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1、(10)授权公告号 CN 101628855 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 101628855 B *CN101628855B* (21)申请号 200810040588.8 (22)申请日 2008.07.15 C07C 39/17(2006.01) C07D 307/93(2006.01) A61K 31/055(2006.01) A61K 31/343(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (73)专利权人 中国科学院上海药物研究所 地址 200031 上海市太原路 294。
2、 号 (72)发明人 郭跃伟 王贺瑶 毛水春 张小东 (74)专利代理机构 北京金信立方知识产权代理 有限公司 11225 代理人 朱梅 黄丽娟 S. Caccamese et al.“Characterization of Laurencia Species by Gas Chromatography-Mass Spectrometry” . Botanica Marina .1979, 第 XXII 卷 ( 第1 期 ), 第 41-46 页 . S. Caccamese et al.“Characterization of Laurencia Species by Gas Chromat。
3、ography-Mass Spectrometry” . Botanica Marina .1979, 第 XXII 卷 ( 第 1 期 ), 第 41-46 页 . Maria Kladi et al. “New sesquiterpenes from the red alga Laurencia microcladia” . Tetrahedron .2007, 第 63 卷 ( 第 32 期 ), 第 7606-7611 页 . Maria Kladi et al. “New sesquiterpenes from the red alga Laurencia microcladia” 。
4、. Tetrahedron .2007, 第 63 卷 ( 第 32 期 ), 第 7606-7611 页 . LINDSAY R. WINKLER et al.“A CHOLINERGIC AGENT EXTRACTED FROM SEA HARES” .Arch. int. Pharmacodyn. .1962, 第 CXXXVII 卷 ( 第 1-2 期 ), 第 76-83 页 . LINDSAY R. WINKLER et al.“A CHOLINERGIC AGENT EXTRACTED FROM SEA HARES” .Arch. int. Pharmacodyn. .1962,。
5、 第 CXXXVII 卷 ( 第 1-2 期 ), 第 76-83 页 . Shui-Chun Mao et al.“A Laurane Sesquiterpene and Rearranged Derivatives from the Chinese Red Alga Laurencia okamurai Yamada” .Journal of Natural Products .2006, 第 69 卷 ( 第 8 期 ), 第 1209-1211 页 . Shui-Chun Mao et al.“A Laurane Sesquiterpene and Rearranged Derivat。
6、ives from the Chinese Red Alga Laurencia okamurai Yamada” .Journal of Natural Products .2006, 第 69 卷 ( 第 8 期 ), 第 1209-1211 页 . (54) 发明名称 月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、 及其 制备方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及一类从我国东海海洋植物冈村凹 顶藻中提取、 分离获得的月桂烷型倍半萜类化合 物或其衍生物、 及其制备方法和用途。 本发明的月 桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物结构式如下所 示， 当 R1、 R2和 R3同时为氢时， 即为劳藻酚 ； 当 R4 。
7、为氢时， 即为海兔素。 该类化合物及其衍生物经体 外检测表明具有明显的胰脂肪酶抑制活性， 可望 在制备预防或治疗肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂 肪肝等代谢失调性疾病药物中应用。本发明还可 为研制新的预防或治疗代谢失调性疾病药物提供 先导化合物， 对开发利用中国的海洋生物资源具 有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孟超 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一类月桂烷型倍半萜类化合物， 所述化合物为 4,8,15- 三溴劳藻酚或 8- 溴海兔素。 2. 结。
8、构式如下的月桂烷型倍半萜类化合物在制备胰脂肪酶抑制剂药物中的应用 ： 其中， R1、 R2、 R3和 R4各自独立地为氢或卤素。 3. 结构式如下的月桂烷型倍半萜类化合物在制备预防或治疗代谢失调性疾病药物中 的应用 ： 其中， R1、 R2、 R3和 R4各自独立地为氢或卤素。 4. 根据权利要求 3 所述的月桂烷型倍半萜类化合物的应用， 其特征在于， 所述代谢失 调性疾病包括肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂肪肝。 权 利 要 求 书 CN 101628855 B 2 1/5 页 3 月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、 及其制备方法和用 途 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体是。
9、一类从我国东海海洋植物冈村凹顶藻 (Laurencia okamurai) 中分离得到的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、 及其制备方法 和用途。该类化合物对胰脂肪酶具有明显的抑制活性， 可作为一类研制新的预防或治疗肥 胖症及相关代谢性疾病药物的先导化合物， 也可在制备治疗临床常见多发的肥胖症及相关 代谢性疾病药物中应用。 背景技术 0002 在近 20 年中， 全世界尤其是发达国家人群中肥胖的发病率日益增多。肥胖发生的 原因是多方面的， 如遗传因素、 环境因素、 饮食习惯等， 其中高脂饮食是导致肥胖的重要原 因。由于经济的发展和生活水平的提高， 运动不足和摄食能量相对过剩逐渐成为现代人生 活。
10、方式的主要问题， 代步工具的发达等导致现代人的能量消耗减少， 而人类背离传统饮食 模式的速度越来越快， 新的饮食模式和西方化的食物特点是具有高饱和脂肪含量和较低纤 维含量， 以致食品能量密度过大， 能量摄入过多。 这导致了众多现代人机体能量的摄入超过 了能量消耗。过剩的能量一部分作为脂肪贮存在脂肪组织中， 一段时间后它的积累导致肥 胖以及肥胖相关疾病， 比如糖尿病、 癌症、 心脏病、 高脂血症和脂肪肝等的发生。 0003 如何合理有效地解决肥胖给人类健康带来的影响是医药界面临的重要研究课题。 治疗肥胖症的药理方法集中于开发增加能量消耗的药物或减少能量摄取的药物。而减少 能量摄取的主要方法就是减。
11、小身体消化和吸收的食品， 尤其是脂肪。胰脂肪酶是肠道中脂 肪消化吸收所必需的酶。 食物中的脂肪在胰脂肪酶作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸 后， 在肠道被吸收， 然后在体内重新合成脂肪， 造成脂肪堆积， 最终可导致肥胖以及相伴的 高脂血症、 糖尿病等代谢性疾病的发生。应用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶对脂 肪的分解催化作用， 达到减少脂肪吸收、 控制和治疗肥胖的目的。 因而开发和应用有效的脂 肪酶抑制剂受到人们的关注。 目前用于治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主要来源于植物提取物和 化学合成。 从植物中提取抑制脂肪酶活性成分的报道较多， 但效果并不充分， 即使某植物的 提取物有效果， 可是其中的活性。
12、成分以及其量并不确定。目前市场畅销的脂肪酶抑制剂是 赛尼可， 赛尼可具有活性强， 稳定性好等特点， 但是其存在着包括难以控制的肠道症状、 油 便和呕吐腹涨等缺点。因此寻找新的胰脂肪酶抑制剂对肥胖、 糖尿病等代谢性疾病具有重 要的意义。 0004 冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)属于仙菜目松节藻科凹顶藻属植物， 全球约有 100多种， 我国海域分布有31种， 是红藻中最为常见的藻类植物之一。 冈村凹顶藻含有丰富 的次级代谢产物， 大体可分为倍半萜、 二萜、 三萜、 脂类和烯炔类等多种结构类型， 其中倍半 萜类化合物的结构类型最为多样， 报道最多的是花侧伯烷型和月桂烷型倍半萜。由。
13、于海洋 中卤离子含量高， 这些代谢产物绝大多数为卤代的化合物。 0005 在开发利用我国的海洋生物资源， 从中寻找具有生物活性及药用前景的海洋天然 说 明 书 CN 101628855 B 3 2/5 页 4 产物的过程中， 我们发现， 中国东海冈村凹顶藻的乙醚粗提物对胰脂肪酶具有很好的抑制 活性。 进一步的生物活性跟踪研究， 导致了月桂烷型倍半萜类化合物劳藻酚(Laurinterol) 和海兔素 (Aplysin) 的发现。体外胰脂肪酶抑制活性筛选实验表明， 劳藻酚及其衍生物、 海 兔素及其衍生物均对胰脂肪酶具有显著的抑制作用。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种从我国东海海洋植物。
14、冈村凹顶藻中提取分离得到的 月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物。 0007 本发明的另一目的是提供上述月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物的制备方法。 0008 本发明的还一目的是提供上述月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物在制备胰脂 肪酶抑制剂药物中的应用 ； 进一步地在制备预防或治疗代谢性疾病， 包括肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂肪肝药物中应用或可作为预防或治疗肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂肪肝及 相关代谢性疾病药物的先导化合物。 0009 本发明的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物具有如下的化学结构式 ： 0010 或 0011 其中， R1、 R2、 R3和 R4各自独立地为氢或卤素。 001。
15、2 优选地， R1、 R2、 R3和 R4各自独立地为氢或溴原子。 0013 具体地， 为 ： 劳藻酚、 8- 溴劳藻酚、 4， 8， 15- 三溴劳藻酚、 海兔素 或 8- 溴海兔素。 0014 上述卤素是指氟、 氯、 溴、 碘等原子 ； 优选溴原子。 0015 本发明提供了月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物的制备方法， 其包括以下步 骤 ： 0016 1) 提取 ： 将我国东海海洋植物冈村凹顶藻用丙酮溶剂提取， 所得提取液浓缩后得 粗浸膏 ； 将该粗浸膏悬浮于水中， 用乙醚萃取， 所得萃取液浓缩后得到乙醚浸膏 ； 0017 2) 分离 ： 对步骤 1) 中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析， 以石。
16、油醚 / 丙酮梯度洗 脱 ； 其中， 石油醚 / 丙酮体积比 98 2 洗脱部分， 经 200-300 目硅胶柱层析， 以石油醚 / 乙 醚梯度洗脱 ； 其中， 石油醚 / 乙醚体积比 8 1 洗脱部分， 经 400-600 目硅胶柱层析， 以正己 烷洗脱并纯化得到海兔素 ； 石油醚 / 丙酮体积比 90 10 洗脱部分， 经 Sephadex LH-20 凝 胶柱层析， 以体积比 2 1 1 的石油醚 / 氯仿 / 甲醇洗脱并纯化得到劳藻酚。 说 明 书 CN 101628855 B 4 3/5 页 5 0018 上述制备方法中， 所述步骤 1) 中， 所述的丙酮溶剂提取采用超声提取。 00。
17、19 上 述 制 备 方 法 中， 所 述 步 骤 2) 中， 所 述 的 石 油 醚 / 丙 酮 梯 度 洗 脱 是 以 石油醚 / 丙酮体积比 100 0 98 2 95 5 90 10 80 20 70 30 50 50 进 行 梯 度 洗 脱 ； 所 述 的 石 油 醚 / 乙 醚 梯 度 洗 脱 是 以 石 油 醚 / 乙 醚 体 积 比 100 0 98 2 95 5 9 1 8 1 7 1 进行梯度洗脱。 0020 进一步地， 上述的劳藻酚和海兔素通过卤素取代反应， 得到其相应的衍生物。 0021 本发明还提供了月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物在制备胰脂肪酶抑制剂药 物中的应用 。
18、； 进一步地在制备预防或治疗代谢失调性疾病药物中的应用， 所述代谢失调性 疾病包括肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂肪肝。 0022 本发明对月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物进行了胰脂肪酶抑制活性测试， 表 明这些化合物具有明显的胰脂肪酶抑制作用。 可用于制备预防或治疗肥胖症及相关代谢性 疾病的药物。 具体实施方式 0023 下面结合实施例对本发明作进一步阐述， 但本发明不限此。 0024 1H-NMR 用 Varian Inova 600 型仪测定 ； MS(ESIMS 及 HRESIMS) 用 Q-TOF Micro LC-MS-MS 型质谱仪测定 ； 所使用的硅胶， 为青岛海洋化工厂生产 。
19、； 各种溶剂均由国药集团 试剂有限公司生产， 均为分析纯。 0025 如无特殊说明， 以下实施例中涉及到的液 / 液之间比值均为体积比。 0026 实施例 1 ： 0027 月桂烷型倍半萜类化合物劳藻酚和海兔素的制备 0028 (1)提取 ： 我国东海冈村凹顶藻干重500g， 用丙酮1000ml反复超声提取3次， 提取 液合并后减压浓缩， 所得粗浸膏混悬于 500ml 水溶液中， 以乙醚 500ml 反复萃取该混悬液 3 次， 所得萃取液合并后减压浓缩得到乙醚浸膏 36.1g。 0029 (2)分离 ： 乙醚浸膏36.1g经200-300目硅胶柱层析， 以石油醚/丙酮10009 8295590。
20、10802070305050梯度洗脱， 每个梯度用量1000ml ； 其中， 石油醚 / 丙酮 98 2 洗脱液浓缩物得 4.65g， 经 200-300 目硅胶柱层析， 以石油醚 / 乙醚 100 0 98 2 95 5 9 1 8 1 7 1 梯度洗脱 ； 其中， 石油醚 / 乙醚 体积比 8 1 洗脱部分 3.40g， 经 400-600 目硅胶柱层析， 以正己烷洗脱并纯化得到海兔素 1.50g ； 石油醚 / 丙酮 90 10 洗脱液浓缩物得 4.01g， 该部分经 Sephadex LH-20 凝胶柱层 析， 以体积比 2 1 1 的石油醚 / 氯仿 / 甲醇洗脱并纯化得到劳藻酚 2。
21、.8g。 0030 0031 劳 藻 酚 的 理 化 性 质 和 波 谱 数 据 如 下 ： 白 色 针 晶， 分 子 式 为 C15H19OBr ； 1H 说 明 书 CN 101628855 B 5 4/5 页 6 NMR(300MHz， CDCl3) ： 7.60(s， H-11)， 6.61(s， H-8)， 5.24(brs， -OH)， 2.29(s， H3-12)， 2.18(dd， J12.6， 5.1Hz， H-5)， 1.65(dd， J12.6， 7.2Hz， H-5)， 1.94， 1.26(均为m， H2-4)， 1.40(s， H3-13)， 1.34(s， H3-。
22、14)， 1.15(m， H-3)， 0.56(m， H2-15) ； EIMS m/z 294， 296M+。 0032 海 兔 素 的 理 化 性 质 和 波 谱 数 据 如 下 ： 白 色 针 晶， 分 子 式 为 C15H19OBr ； 1H NMR(400MHz， CDCl3) ： 7.15(s， H-11)， 6.59(s， H-8)， 2.30(s， H3-12)， 1.85(m， H-3)， 1.76， 1.57( 均为 m， H2-5)， 1.64， 1.15( 均为 m， H2-4)， 1.31(s， H3-13)， 1.28(s， H3-14)， 1.09(d， J 6.。
23、5Hz， H3-15) ； EIMS m/z 294， 296M+。 0033 实施例 2 ： 0034 8- 溴劳藻酚 (R1为溴、 R2和 R3同时为氢 ) 0035 称取劳藻酚样品12.1mg溶于2.0ml乙酸乙酯溶液中， 加入1.5倍当量的NaBrO3水 溶液， 充分混合后， 在搅拌下逐滴加入 1.5 倍当量的 NaHSO3水溶液， 室温反应 18hr 后， 用乙 酸乙酯萃取来终止反应， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂， 得到 8- 溴劳藻酚 11.7mg。 0036 8- 溴劳藻酚的理化性质和波谱数据如下 ： C15H18OBr2； 1H NMR(300MHz， CDCl 3) ： 7.。
24、70(s， H-11)， 5.78(s， -OH)， 2.53(s， H3-12)， 2.23(dd， J 12.6， 5.1Hz， H-5)， 1.64(dd， J 12.6， 7.2Hz， H-5)， 1.94， 1.25( 均为 m， H2-4)， 1.40(s， H3-13)， 1.30(s， H3-14)， 1.10(m， H-3)， 0.53(m， H2-15) ； EIMS m/z 374， 359， 306M+。 0037 实施例 3 ： 0038 4， 8， 15- 三溴劳藻酚 (R1、 R2和 R3同时为溴 ) 0039 称取劳藻酚样品 67.5mg 溶于 5.0ml 氯仿。
25、溶液中， 加入 1.5 倍当量的 NaBrO3水溶 液， 充分混合后， 在搅拌下逐滴加入 1.5 倍当量的 NaHSO3水溶液， 室温反应 18hr 后， 用乙酸 乙酯萃取来终止反应， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂， 得到 4， 8， 15- 三溴劳藻酚 26.7mg。 0040 4， 8， 15- 三溴劳藻酚的理化性质和波谱数据如下 ： C15H16OBr4； 1HNMR(300MHz， CDCl3) ： 7.15(s， H-11)， 5.58(s， -OH)， 3.58(m， H-4)， 3.43(m， H-15)， 3.01(m， H-5)， 2.69(m， H-5)， 2.56(s， H。
26、3-12)， 1.26(s， H3-13)， 1.04(s， H3-14)， 2.54(m， H-3) ； EIMS m/z 532， 517， 357M+。 0041 实施例 4 ： 0042 8- 溴海兔素 (R4为溴 ) 0043 称取海兔素样品11.0mg溶于2.0ml乙酸乙酯溶液中， 加入1.5倍当量的NaBrO3水 溶液， 充分混合后， 在搅拌下逐滴加入 1.5 倍当量的 NaHSO3水溶液， 室温反应 18hr 后， 用乙 酸乙酯萃取来终止反应， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂， 得到 8- 溴海兔素 9.7mg。 0044 8- 溴海兔素的理化性质和波谱数据如下 ： C15H18O。
27、Br2； 1HNMR(300MHz， CDCl 3) ： 7.12(s， H-11)， 2.49(s， H3-12)， 1.25(m， H-3)， 1.87， 1.65(均为m， H2-5)， 1.78， 1.57(均为m， H2-4)， 1.31(s， H3-13)， 1.33(s， H3-14)， 1.14(d， J 6.5Hz， H3-15) ； EIMS m/z 374， 356M+。 0045 实验实施例 0046 胰脂肪酶抑制活性的测定 0047 胰脂肪酶抑制活性的测定以赛尼可作为阳性对照， 方法如下 ： 0048 首先底物对硝基苯乙酸 (p-Nitrophenyl acetate。
28、)(sigma 公司 ) 用磷酸缓冲液 (25mM， pH 6.8) 配成 1.35mM ； 猪胰脂肪酶 (sigma 公司 ) 用磷酸缓冲液配成 10mg/ml ； 受试 样品用磷酸缓冲液配制成不同浓度的溶液。 然后在96孔板中依次加入50l酶溶液、 50l 说 明 书 CN 101628855 B 6 5/5 页 7 底物溶液以及 10l 不同浓度的受试样品， 混匀。37下反应 10 分钟， 在 492nm 下检测每 孔的吸光度。 0049 根据在492nm下的吸光度计算化合物对胰脂肪酶的抑制率()， 并将酶活性抑制 率 ( ) 达到 50时抑制剂的浓度测定为 IC50值。抑制率 ( ) 。
29、可以根据下式进行。 0050 抑制率 ( ) (A-B)-(C-D)/(A-B)100 0051 上式中， A 表示反应后空白孔在 492nm 下的吸光度 ； 0052 B 表示反应前空白孔在 492nm 下的吸光度 ； 0053 C 表示反应后样品孔在 492nm 下的吸光度 ； 0054 D 表示反应前样品孔在 492nm 下的吸光度。 0055 结果 ： 见表 1。 0056 表 1 胰脂肪酶抑制作用 0057 0058 从表 1 可以看出， 劳藻酚、 8- 溴劳藻酚、 8- 溴海兔素对胰脂肪酶具有强的抑制作 用， 与阳性药赛尼可相比， 它们的作用强度属于同一数量级。 0059 总结 ： 胰脂肪酶是肠道中脂肪消化吸收所必需的酶， 食物中的脂肪在胰脂肪酶作 用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸后， 又经肠道吸收在体内重新合成脂肪， 造成脂肪堆 积， 最终可导致肥胖以及相伴的高脂血症、 糖尿病等代谢性疾病的发生。劳藻酚、 8- 溴劳藻 酚、 8- 溴海兔素等化合物经体外生物活性测试研究发现， 具有显著的胰脂肪酶抑制活性， 该 类化合物可望在制备预防或治疗肥胖症、 糖尿病、 高脂血症和脂肪肝等代谢失调性疾病药 物中应用。 说 明 书 CN 101628855 B 7 。