技术领域
本发明涉及一种利用大肠杆菌重组质粒无细胞提取物制备普利类药物关键手性中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
随着人们生活水平的提高,高血压日益危害着人们的健康。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate,(R)-HPBE)是合成众多普利系列血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的关键手性中间体,如赖诺普利,依那普利,卡托普利等[1]。由于ACEI类药物的高效性和低副作用,其已成为目前市场上最畅销的药物之一。
以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯 (OPBE)作为还原反应的潜手性底物,易于合成且价格低廉,以其作为底物进行不对称还原反应获得(R)-HPBE是非常经济有效的制备途径。目前为止,(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成路线主要包括化学法和生物法。
化学法分为化学合成法和化学拆分法。化学合成法往往反应步骤复杂,且需要昂贵的试剂,或者反应条件十分苛刻。化学拆分法存在的问题是以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂,由于其价格昂贵,实用价值不大[2]。
生物法包括脂肪酶拆分法、野生菌催化法和基因工程菌催化法。生物拆分法方面,Lies等利用来自Pseudomonas cepaica的脂肪酶拆分外消旋2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,得到ee值大于99.5%的产物[3]。Inada等用微生物直接作用于2-羟基-4-苯基丁酸乙酯拆分得(R)-HPBE,产率和ee值分别可达42%和95%[4]。然而,外消旋体拆分的理论转化率仅为50%,不利于工业化生产。目前最受关注和研究最多的是生物合成法。野生菌催化方面,Chen 等人利用Candida boidinii成功制备了(R)-HPBE,ee值和产率分别为99%和92%[5]。Oda等用C. holmii还原OPBE,得到产率和ee值分别为58%和90%的(R)-HPBE[6]。由于野生菌中酶系复杂,可能含有多种不同的甚至相反的立体选择性的酶,所以很难达到99%以上的ee值。利用改造的基因工程菌对OPBE进行不对称还原生成(R)-HPBE的报道目前还比较少,Iwona等将所筛选的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因Ypr1p在大肠杆菌中表达纯化后获得的重组蛋白Ypr1P,在外加NAD+和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的条件下将OPBE不对称催化还原成ee值为97%的(R)-HPBE[7]。目前为止,利用重组的基因工程菌催化OPBE不对称还原成(R)-HPBE的报道中,ee值最高为98%。本发明中的重组羰基还原酶IolS可应用于不对称还原制备ee值大于99.5%的(R)-HPBE。
本专利中涉及到的羰基还原酶是醛酮还原酶的一种,全长310个氨基酸,其氨基酸序列如SEQ NO.2所示;编码该蛋白的基因长度为933bp,已提交至Genbank中,收录号为JQ782389,其基因序列如SEQ NO. 1所示。至今尚无关于该羰基还原酶用于OPBE不对称还原(R)-HPBE的公开报道。
【参考文献】
[1]Maruyama S, Nakagomi K, Tomizuka N, et al(1985) Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Agric Biol Chem 49: 1405-1409。
[2]张文(2009)生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯.[硕士学位论文].无锡:江南大学。
[3] Liese A, Kragl U, Kierkels H, et al(2002)Membrane reactor development for the kinetic resolution of ethyl 2-hydroxy-4-phenylbutyrate. Enzyme Microb Technol 30: 673-681。
[4]Inada Y, Oda S (l999) Microbial Manufacture of Optically Active 2-Hydroxycarboxylic Acid Esters.JP, 10304894。
[5]Chen Y Z, Lin H, Xu X Y, et al(2008) Preparation the key intermediate of angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitors: high enantioselective production of ethyl (R)-2-hydroxy -4-phenylbutyrate with Candida boidinii CIOC21. Adv Synth Catal 350: 426-430。
[6]Oda S, Inada Y, Kobayashi A, et al(1998) Production of ethyl (R)-2-hydroxy-4-phenylbutanoate via reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate in an interface bioreactor. Biosci Biotechnol Biochem 62: 1762-1767。
[7] Kaluzna I, Andrew A A, Bonilla M, et al(2002) Enantioselective reductions of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate by Saccharomyces cerevisiae dehydrogenases. J. Mol. Catal. B: Enzym 17(2): 101-105。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌无细胞提取物作为催化剂,应用于催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。该方法不需要添加或少量添加昂贵的辅酶,极大地降低了生产成本,且产物的光学纯度高,条件温和,易于工业化放大。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆出羰基还原酶IolS,氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆出葡萄糖脱氢酶GDH,核酸序列如SEQ NO. 3所示,氨基酸序列如SEQ NO. 4所示。
采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因,构建pET24a-G-T7-I质粒,将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。
一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶,GenBank收录号:JQ782389,或者是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下,由插入、缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶,在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
一种含所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法,从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基还原酶IolS和葡萄糖脱氢酶GDH基因片段,采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因,构建了pET24a-G-T7-I质粒,将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)而获得的大肠杆菌重组质粒,实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达。
所述大肠杆菌重组质粒的应用,以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂,2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物,葡萄糖为辅底物,在不添加或添加少量NADP+辅因子(<0.05 mmol/L)的条件下,进行生物转化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,ee值大于99.5%;
水相反应:15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE和0.05 mM的NADP+,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h;
水/辛醇两相反应:5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE,0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇,37℃在220 r/min 摇床震荡反应13-15 h。
本发明构建的共表达重组质粒能够实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的高效共表达,可应用于高效催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,ee值大于99.5%。同时,通过采用水/辛醇两相反应体系、分批添加底物等方式,解决了底物和产物对酶的抑制作用,显著提高了转化效果。
本发明的有益效果:本发明首次将氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶应用于不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,取得了较好的效果,粗酶液中羰基还原酶的比酶活达到1.5 U/mg,产物的对映体过量值大于99.5%。通过与葡萄糖脱氢酶共表达,解决了辅因子的再生问题,且对羰基还原酶的酶活没有影响。在水/辛醇两相体系中,不对称还原20g/L的底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯,可获得ee值大于99.5%的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯,转化率为70.4%。
附图说明
图1羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶PCR扩增产物电泳图谱。1:DNA marker;2:GDH基因;3:IolS基因。
图2重组质粒pET24a-G-T7-I的构建图。
图3大肠杆菌重组质粒中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图。
1:蛋白Marker;2:E.coliBL21(DE3)空白对照;3:E. coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I诱导后总蛋白;4:E. coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I诱导后可溶蛋白。
具体实施方式
实施例1 羰基还原酶基因的获取
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1.1508来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心,培养基LB(g/L):胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,补水至1 L。将枯草芽孢杆菌接种于50 mL液体培养基中37 ℃培养至对数培养期,使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组。引物序列设计如下:
上游引物IolSf 含有Nde I
5’-GGAATTCCATATGAAAAAAGCGAAGCTCGG-3’
下游引物IolSr 含有Xho I
5’-CCGCTCGAGTGCGAACAGCTTATCAAT-3’
PCR条件为:95℃变性5 min,按如下参数循环30次:95 ℃变性1 min,62℃退火50 s,72℃延伸1 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR结果如图1所示。
实施例2 羰基还原酶基因的表达
用Nde I和Xho I分别酶切pET20b和羰基还原酶基因,将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,热休克法转化,涂布于含有100 μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12 h。以载体所带氨苄青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。
实施例3 葡萄糖脱氢酶基因的获取
菌株培养和基因提取如实施例1。引物序列设计如下:
上游引物GDHf含有Nde I
5’-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC-3’
下游引物GDHr含有Hind III
5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC-3’
PCR条件为:95℃变性5 min,按如下参数循环30次:95℃变性1 min,55 ℃退火50 s,72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。PCR结果如图1所示。
实施例4 葡萄糖脱氢酶基因的表达
用Nde I和Hind III 分别酶切pET24a和葡萄糖脱氢酶基因,将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,热休克法转化,涂布于含有50 μg/mL的卡那青霉素的LB平板上,37 ℃培养12 h。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。
实施例5 羰基还原酶酶活的测定
重组大肠杆菌的粗酶液制备:重组大肠杆菌接种至含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃,180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.4 mmol/L),诱导4 h后测定羰基还原酶活力。取经诱导的菌液离心(4℃,5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min),4℃,11000 r/min离心15 min),测定上清液中羰基还原酶的酶活。
羰基还原酶活力测定:酶反应体系包括100 mM 磷酸钾缓冲溶液(pH 6.0),0.1 mM NADPH,1 mM OPBE,340 nm处测定吸光值的下降。酶活定义为:每分钟消耗1 μmol NADPH 所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。
结果显示粗酶液中羰基还原酶的比酶活为1.5 U/mg。
实施例6 葡萄糖脱氢酶酶活的测定
重组大肠杆菌细胞粗酶液制备:重组大肠杆菌接种至含50 μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基,37℃,180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.8 mmol/L),诱导4 h后测定葡萄糖脱氢酶活力。取经诱导的菌液离心(4 ℃,5 000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min),4 ℃,11 000 r/min离心15 min),测定上清液中葡萄糖脱氢酶的酶活。
葡萄糖脱氢酶活力测定:酶反应体系包括75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),2.0 mmol/L NADP+,0.1 mol/L D-葡萄糖,340 nm处测定吸光值的上升。酶活定义为:每分钟生成1 μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。
结果显示粗酶液中葡萄糖脱氢酶的比酶活为9.5 U/mg。
实施例7 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的共表达
从以构建的重组质粒 pET20b-I上通过PCR 扩增获得连有T7启动子的羰基还原酶基因(T7-iolS)片断。
N端引物含有Not I限制性酶切位点:
T7-IolSf: 5’-AAGGAAAAAA GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAG-3’。
C端引物为IolSr。
将PCR 扩增出的连有T7启动子的羰基还原酶基因(T7-iolS),分别经Not I和Xho I酶切后与进行相同酶切的pET24a-G相连,构建了重组质粒pET24a-G-T7-I (图2)。重组质粒经热休克法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。
实施例8 SDS-PAGE 检测目的蛋白
取诱导后的菌体重悬液超声破碎,离心取上清进行SDS-PAGE分析。采用4%的浓缩胶,15%的分离胶,电泳后凝胶用考马斯亮蓝G250染色(图3)。
实施例9大肠杆菌重组质粒无细胞提取物的制备
重组大肠杆菌接种至含50 μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基,37℃、180 r/min培养过夜后,以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中,37℃,200 r/min培养至OD为0.6~0.9时,加入诱导剂IPTG(终浓度为0.8 mmol/L),25℃诱导4 h。取经诱导的菌液离心(4℃,5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W,超声1 S,间歇3 S,共10 min)后,4℃,11000 r/min离心15 min,所得上清液作为无细胞提取物用于不对称转化反应。
实施例10 重组大肠杆菌无细胞提取物催化OPBE的不对称还原
水相反应:15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE和0.05 mM的NADP+,37℃在220 r/min 摇床震荡反应15 h。
水/辛醇两相反应:5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH值6.0),5 mL无细胞提取物,200 g/L的D-葡萄糖,20 g/L的OPBE,0.05mM的NADP+以及10mL的辛醇。37℃在220 r/min 摇床震荡反应15h。
反应时间进程曲线如下表所示,由表可知,约13 h反应达到平衡,水相中转化率达到52.5%,水/辛醇两相中转化率达到70.5%。
转化率(%) 0 h 1 h 3 h 5 h 7 h 9 h 11 h 13 h 15 h 水相 0 28.3 33.9 38.4 42.6 45.3 49.8 52.5 52.5 水/辛醇两相 0 38.9 45.6 53.9 61.3 65.4 68.3 70.5 70.5
实施例10 产物的检测方法
水相反应:反应结束后,加入等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取三次。离心10 min取上清,保存测样。
水/辛醇两相反应:反应结束后,离心10 min后分离有机层和水层,吸取上层有机相保存测样。
产物(R)-HPBE浓度的测定:使用CP WAX 52CB极性色谱柱(CP8713,30 m×0.25 mm×0.25 μm),分析条件为:进样口温度250℃,检测器温度300℃,柱温140℃保留2 min,以10℃ /min升温至240℃维持2 min,载气为氢气,流量为2.0 mL/min,分流比1:50。
产物(R)-HPBE对映体过量值的测定:使用Chirasil-Dex CB手性色谱柱(CP7502,25 m×0.25 mm×0.25 μm),分析条件为:进样口温度250℃,检测器温度300℃,柱温100℃保留2 min,以10℃ /min升温至160℃维持2 min,载气为氢气,流量为2.0 mL/min,分流比1:50。
<210> SEQ NO. 1
<211> 933
<212> DNA
<213>iolS
<400> 1
atgaaaaaag cgaagctcgg aaaatcagac ttgcaggtat tccctatcgg attaggaaca 60
aatgctgtcg gaggacataa cctctacccg aacctaaatg aagaaaccgg aaaagaattg 120
gtgcgcgagg cgatccgtaa tggcgtgaca atgttagaca ccgcttacat ttacgggatc 180
ggccgttccg aagaattaat tggtgaagtg ctgcgtgaat tcaaccgtga agatgttgtc 240
atcgcgacaa aagccgctca cagaaaacaa ggcaatgact ttgtctttga taattcacca 300
gattttctta aaaaatcagt tgatgaaagc ctgaagcgct tgaataccga ttatattgat 360
ttgttctaca ttcacttccc tgacgaacat acgcctaagg atgaagccgt taacgcgctg 420
aatgagatga agaaagccgg aaaaatccgt tccatcggtg tatccaactt ctctttagag 480
caattgaaag aagcaaacaa agacggtttg gtagatgtat tgcaaggcga atacaacctg 540
ttaaaccgtg aagcggaaaa aacattcttc ccgtatacga aggagcataa tgtttcattt 600
atcccttact tccctctcgt atcaggttta ttggcaggga agtatacaga agatacaacg 660
ttcccagaag gcgacctgcg aaacgaacag gaacacttca agggtgagcg tttcaaagaa 720
aatatcagaa aggtcaacaa gcttgcgccg attgccgaaa aacacaacgt ggatatccct 780
cacatcgtat tggcctggta tttagcaaga ccggaaattg atattttaat cccaggagca 840
aaacgtgccg atcagctgat tgataacatc aaaacagctg acgtgacgct ttctcaagag 900
gatatttcat ttattgataa gctgttcgca taa 933
<210> SEQ NO.2
<211> 310
<212> PRT
<213> IolS
<400> 2
MET Lys Lys Ala Lys Leu Gly Lys Ser Asp Leu Gln Val Phe Pro
5 10 15
Ile Gly Leu Gly Thr Asn Ala Val Gly Gly His Asn Leu Tyr Pro
20 25 30
Asn Leu Asn Glu Glu Thr Gly Lys Glu Leu Val Arg Glu Ala Ile
35 40 45
Arg Asn Gly Val Thr MET Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Tyr Gly Ile
50 55 60
Gly Arg Ser Glu Glu Leu Ile Gly Glu Val Leu Arg Glu Phe Asn
65 70 75
Arg Glu Asp Val Val Ile Ala Thr Lys Ala Ala His Arg Lys Gln
80 85 90
Gly Asn Asp Phe Val Phe Asp Asn Ser Pro Asp Phe Leu Lys Lys
95 100 105
Ser Val Asp Glu Ser Leu Lys Arg Leu Asn Thr Asp Tyr Ile Asp
110 115 120
Leu Phe Tyr Ile His Phe Pro Asp Glu His Thr Pro Lys Asp Glu
125 130 135
Ala Val Asn Ala Leu Asn Glu MET Lys Lys Ala Gly Lys Ile Arg
140 145 150
Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Leu Glu Gln Leu Lys Glu Ala
155 160 165
Asn Lys Asp Gly Leu Val Asp Val Leu Gln Gly Glu Tyr Asn Leu
170 175 180
Leu Asn Arg Glu Ala Glu Lys Thr Phe Phe Pro Tyr Thr Lys Glu
185 190 195
His Asn Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Pro Leu Val Ser Gly Leu
200 205 210
Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Glu Asp Thr Thr Phe Pro Glu Gly Asp
215 220 225
Leu Arg Asn Glu Gln Glu His Phe Lys Gly Glu Arg Phe Lys Glu
230 235 240
Asn Ile Arg Lys Val Asn Lys Leu Ala Pro Ile Ala Glu Lys His
245 250 255
Asn Val Asp Ile Pro His Ile Val Leu Ala Trp Tyr Leu Ala Arg
260 265 270
Pro Glu Ile Asp Ile Leu Ile Pro Gly Ala Lys Arg Ala Asp Gln
275 280 285
Leu Ile Asp Asn Ile Lys Thr Ala Asp Val Thr Leu Ser Gln Glu
290 295 300
Asp Ile Ser Phe Ile Asp Lys Leu Phe Ala
305 310
<210> 3
<211> 783
<212> DNA
<213>gdh
<400> 3
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgcgtttcct tggccgttat ttgtccacta tgcggcaagt 480
aaaggcggga taaagctgat gacagaaaca ttagcgttgg aatacgcgcc gaagggcatt 540
cgcgtcaata atattgggcc aggtgcgatc aacacgccaa tcaatgctga aaaattcgct 600
gaccctaaac agaaagctga tgtagaaagc atgattccaa tgggatatat cggcgaaccg 660
gaggagatcg ccgcagtagc agcctggctt gcttcgaagg aagccagcta cgtcacaggc 720
atcacgttat tcgcggacgg cggtatgaca caatatcctt cattccaggc aggccgcggt 780
taa 783
<210> 4
<211> 260
<212> PRT
<213> GDH
<400> 4
MET Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala
5 10 15
Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala MET Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu
20 25 30
Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro
35 40 45
Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val
50 55 60
Val Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile
65 70 75
Val Gln Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile MET Ile
80 85 90
Asn Asn Ala Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu MET Pro
95 100 105
Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala
110 115 120
Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp
125 130 135
Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn MET Ser Ser Val His Ala Phe Pro
140 145 150
Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys
155 160 165
Leu MET Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile
170 175 180
Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn
185 190 195
Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp Val Glu Ser
200 205 210
MET Ile Pro MET Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile Ala Ala
215 220 225
Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr Gly
230 235 240
Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly MET Thr Gln Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260