利用25A合成酶和RNASEL基因提高水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性.pdf

本发明公开了一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻条纹叶枯病抗性提高的品种的新方法。本发明的实质是根据2-5A合成酶和RNase L向应于病毒dsRNA，进而降解病毒RNA以限制寄主体内病毒增殖的原理，将两基因全长序列导入水稻中表达来提高转基因品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平。鉴于现有抗病品种存在抗性丧失的风险，本方法可以为水稻条纹叶枯病的可持续综合防控提供材料上的储备。

1、  2-5A合成酶和RNase L基因在提高水稻品种(系)对水稻条纹叶枯病抗性上的应用，其特征在于：将2-5A合成酶和RNase L两基因全序列分别构建植物表达载体，转化水稻品种获得转基因再生植株，通过PCR多代筛选获得的转基因双阳性水稻品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平较转基因受体品种(系)有显著提高。

利用2-5A合成酶和RNase L基因提高水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性
技术领域
本发明提供了一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻条纹叶枯病抗性提高的品种的新方法，属于农业生物技术领域。
背景技术
水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus，RSV)于1902年首次在日本分离获得，现广泛分布于中国、朝鲜、日本及前苏联东部各国，在田间引起水稻条纹叶枯病。RSV主要侵染禾本科植物，通过灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)以持久性方式传播，在寄主植物和介体昆虫中均能复制，并可由灰飞虱带毒雌虫经卵以较高比例传播给后代。近五年来水稻条纹叶枯病在江苏各水稻产区爆发流行，发病面积均在1000万亩以上，2004年更是出现了特大爆发，全省共有42个县发生水稻条纹叶枯病，波及面积达2320万亩，全省单季水稻损失在5亿斤以上，造成了粮食减产、农民减收，给农业生产带来了巨大的损失，同时也严重挫伤了农民的种粮积极性。由于迄今为止几乎没有能有效地从感染病毒的植株上除去病毒的化学药剂，而治虫防病的应急防治措施也无法作为一项长期的策略加以应用，这些原因进一步加大了病害的防治难度。国外的防治经验表明，利用品种自身的抗病性是防治病毒病最经济有效的措施，可是生产上目前使用的抗病品种抗性基因的来源多为巴基斯坦的水稻品种Modan，而随着病害的连年趋重发生，病毒亦存在进化变异进而克服上述抗病基因的可能性。因此有必要发掘和创制新的抗性资源，为水稻条纹叶枯病的可持续综合防控提供材料上的储备。
植物抗病毒转基因工程策略是通过导入一些植物外源的抗病毒基因来提高品种对病毒的抗性，一般分为以病毒基因组介导的抗性、以动物干扰素介导的抗性和以毒蛋白介导的抗性等几种。而其中以动物干扰素介导的抗性由于具有广谱抗性和环境友好等特点备受关注。动物的干扰素(Interferon，INF)是动物细胞在病毒或其它诱生剂作用下产生的，具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系。目前已见报道的主要为2’-5’寡腺苷酸酶系统(2-5A系统)，该系统在病毒dsRNA的作用下激活2-5A合成酶，产生一系列短的2′-5′寡腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活2-5A依赖性RNase L，RNase L进一步非特异的降解mRNA，从而对高等脊椎动物体内被侵染细胞内蛋白翻译产生抑制，并可引发细胞凋亡，以达到限制病毒增殖的目的。Mitra将人类的2-5A系统的两个酶以不同启动子驱动导入烟草中，发现转基因株对TMV、AMV和TEV的侵染均表现出了侵染部坏死现象。同时他还发现坏死现象仅局限于叶片部分，而未延伸至这个植株，另外他还发现转基因植株上未接种病毒的叶片没有被侵染，这表明2-5A系统在烟草中表达可以有效的提高植物对病毒的抗性，并具有广谱抗性和特异性特点。Truve则将2-5A系统导入土豆中也获得了相类似的结果。由于2-5A系统来源于高等脊椎动物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，这从一定程度上规避了转基因风险。但目前为止，以2-5A系统转化水稻获得抗病毒转基因材料的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻条纹叶枯病抗性提高的品种的新方法。
本发明所提供的提高水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性水平的方法，是根据人类2’-5’寡腺苷酸酶系统的2-5A合成酶和RNase L可以响应于病毒dsRNA，并通过降解病毒RNA来限制寄主体内病毒增殖的原理，将两基因全长序列导入水稻中使之表达，进而提高转基因品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平。
本发明所提供的能提高转基因受体品种(系)对水稻条纹叶枯病抗性水平的方法，是通过以下方法验证的：
1)从公共数据库获得2-5A合成酶和RNase L两基因全序列，将其分别构建植物表达载体‘
2)转化水稻品种获得转基因再生植株；
3)通过PCR或Southern blot方法多代筛选获得的转基因双阳性水稻品种(系)；
4)通过RT-PCR或Northern blot方法确定转基因双阳性水稻品种(系)中两基因是否正常转录；
5)通过接种鉴定方法表明转基因双阳性水稻品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平较转基因受体品种(系)有显著提高。
本发明提供了一种为水稻抗条纹叶枯病材料的创制提供新方法，其具有以下优点：①鉴于生产上目前使用的抗病品种抗性来源多为巴基斯坦的水稻品种Modan中的单一主效基因，而随着病害的连年趋重发生，病毒亦存在进化变异进而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以为水稻条纹叶枯病的可持续综合防控提供材料上的储备；②由于2-5A系统来源于高等脊椎动物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，不易出现病毒异源包被和重组的情况，较之病毒来源转基因策略本方法从一定程度上规避了转基因风险。
附图说明
图1为2-5A合成酶基因全序列获得方法示意图
图2为RNAse L基因全序列获得方法示意图
图3为2-5A合成酶基因植物表达载体构建示意图
图4为RNAse L基因植物表达载体构建示意图
图5为农杆菌介导转化水稻图(a为转化后愈伤组织开始分化；b为筛选出新的小苗)
图6为T₄代转2-5A系统基因水稻的PCR检测结果示意图(A为2-5A基因检测结果；B为RNase L基因检测结果；M为天为时代Marker III；1为植物转化载体扩增结果；2为非转基因对照扩增结果；3-10为T₄代转2-5A基因水稻植株扩增结果)
图7为T₄代转2-5A系统基因水稻的RT-PCR检测结果示意图(A为2-5A基因检测结果；B为RNase L基因检测结果；M为天为时代Marker III；1-4为T₄代转基因植株扩增结果；CK为未转基因植株扩增结果)
具体实施方式
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、2-5A合成酶和RNase L基因植物表达载体的获得
目的基因是来自于人类的2-5A系统的2-5A合成酶基因和RNAse L基因，具体获得方式为在因特网上输入网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/2379，进入图1页面，获得人类2-5A合成酶基因全序列；在因特网上输入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/485407？report＝genbank网址，进入图2页面，获得人类RNase L基因(2-5A依赖性RNase基因)全序列。获得的两基因长度分别为1.3kb和2.8kb，分别编码364个和741个氨基酸。按照图3、4构建植物载体pAMM2109和pAMM2106，包括目的基因和选择标记两个表达单元。启动子大小为800bp，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，启动目的基因组成性表达。终止子大小为253bp的Nos3’序列，来自于Ti质粒中胭脂碱合成酶基因的终止序列，起终止表达的作用。标记基因用nptII基因，大小为795bp来自于Kanr细菌，编码产物APH(3’)-II氨基糖苷3‘-磷酸转移酶II，亦称新霉素磷酸转移酶II，已证明无安全问题，是第一个安全使用的标记基因。载体中没有使用报告基因。
实施例2、利用2-5A合成酶和RNase L基因植物表达载体转化水稻
将两个植物转化载体pAMM2109和pAMM2106以冻融法导入农杆菌EHA105，以粳稻品种盐粳21的幼胚愈伤组织作为转基因的受体材料进行同时转化(图5)，水稻转化方法按Hiei等人的方法稍做改进。经抗生素筛选获得8个T₀代再生植株，移栽到玻璃温室均能正常生长、开花和结实，故获得8个家系的T₁代种子。
实施例3、转基因后代的PCR筛选
根据2-5A和RNase L的序列设计特异性引物，其中2-5A为5-TTCCTCAgTCC TCTCACCAC-3和5-gAgCTgCCTTCTCAggTACT-3，扩增片断大小为630bp；RNase L为5-CCTCTGCATAACGCAGTA-3和5-GCTCCAGAAGCCTCTGCAC-3，，扩增片断大小为590bp。采用CTAB大量DNA提取方法提取水稻DNA(方法参照分子克隆实验指南，略)。PCR反应体系为10ng DNA模板，0.7ul Primer(4pmol/ul)，1ul 10×Buffer(freeMgCl₂)，0.2ul dNTP(2.5mM)，0.6ul MgCl₂(25mM)，0.1ul Taq(5u/ul)，6.4ul ddH₂O。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s、55-62℃退火30s、72℃延伸1min，共进行35次循环72℃延伸7min。用0.8％的琼脂糖检测其扩增产物，EB染色，凝胶成像系统拍照记录试验结果。
采用PCR方法对T₁-T₃代连续进行选择，对以盐粳21为受体的1个T₁代转基因双阳性株的200个后代进行选择，获得17个双阳性T₂代株，2-5A和RNase L两对引物从转基因阳性株中分别扩增出630bp和590bp的带；选择10个T₂代播种8株进行鉴定，PCR鉴定筛选获得27个双阳性T₃代株，但来源于同一T₂代的T₃代株系没有全表现为双阳性的株系；对其中的编号为4的T₃代转基因株的8个后代进行鉴定，发现8株均表现为双阳性(图6)。从8株中选择4株4-2、4-4、4-5和4-6的后代各20个株系进一步鉴定发现，其后代亦均表现为双阳性。
实施例4、2-5A系统转基因水稻植株的转录检测
采用TRIzol法提取水稻总RNA对4-5等4个T₃代转基因双阳性株进行RT-PCR，取水稻叶片组织0.1g，加入1mL TRIzol reagent充分研磨，室温放置5min；加入氯仿200μL，充分震荡15sec，室温放置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相加入另一离心管中，加入0.5mL异丙醇；12,000g，4℃，离心10min(可见RNA沉淀)，弃去上清；加入1mL70％乙醇(涡漩，7,000g离心5min)；干燥RNA沉淀，加ddH2O 40μL溶解即可。取一Eppendorf管，加入各样品RNA 3μL，3`-端引物1μL，D.D.W 6μL，置于70℃下变性5min，立即取出置于冰上放置5min。再依次加入下列试剂：2μL 5×M-MuLV反转录酶缓冲液、0.5μL40mmol/LdNTPs(每种10mmol/L)、0.5μL RNasin(40U/μL)、0.5μL M-MuLV反转录酶(20U/μL)和1.5μL加入DEPC处理过的D.D.W。42℃水浴1h，70℃灭活10min，-20℃保存备用。再按上一步程序进行PCR，结果显示2-5A和RNase L两对引物从4个转基因双阳性株中分别扩增出630bp和590bp的带，表明在4个转基因双阳性株中2-5A和RNase L两基因均能正常转录(图7)。
实施例5、2-5A系统转基因水稻株系对水稻条纹叶枯病的抗性表现
利用上述研究确定的方法鉴定4个以盐粳21为受体的转基因株系的抗性表现，试验预设水稻条纹叶枯病抗病对照镇稻88、感病对照武育粳3号及受体对照盐粳21。鉴定方法具体如下：(1)浸种，催芽，至0.5叶时播于烧杯中，每个材料鉴定35株左右，3次重复；(2)到1.5叶龄时，接种带毒灰飞虱2-5龄若虫，有效接种虫量为4虫/苗，接种前要齐苗；(3)烧杯用纱布封口，48小时后，将灰飞虱移走。移栽接种苗至秧盘，置于玻璃房中，注意水、温管理；(4)接种后7天开始调查病害发生情况，其后每隔三天调查一次，连续调查5次。病害调查参照周彤等制订的标准：0级，无症状；1级，有轻微黄绿色斑驳症状，病叶不卷曲，植株生长正常；2级，病叶上褪绿扩展相连成不规则黄白色或黄绿色条斑，病叶不卷曲或略有卷曲，生长基本正常；3级，病叶严重褪绿，病叶卷曲呈捻转状，少数病叶出现黄化枯萎症状；4级，大部分病叶卷曲呈捻转状，叶片黄化枯死，植株呈假枯心状或整株枯死。其中2-4级直接记为发病，1级在2天后再次调查确认，0级记为不发病，计算发病率。结果显示4个转基因株系对水稻条纹叶枯病的抗性水平较受体盐粳21和感病对照武育粳3号有显著性提高(表1)。
表1  2-5A转基因水稻株系对水稻条纹叶枯病的抗性表现

鉴于生产上目前使用的抗病品种抗性来源多为巴基斯坦的水稻品种Modan中的单一主效基因，而随着病害的连年趋重发生，病毒亦存在进化变异进而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以为水稻条纹叶枯病的可持续综合防控提供材料上的储备。同时由于2-5A系统来源于高等脊椎动物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，不易出现病毒异源包被和重组的情况，较之病毒来源转基因策略本方法从一定程度上规避了转基因风险。
上述实施不以任何形式限定本发明。