 IolS 和葡萄糖 脱氢酶 GDH 基因片段, 采用双启动子法串联 IolS 基因和 GDH 基因, 构建了 pET24a-G-T7-I 质粒, 将该质粒导入大肠杆菌 BL21(DE3) 而获得的大肠杆菌重组质粒, 实现羰基还原酶和 葡萄糖脱氢酶的共表达。 3. 权利要求 2 所述方法构建的大肠杆菌重组质粒的应用, 其特征在于以所述大肠杆菌 重组质粒的无细胞提取物为催化剂, 2- 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯为底物, 葡萄糖为辅底物, 在 不添加或添加0.05 mmol/L NADP+辅因子的条件下, 进行生。

6、物转化制备(R)-2-羟基-4-苯 基丁酸乙酯,ee值大于 99.5% ; 水相反应 : 100 mmol/L, pH值6.0的15 mL磷酸钾缓冲液, 5 mL无细胞提取物, 200 g/L 的 D- 葡萄糖, 20 g/L 的 OPBE 和 0.05 mM 的 NADP+, 37在 220 r/min 摇床震荡反应 13-15 h ; 水 / 辛醇两相反应 : 100 mmol/L, pH 值 6.0 的 5 mL 磷酸钾缓冲液, 5 mL 无细胞提取物, 200 g/L的D-葡萄糖, 20 g/L的OPBE, 0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇, 37在220 r/min 摇床震。

7、荡反应 13-15 h。 权 利 要 求 书 CN 102618590 A 2 1/6 页 3 一种利用重组羰基还原酶催化制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基 丁酸乙酯的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用大肠杆菌重组质粒无细胞提取物制备普利类药物关键手性 中间体 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯的方法, 属于生物工程技术领域。 背景技术 0002 随着人们生活水平的提高, 高血压日益危害着人们的健康。(R)-2- 羟基 -4- 苯基 丁酸乙酯(Ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate, (R)-HPBE)是合成众多普利系列血管 紧张素转换酶 。

8、(ACE) 抑制剂的关键手性中间体, 如赖诺普利, 依那普利, 卡托普利等 1。由 于 ACEI 类药物的高效性和低副作用, 其已成为目前市场上最畅销的药物之一。 0003 以 2- 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯 (OPBE) 作为还原反应的潜手性底物, 易于合成且价 格低廉, 以其作为底物进行不对称还原反应获得 (R)-HPBE 是非常经济有效的制备途径。目 前为止, (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯的合成路线主要包括化学法和生物法。 0004 化学法分为化学合成法和化学拆分法。化学合成法往往反应步骤复杂, 且需要昂 贵的试剂, 或者反应条件十分苛刻。化学拆分法存在的问题是以光学纯苯乙。

9、胺类衍生物作 拆分剂, 由于其价格昂贵, 实用价值不大 2。 0005 生物法包括脂肪酶拆分法、 野生菌催化法和基因工程菌催化法。 生物拆分法方面, Lies等利用来自Pseudomonas cepaica的脂肪酶拆分外消旋2-羟基-4-苯基丁酸乙酯, 得 到ee值大于 99.5% 的产物 3。Inada 等用微生物直接作用于 2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯拆 分得 (R)-HPBE, 产率和ee值分别可达 42% 和 95%4。然而, 外消旋体拆分的理论转化率仅 为 50%, 不利于工业化生产。目前最受关注和研究最多的是生物合成法。野生菌催化方面, Chen 等人利用Candida boi。

10、dinii成功制备了(R)-HPBE,ee值和产率分别为99%和92%5。 Oda 等用C. holmii还原 OPBE, 得到产率和ee值分别为 58% 和 90% 的 (R)-HPBE6。由于野 生菌中酶系复杂, 可能含有多种不同的甚至相反的立体选择性的酶, 所以很难达到 99% 以 上的ee值。利用改造的基因工程菌对 OPBE 进行不对称还原生成 (R)-HPBE 的报道目前还 比较少, Iwona 等将所筛选的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因 Ypr1p 在大肠杆 菌中表达纯化后获得的重组蛋白 Ypr1P, 在外加 NAD+和 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶的条件。

11、下将 OPBE 不对称催化还原成ee值为 97% 的 (R)-HPBE7。目前为止, 利用重组的基因工程菌催 化 OPBE 不对称还原成 (R)-HPBE 的报道中,ee值最高为 98%。本发明中的重组羰基还原酶 IolS 可应用于不对称还原制备ee值大于 99.5% 的 (R)-HPBE。 0006 本专利中涉及到的羰基还原酶是醛酮还原酶的一种, 全长 310 个氨基酸, 其氨基 酸序列如 SEQ NO.2 所示 ; 编码该蛋白的基因长度为 933bp, 已提交至 Genbank 中, 收录号为 JQ782389, 其基因序列如 SEQ NO. 1 所示。至今尚无关于该羰基还原酶用于 OPB。

12、E 不对称还 原 (R)-HPBE 的公开报道。 0007 【参考文献】 1Maruyama S, Nakagomi K, Tomizuka N, et al(1985) Angiotensin I-converting 说 明 书 CN 102618590 A 3 2/6 页 4 enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Agric Biol Chem 49: 1405-1409。 0008 2 张文 (2009) 生物催化制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯 . 硕士学位论 文 . 无锡 :。

13、 江南大学。 0009 3 Liese A, Kragl U, Kierkels H, et al(2002)Membrane reactor development for the kinetic resolution of ethyl 2-hydroxy-4-phenylbutyrate. Enzyme Microb Technol 30: 673-681。 0010 4Inada Y, Oda S (l999) Microbial Manufacture of Optically Active 2-Hydroxycarboxylic Acid Esters.JP, 10304894。 0。

14、011 5Chen Y Z, Lin H, Xu X Y, et al(2008) Preparation the key intermediate of angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitors: high enantioselective production of ethyl (R)-2-hydroxy -4-phenylbutyrate with Candida boidinii CIOC21. Adv Synth Catal 350: 426-430。 0012 6Oda S, Inada Y, Kobayashi A, et a。

15、l(1998) Production of ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutanoate via reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate in an interface bioreactor. Biosci Biotechnol Biochem 62: 1762-1767。 0013 7 Kaluzna I, Andrew A A, Bonilla M, et al(2002) Enantioselective reductions of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate by Saccharo。

16、myces cerevisiae dehydrogenases. J. Mol. Catal. B: Enzym 17(2): 101-105。 发明内容 0014 本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌无细胞提取物作为催化剂, 应用于催化不 对称还原 2- 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯制备光学纯 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯的方法。该 方法不需要添加或少量添加昂贵的辅酶, 极大地降低了生产成本, 且产物的光学纯度高, 条 件温和, 易于工业化放大。 0015 为解决上述技术问题, 本发明所采用的技术方案如下 : 从枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CGMCC NO.。

17、1.1508 中克隆出羰基还原酶 IolS, 氨基酸序列如 SEQ NO. 2 所示。 0016 从枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CGMCC NO.1.1508 中克隆出葡萄糖脱氢酶 GDH, 核酸序列如 SEQ NO. 3 所示, 氨基酸序列如 SEQ NO. 4 所示。 0017 采用双启动子法串联 IolS 基因和 GDH 基因, 构建 pET24a-G-T7-I 质粒, 将该质粒 导入大肠杆菌 BL21(DE3)。 0018 一种氨基酸序列如 SEQ NO. 2 所示的羰基还原酶, GenBank 收录号 : JQ782389, 或 者是在保持该羰基还原酶催化活。

18、性的条件下, 由插入、 缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基 酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶, 在不对称还原 2- 氧 代 -4- 苯基丁酸乙酯制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯中的应用。 0019 一种含所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法, 从枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CGMCC NO.1.1508 中克隆了羰基还原酶 IolS 和葡萄糖脱氢酶 GDH 基 因片段, 采用双启动子法串联 IolS 基因和 GDH 基因, 构建了 pET24a-G-T7-I 质粒, 将该质粒 说 明 书 CN 102618590 A。

19、 4 3/6 页 5 导入大肠杆菌 BL21(DE3) 而获得的大肠杆菌重组质粒, 实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的 共表达。 0020 所述大肠杆菌重组质粒的应用, 以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化 剂, 2- 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯为底物, 葡萄糖为辅底物, 在不添加或添加少量 NADP+辅因子 (0.05 mmol/L) 的条件下, 进行生物转化制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯,ee值大于 99.5% ; 水相反应 : 15 mL 磷酸钾缓冲液 (100 mmol/L, pH 值 6.0) , 5 mL 无细胞提取物, 200 g/L 的 D- 葡萄糖, 20 。

20、g/L 的 OPBE 和 0.05 mM 的 NADP+, 37在 220 r/min 摇床震荡反应 13-15 h ; 水 / 辛醇两相反应 : 5 mL 磷酸钾缓冲液 (100 mmol/L, pH 值 6.0) , 5 mL 无细胞提取物, 200 g/L的D-葡萄糖, 20 g/L的OPBE, 0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇, 37在220 r/min 摇床震荡反应 13-15 h。 0021 本发明构建的共表达重组质粒能够实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的高效共表 达, 可应用于高效催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯 基丁酸乙酯,ee值。

21、大于 99.5%。同时, 通过采用水 / 辛醇两相反应体系、 分批添加底物等方 式, 解决了底物和产物对酶的抑制作用, 显著提高了转化效果。 0022 本发明的有益效果 : 本发明首次将氨基酸序列如 SEQ NO. 2 所示的羰基还原酶应 用于不对称还原 2- 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯制备 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯, 取得了较 好的效果, 粗酶液中羰基还原酶的比酶活达到 1.5 U/mg, 产物的对映体过量值大于 99.5%。 通过与葡萄糖脱氢酶共表达, 解决了辅因子的再生问题, 且对羰基还原酶的酶活没有影响。 在水 / 辛醇两相体系中, 不对称还原 20g/L 的底物 2-。

22、 氧代 -4- 苯基丁酸乙酯, 可获得ee值 大于 99.5% 的 (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯, 转化率为 70.4%。 附图说明 0023 图 1 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶 PCR 扩增产物电泳图谱。1 : DNA marker ; 2 : GDH 基因 ; 3 : IolS 基因。 0024 图 2 重组质粒 pET24a-G-T7-I 的构建图。 0025 图 3 大肠杆菌重组质粒中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的 SDS-PAGE 图。 0026 1 :蛋 白 Marker ; 2 :E.coliBL21(DE3) 空 白 对 照 ; 3 :E. coli BL21(DE3)/。

23、 pET24a-G-T7-I 诱导后总蛋白 ; 4 :E. coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I 诱导后可溶蛋白。 具体实施方式 0027 实施例 1 羰基还原酶基因的获取 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CGMCC NO.1.1508 来自于中国普通微生物菌种保 藏管理中心, 培养基 LB(g/L) : 胰蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g, 氯化钠 10 g, 补水至 1 L。 将枯草芽孢杆菌接种于50 mL液体培养基中37 培养至对数培养期, 使用基因组DNA提取 试剂盒提取基因组。引物序列设计如下 : 上游引物 IolSf 含有Nde I 。

24、5 -GGAATTCCATATGAAAAAAGCGAAGCTCGG-3 说 明 书 CN 102618590 A 5 4/6 页 6 下游引物 IolSr 含有Xho I 5 -CCGCTCGAGTGCGAACAGCTTATCAAT-3 PCR条件为 : 95变性5 min, 按如下参数循环30次 : 95 变性1 min, 62退火50 s, 72延伸 1 min。最后 72 延伸 10 min。PCR 结果如图 1 所示。 0028 实施例 2 羰基还原酶基因的表达 用Nde I 和Xho I 分别酶切 pET20b 和羰基还原酶基因, 将酶切回收产物用 T4 连接酶 连接过夜。将连接产物。

25、加入大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中, 热休克法转化, 涂布于含有 100 g/mL 的氨苄青霉素的 LB 平板上, 37培养 12 h。以载体所带氨苄青霉素抗性筛选 阳性转化子。阳性重组子采用菌落 PCR 和提取质粒双酶切的方法进行验证。 0029 实施例 3 葡萄糖脱氢酶基因的获取 菌株培养和基因提取如实施例 1。引物序列设计如下 : 上游引物 GDHf 含有Nde I 5 -GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC-3 下游引物 GDHr 含有Hind III 5 -CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC-3 PCR条件为 : 95变性5 min,。

26、 按如下参数循环30次 : 95变性1 min, 55 退火50 s, 72延伸 1 min。最后 72延伸 10 min。PCR 结果如图 1 所示。 0030 实施例 4 葡萄糖脱氢酶基因的表达 用Nde I和Hind III 分别酶切pET24a和葡萄糖脱氢酶基因, 将酶切回收产物用T4连 接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中, 热休克法转化, 涂布于 含有 50 g/mL 的卡那青霉素的 LB 平板上, 37 培养 12 h。以载体所带卡那青霉素抗性 筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落 PCR 和提取质粒双酶切的方法进行验证。 0031 实施例 5 羰。

27、基还原酶酶活的测定 重组大肠杆菌的粗酶液制备 : 重组大肠杆菌接种至含 100 g/mL 氨苄青霉素的 LB 液 体培养基, 37, 180 r/min 培养过夜后, 以体积分数 1接种量接种至新鲜 LB 培养基中, 37, 200 r/min 培养至 OD 为 0.6 0.9 时, 加入诱导剂 IPTG( 终浓度为 0.4 mmol/L), 诱 导4 h后测定羰基还原酶活力。 取经诱导的菌液离心(4, 5000 r/min离心15 min), 菌体 用 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0) 重悬, 超声破碎细胞 ( 功率 300 W, 超声 1 S, 间歇 3 S, 共 10。

28、 min), 4, 11000 r/min 离心 15 min), 测定上清液中羰基还原酶的酶活。 0032 羰基还原酶活力测定 : 酶反应体系包括100 mM 磷酸钾缓冲溶液 (pH 6.0) , 0.1 mM NADPH, 1 mM OPBE, 340 nm 处测定吸光值的下降。酶活定义为 : 每分钟消耗 1 mol NADPH 所需要的酶量为一个酶活单位 U。蛋白采用 Brandford 法进行测定。 0033 结果显示粗酶液中羰基还原酶的比酶活为 1.5 U/mg。 0034 实施例 6 葡萄糖脱氢酶酶活的测定 重组大肠杆菌细胞粗酶液制备 : 重组大肠杆菌接种至含50 g/mL卡那青霉。

29、素的LB液 体培养基, 37, 180 r/min 培养过夜后, 以体积分数 1接种量接种至新鲜 LB 培养基中, 37, 200 r/min 培养至 OD 为 0.6 0.9 时, 加入诱导剂 IPTG( 终浓度为 0.8 mmol/L), 诱 导4 h后测定葡萄糖脱氢酶活力。 取经诱导的菌液离心(4 , 5 000 r/min离心15 min), 菌体用 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0) 重悬, 超声破碎细胞 ( 功率 300 W, 超声 1 S, 间 说 明 书 CN 102618590 A 6 5/6 页 7 歇3 S, 共10 min), 4 , 11 000 r。

30、/min离心15 min), 测定上清液中葡萄糖脱氢酶的酶活。 0035 葡萄糖脱氢酶活力测定 : 酶反应体系包括 75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 2.0 mmol/L NADP+, 0.1 mol/L D- 葡萄糖, 340 nm 处测定吸光值的上升。酶活定义为 : 每分钟生 成 1 mol NADPH 所需要的酶量为一个酶活单位 U。蛋白采用 Brandford 法进行测定。 0036 结果显示粗酶液中葡萄糖脱氢酶的比酶活为 9.5 U/mg。 0037 实施例 7 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的共表达 从以构建的重组质粒 pET20b-I 上通过 PCR 扩增获。

31、得连有 T7 启动子的羰基还原酶基 因 (T7-iolS) 片断。 0038 N 端引物含有Not I 限制性酶切位点 : T7-IolSf: 5 -AAGGAAAAAA GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAG-3 。 0039 C 端引物为 IolSr。 0040 将 PCR 扩增出的连有 T7 启动子的羰基还原酶基因 (T7-iolS), 分别经Not I 和 Xho I 酶切后与进行相同酶切的 pET24a-G 相连, 构建了重组质粒 pET24a-G-T7-I ( 图 2)。 重组质粒经热休克法转化入大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中。以载体所带卡那青霉素抗 。

32、性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落 PCR 和提取质粒双酶切的方法进行验证。 0041 实施例 8 SDS-PAGE 检测目的蛋白 取诱导后的菌体重悬液超声破碎, 离心取上清进行 SDS-PAGE 分析。采用 4% 的浓缩胶, 15% 的分离胶, 电泳后凝胶用考马斯亮蓝 G250 染色 (图 3) 。 0042 实施例 9 大肠杆菌重组质粒无细胞提取物的制备 重组大肠杆菌接种至含 50 g/mL 卡那青霉素的 LB 液体培养基, 37、 180 r/min 培 养过夜后, 以体积分数 1接种量接种至新鲜 LB 培养基中, 37, 200 r/min 培养至 OD 为 0.6 0.9 时, 加。

33、入诱导剂 IPTG( 终浓度为 0.8 mmol/L), 25诱导 4 h。取经诱导的菌液离 心 (4, 5000 r/min 离心 15 min), 菌体用 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0) 重悬, 超声 破碎细胞 ( 功率 300 W, 超声 1 S, 间歇 3 S, 共 10 min) 后, 4, 11000 r/min 离心 15 min, 所得上清液作为无细胞提取物用于不对称转化反应。 0043 实施例 10 重组大肠杆菌无细胞提取物催化 OPBE 的不对称还原 水相反应 : 15 mL 磷酸钾缓冲液 (100 mmol/L, pH 值 6.0), 5 mL 无细。

34、胞提取物, 200 g/L 的 D- 葡萄糖, 20 g/L 的 OPBE 和 0.05 mM 的 NADP+, 37在 220 r/min 摇床震荡反应 15 h。 0044 水/辛醇两相反应 : 5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L, pH值6.0), 5 mL无细胞提取 物, 200 g/L 的 D- 葡萄糖, 20 g/L 的 OPBE, 0.05mM 的 NADP+以及 10mL 的辛醇。37在 220 r/min 摇床震荡反应 15h。 0045 反应时间进程曲线如下表所示, 由表可知, 约13 h反应达到平衡, 水相中转化率达 到 52.5%, 水 / 辛醇两相中转化率达到。

35、 70.5%。 转化率 (%)0h1h3h5h7h9h11h13h15h 水相028.3 33.9 38.4 42.6 45.3 49.8 52.5 52.5 水 / 辛醇两相038.9 45.6 53.9 61.3 65.4 68.3 70.5 70.5 0046 实施例 10 产物的检测方法 水相反应 : 反应结束后, 加入等体积乙酸乙酯进行萃取, 萃取三次。离心 10 min 取上 清, 保存测样。 0047 水/辛醇两相反应 : 反应结束后, 离心10 min后分离有机层和水层, 吸取上层有机 说 明 书 CN 102618590 A 7 6/6 页 8 相保存测样。 0048 产物 。

36、(R)-HPBE 浓度的测定 : 使用 CP WAX 52CB 极性色谱柱 (CP8713, 30 m0.25 mm0.25 m), 分析条件为 : 进样口温度250, 检测器温度300, 柱温140保留2 min, 以 10 /min 升温至 240维持 2 min, 载气为氢气, 流量为 2.0 mL/min, 分流比 1:50。 0049 产物(R)-HPBE对映体过量值的测定 : 使用Chirasil-Dex CB手性色谱柱(CP7502, 25 m0.25 mm0.25 m), 分析条件为 : 进样口温度250, 检测器温度300, 柱温100 保留 2 min, 以 10 /min。

37、 升温至 160维持 2 min, 载气为氢气, 流量为 2.0 mL/min, 分流 比 1:50。 说 明 书 CN 102618590 A 8 1/4 页 9 SEQ NO. 1 933 DNA iolS 1 atgaaaaaag cgaagctcgg aaaatcagac ttgcaggtat tccctatcgg attaggaaca 60 aatgctgtcg gaggacataa cctctacccg aacctaaatg aagaaaccgg aaaagaattg 120 gtgcgcgagg cgatccgtaa tggcgtgaca atgttagaca ccgcttaca。

38、t ttacgggatc 180 ggccgttccg aagaattaat tggtgaagtg ctgcgtgaat tcaaccgtga agatgttgtc 240 atcgcgacaa aagccgctca cagaaaacaa ggcaatgact ttgtctttga taattcacca 300 gattttctta aaaaatcagt tgatgaaagc ctgaagcgct tgaataccga ttatattgat 360 ttgttctaca ttcacttccc tgacgaacat acgcctaagg atgaagccgt taacgcgctg 420 aat。

39、gagatga agaaagccgg aaaaatccgt tccatcggtg tatccaactt ctctttagag 480 caattgaaag aagcaaacaa agacggtttg gtagatgtat tgcaaggcga atacaacctg 540 ttaaaccgtg aagcggaaaa aacattcttc ccgtatacga aggagcataa tgtttcattt 600 atcccttact tccctctcgt atcaggttta ttggcaggga agtatacaga agatacaacg 660 ttcccagaag gcgacctgcg a。

40、aacgaacag gaacacttca agggtgagcg tttcaaagaa 720 aatatcagaa aggtcaacaa gcttgcgccg attgccgaaa aacacaacgt ggatatccct 780 cacatcgtat tggcctggta tttagcaaga ccggaaattg atattttaat cccaggagca 840 aaacgtgccg atcagctgat tgataacatc aaaacagctg acgtgacgct ttctcaagag 900 gatatttcat ttattgataa gctgttcgca taa 933 SE。

41、Q NO.2 310 PRT IolS 2 MET Lys Lys Ala Lys Leu Gly Lys Ser Asp Leu Gln Val Phe Pro 5 10 15 Ile Gly Leu Gly Thr Asn Ala Val Gly Gly His Asn Leu Tyr Pro 20 25 30 Asn Leu Asn Glu Glu Thr Gly Lys Glu Leu Val Arg Glu Ala Ile 35 40 45 Arg Asn Gly Val Thr MET Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Tyr Gly Ile 50 55 60 Gly。

42、 Arg Ser Glu Glu Leu Ile Gly Glu Val Leu Arg Glu Phe Asn 序 列 表 CN 102618590 A 9 2/4 页 10 65 70 75 Arg Glu Asp Val Val Ile Ala Thr Lys Ala Ala His Arg Lys Gln 80 85 90 Gly Asn Asp Phe Val Phe Asp Asn Ser Pro Asp Phe Leu Lys Lys 95 100 105 Ser Val Asp Glu Ser Leu Lys Arg Leu Asn Thr Asp Tyr Ile Asp 11。

43、0 115 120 Leu Phe Tyr Ile His Phe Pro Asp Glu His Thr Pro Lys Asp Glu 125 130 135 Ala Val Asn Ala Leu Asn Glu MET Lys Lys Ala Gly Lys Ile Arg 140 145 150 Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Leu Glu Gln Leu Lys Glu Ala 155 160 165 Asn Lys Asp Gly Leu Val Asp Val Leu Gln Gly Glu Tyr Asn Leu 170 175 180 Le。

44、u Asn Arg Glu Ala Glu Lys Thr Phe Phe Pro Tyr Thr Lys Glu 185 190 195 His Asn Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Pro Leu Val Ser Gly Leu 200 205 210 Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Glu Asp Thr Thr Phe Pro Glu Gly Asp 215 220 225 Leu Arg Asn Glu Gln Glu His Phe Lys Gly Glu Arg Phe Lys Glu 230 235 240 Asn Ile Arg Ly。

45、s Val Asn Lys Leu Ala Pro Ile Ala Glu Lys His 245 250 255 Asn Val Asp Ile Pro His Ile Val Leu Ala Trp Tyr Leu Ala Arg 260 265 270 Pro Glu Ile Asp Ile Leu Ile Pro Gly Ala Lys Arg Ala Asp Gln 275 280 285 Leu Ile Asp Asn Ile Lys Thr Ala Asp Val Thr Leu Ser Gln Glu 290 295 300 Asp Ile Ser Phe Ile Asp Ly。

46、s Leu Phe Ala 305 310 3 783 DNA gdh 序 列 表 CN 102618590 A 10 3/4 页 11 3 atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60 aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120 aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180 gtcgtccaag gagatgtca。

47、c gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240 aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300 tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360 tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420 attaacatgt ccagtgtgca cgcgtttcct tggccgttat ttgtccacta tgcggcaagt 480 aaaggcggga taaagctgat gacagaaaca ttagcgttgg aatacgcgcc gaagggcatt 540 cgcgtcaata atattgggcc aggtgcgatc aacacgccaa tcaatgctga aaaattcgct 600 gaccctaaac agaaagctga tgtagaaagc atgattccaa tgggatatat cggcgaaccg 660 gaggagatcg ccgcagtagc agcctggctt gcttcgaagg aagcc。

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