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1、(10)申请公布号 CN 102796782 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796782 A *CN102796782A* (21)申请号 201210299063.2 (22)申请日 2012.08.22 C12P 19/04(2006.01) (71)申请人 安徽科技学院 地址 233100 安徽省蚌埠市龙子湖区东郊东 华路 9 号 (72)发明人 王松华 李正鹏 蒋圣娟 祝嫦巍 何华奇 何庆元 孙玉军 (74)专利代理机构 安徽省蚌埠博源专利商标事 务所 34113 代理人 倪波 (54) 发明名称 硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用 (57) 摘要 本发明。
2、公开硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖 中的应用， 硝普钠作为诱导剂在灵芝深层发酵液 培养 3 5 天时加入以诱导灵芝深层发酵灵芝多 糖， 本发明采用一氧化氮供体硝普钠晶体溶于水 配制成硝普钠水溶液作为灵芝深层发酵灵芝多糖 的诱导剂， 硝普钠通过在细胞中缓慢释放出一氧 化氮， 行使其促进次生代谢物灵芝多糖合成的功 能， 实验研究结果表明， 采用本发明在灵芝发酵 液中加入适量的硝普钠可有效提高灵芝多糖产量 25 160%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 硝。
3、普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用， 其特征在于 ： 硝普钠作为诱导剂诱导灵 芝深层发酵灵芝多糖， 提高灵芝多糖的产量。 2. 根据权利要求 1 所述硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用， 其特征在于 ： 硝普 钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝多糖的具体做法是， 在灵芝深层发酵液培养 3 5 天 时， 向发酵液中加入浓度为 500mmol/L 的硝普钠水溶液， 硝普钠水溶液与发酵液的体积比 为 0.1 2%， 继续培养 4 8 天后， 获取含灵芝多糖的发酵产物。 3. 根据权利要求 2 所述硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用， 其特征在于 ： 所述 硝普钠水溶液与发酵液的体积比为 0.2 1。
4、.0%。 4. 根据权利要求 2 所述硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用， 其特征在于 ： 所述 硝普钠水溶液与发酵液的体积比为 0.2%。 权 利 要 求 书 CN 102796782 A 2 1/3 页 3 硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用 技术领域 0001 本发明涉及灵芝深层发酵技术， 特别是硝普钠 （SNP） 在灵芝深层发酵次生代谢产 物灵芝多糖中的应用， 以提高灵芝多糖的产量。 背景技术 0002 灵芝 Ganoderma lucidum (Fr.) Krast (Polyporaceae) 隶属于非褶菌目 ( 无 褶菌目，Aphyllophorales) 灵芝科 （Gano。
5、dermataceae） 灵芝属 (Ganoderma)， 素有 “仙草” 、 “灵丹妙药” 之称， 是一种食药兼用真菌， 在中国、 日本、 韩国和台湾地区有着悠久的应用历 史。现代生物学已证明灵芝子实体和菌丝体中含有多糖类、 核苷类、 氨基酸蛋白质类、 三萜 类、 呋喃类、 生物碱类、 油脂类、 甾醇类、 有机锗、 无机离子等活性物质， 其中灵芝多糖存在于 灵芝子实体、 菌丝体、 孢子粉的主要活性成分， 具有抗肿瘤、 抗衰老、 抗氧化、 抗艾滋病病毒、 防止动脉硬化和血栓形成、 改善高血脂、 提高人体免疫力、 镇痛等广泛的药理作用， 具有很 高的药用价值。因此 , 如何利用现代生物学技术提高。
6、灵芝多糖产量一直是微生物学、 园艺 学和发酵工业的重要研究领域 , 对医药业与农业的发展具有不可估量的价值。 0003 目前， 灵芝多糖主要从灵芝子实体中提取。 人工栽培灵芝子实体生产周期长， 且生 长条件和产品质量不易控制。采用深层发酵培养的方法来获得灵芝多糖， 具有生产周期大 大地缩短、 质量易控制、 主要组分和野生灵芝基本一致， 且发酵菌丝体中的多糖含量也高于 子实体等特点。可见， 深层发酵是获取灵芝多糖的一种有效途径。然而， 产量偏低的问题仍 是限制灵芝深层液体发酵规模化生产的一个瓶颈。大量的研究表明， 在培养基中添加一定 浓度的真菌激发子、 钙离子、 铜离子、 过氧化氢和茉莉酸等信号。
7、分子和植物激素均可一定程 度提高灵芝多糖和灵芝酸含量。然而， 动物和植物信号分子一氧化氮 （NO） 在食药用真菌内 的生理生化功能目前国内外尚未展开。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供硝普钠在灵芝深层发酵次生代谢产物灵芝多糖中的应用， 硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝多糖， 以提高灵芝多糖的产量。 0005 根据灵芝菌种的发酵特点和生理代谢特性经过广泛筛选和系统的条件试验， 发现 采用一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)配制一定浓度的水溶液经过滤除菌后， 在灵芝细胞生 长的一定阶段加至深层发酵液中， 可以提高灵芝多糖的产量。 0006 硝普钠在灵芝深层发酵灵芝多糖中的应用， 其特征。
8、在于 ： 硝普钠作为诱导剂诱导 灵芝深层发酵灵芝多糖， 提高灵芝多糖的产量。 0007 硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝多糖的具体做法是， 在灵芝深层发酵液 培养 3 5 天时， 向发酵液中加入浓度为 500mmol/L 的硝普钠水溶液， 硝普钠水溶液与发酵 液的体积比为 0.1 2%， 继续培养 4 8 天后， 获取含灵芝多糖的发酵产物。 0008 本发明优选技术方案是， 发酵液中加入占发酵液体积 0.2 1.0% 的浓度为 500mmol/L 硝普钠水溶液。 说 明 书 CN 102796782 A 3 2/3 页 4 0009 本发明最优技术方案是， 发酵液中加入占发酵液体积0.2%。
9、的浓度为500mmol/L硝 普钠水溶液。 0010 本发明的原理是一氧化氮诱导深层发酵培养的灵芝细胞氧化迸发， 促进过氧化氢 等活性氧的产生， 进而诱导灵芝合成次生代谢物相关基因的表达。 0011 本发明采用一氧化氮 （NO） 供体硝普钠晶体溶于水配制成硝普钠水溶液作为灵芝 深层发酵次生代谢产物的的诱导剂， 硝普钠通过在细胞中缓慢释放出 NO， 行使其促进次生 代谢物合成的功能， 实验研究结果表明， 采用本发明在灵芝发酵液中加入适量的硝普钠可 有效提高灵芝多糖产量 25 160%。 具体实施方式 0012 硝普钠 （SNP） 在提高深层发酵灵芝多糖产量中的应用， 具体方法如下 ： 1) 配制。
10、浓度为 500mmol/L 的硝普钠 （Na2Fe(CN)5NO） 水溶液 ； 2) 取冰箱保存的灵芝 Ganoderma lucidum (Fr.) Krast (Polyporaceae) 母种菌丝 体接入新鲜的马铃薯综合固体培养基斜面上， 置于 28培养箱中培养 7 天， 将菌丝接入马 铃薯综合液体培养基， 于恒温摇床 25 30， 100 160rpm 条件下培养 2 5 天， 用分散 器将菌丝球打碎即为灵芝种子液。 0013 实施例一 ： 取灵芝种子液按 5% 接种量接入五个盛有 95mL 液体培养基 ( 内含葡萄 糖 2.0 克、 蛋白胨 1.0 克、 磷酸二氢钾 0.1 克、 硫。
11、酸镁 0.1 克 ) 的三角烧瓶中， 于恒温摇床 28、 140rpm 培养 3 天时， 分别加入 0、 0.1、 0.2、 1.0、 2.0mL 浓度为 500 mmol/L 的硝普钠 水溶液， 继续培养 6 天后， 收获含灵芝多糖的发酵产物 （发酵液） 。将发酵液以 5000rpm 离 心 10min， 上清液于 60旋转蒸发器中浓缩， 加入 4 倍体积无水乙醇于 4冰箱静置 48h， 5000rpm 离心 10min 得沉淀， 用 Sevag 法除去蛋白， 在 4用去离子水透析 24h、 60旋转蒸 发器浓缩、 -45真空冷冻干燥 36h。灵芝多糖经 756MC 紫外可见分光光度计于 5。
12、40 纳米吸 收峰确定， 分别得 0.065 克、 0.081 克、 0.173 克、 0.132 克、 0.096 克灵芝多糖。 0014 实施例二 ： 取灵芝种子液按 5% 接种量接入五个盛有 95mL 液体培养基 ( 内含葡萄 糖 2.0 克、 蛋白胨 1.0 克、 磷酸二氢钾 0.1 克、 硫酸镁 0.1 克 ) 的三角烧瓶中， 于恒温摇床 28、 140rpm 培养 5 天时， 分别加入 0、 0.1、 0.2、 1.0、 2.0mL 浓度为 500 mmol/L 的硝普钠 水溶液， 继续培养 4 天后， 收获含灵芝多糖的发酵产物 （发酵液） 。将发酵液以 5000rpm 离 心 1。
13、0min， 上清液于 60旋转蒸发器中浓缩， 加入 4 倍体积无水乙醇于 4冰箱静置 48h， 5000rpm 离心 10min 得沉淀， 用 Sevag 法除去蛋白， 在 4用去离子水透析 24h、 60旋转蒸 发器浓缩、 -45真空冷冻干燥 36h。灵芝多糖经 756MC 紫外可见分光光度计于 540 纳米吸 收峰确定， 分别得 0.072 克、 0.096 克、 0.186 克、 0.141 克、 0.093 克灵芝多糖。 0015 实施例三 ： 取灵芝种子液按 5% 接种量接入五个盛有 95mL 液体培养基 ( 内含葡萄 糖 2.0 克、 蛋白胨 1.0 克、 磷酸二氢钾 0.1 克、。
14、 硫酸镁 0.1 克 ) 的三角烧瓶中， 于恒温摇床 28、 140rpm 培养 4 天时， 分别加入 0、 0.1、 0.2、 1.0、 2.0mL 浓度为 500 mmol/L 的硝普钠 水溶液， 继续培养 6 天后， 收获含灵芝多糖的发酵产物 （发酵液） 。将发酵液以 5000rpm 离 心 10min， 上清液于 60旋转蒸发器中浓缩， 加入 4 倍体积无水乙醇于 4冰箱静置 48h， 5000rpm 离心 10min 得沉淀， 用 Sevag 法除去蛋白， 在 4用去离子水透析 24h、 60旋转蒸 发器浓缩、 -45真空冷冻干燥 36h。灵芝多糖经 756MC 紫外可见分光光度计于。
15、 540 纳米吸 说 明 书 CN 102796782 A 4 3/3 页 5 收峰确定， 分别得 0.061 克、 0.076 克、 0.162 克、 0.119 克、 0.087 克灵芝多糖。 0016 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式上的限制 ； 任 何熟悉本领域的技术人员， 在不脱离本发明技术方案范围情况下， 都可利用上述揭示的方 法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰， 或修改为等同变化的等效实 施例。 因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所做 的任何简单修改、 等同替换、 等效变化及修饰， 均仍属于本发明技术方案保护的范围内。 说 明 书 CN 102796782 A 5 。