技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种具有TLR4免疫 应答功能的细胞模型及其构建方法。
背景技术
真核生物的天然免疫是抵抗外界病原体入侵的第一道防线，主要通过 模式识别受体来识别外来的病原体，随即引发一系列信号传导、细胞因子 活化、激活免疫系统，在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。Toll样受体 (Toll Like Receptors，TLRs)是近年来研究和发现的识别入侵机体病原体 的模式受体之一。TLRs能够最先接触入侵的病原体，通过识别位于病原体 表面的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern， PAMP)，TLRs可激活、引发一系列趋化因子和促炎性细胞因子的转录和分泌， 如提高白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素1β(IL-1 β)等细胞因子的表达水平，调动炎症反应所需的多种炎性细胞和炎性分 子，对入侵的病原体进行清除，发挥机体天然免疫的重要防御作用。有关 人、鼠、牛等不同物种的TLRs研究已证实，TLRs基因的遗传变异和修饰会 影响机体对感染性疾病的易感性，并影响疾病的发生和发展。所以，TLRs 一经发现，就以其重要而独特的生物学功能和潜在的应用前景迅速成为免 疫学、遗传学等研究的热点。不同的TLRs家族成员能特异地识别不同类型 的病原体，Toll样受体4(TLR4)可以特异性地识别革兰氏阴性菌独特的 结构成分-脂多糖(LPS)。
革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌是引起奶牛乳房炎发病的主要病原菌 之一。只有当入侵的病原微生物被及时有效地清除，才能使病原微生物所 引起的炎症反应对乳腺组织结构和功能的损害降到最低。其中任何一个环 节的功能障碍都会干扰乳房正常的炎症反应，造成不同程度的乳房炎症。 在这一过程中，奶牛乳腺组织中的乳腺上皮细胞和巨噬细胞的TLR4负责识 别革兰氏阴性菌并激活机体相应的免疫应答反应。事实上，TLR4对革兰氏 阴性菌识别的敏感程度及诱发机体免疫反应的快慢决定了奶牛乳房炎的发 病程度。研究也表明，TLR4基因的突变会影响奶牛乳房炎的发病率。因此 TLR4被认为是抵御奶牛乳房感染的重要候选功能基因之一而备受关注。
在体外细胞水平对TLR4基因功能及其在奶牛乳房抗感染免疫的作用展 开研究，不仅可以排除奶牛个体作为模型时的复杂性、减少许多环境的干 扰因素，而且保证了基因功能的研究尽可能地在相同的遗传背景下进行， 从而获得比较准确客观的体外研究结果。这样既有助于理解TLR4基因的作 用机理，又能为在个体水平进行基因功能的深入研究提供可借鉴的实验依 据和参考。与人、小鼠相比，用于研究牛TLR4基因功能相应的商品化细胞 模型缺乏，一定程度上制约了这一领域的研究。到现在为止，尚没有商品 化的牛乳腺上皮细胞系，加之原代乳腺上皮细胞培养条件苛刻，经传代后， 细胞极易老化而丧失其乳腺细胞的特性。获得可用来研究TLR4基因功能的 细胞模型，能够克服由于缺乏合适的抗体、基因敲除模型和现成的细胞模 型造成的牛TLR4功能研究手段十分有限的技术难题。
HEK293细胞是人胚胎肾细胞，常常用来研究基因功能的商品化细胞系， 而HEK293细胞本身不表达TLR4、CD12和MD2，不能被LPS激活产生相应 的细胞因子。因此，HEK293不能直接用来进行TLR4功能研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建 方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及具有TLR4免疫应答功能的细胞模型，其特征在于将 牛源MD2、CD14、TLR4不同的三个基因用2A序列连接、组装到载体上，将 载体导入商品化细胞系中，构建的细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的商品化细胞系是HEK293。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体是pLEX-MCS载体。
本发明另一方面还涉及上述细胞模型的构建方法，其特征在于包括扩 增MD2、CD14、TLR4序列，然后将所扩增的序列组装到载体上，并将载体 导入到商品化细胞系中，选择同时表达MD2、CD14、TLR4三个蛋白的阳性 细胞系。
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于克隆MD2、CD14、TLR4 基因编码序列的3’末端引物，均增加了HA基因序列，HA标签的编码序列 为AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA；在扩增CD14和MD2的下游引物中增加 能自行裂解其序列前后的两个表达蛋白、使之等摩尔独立表达的2A序列， 其中2A序列为gag ggc aga gga agt ctg cta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca；同时，在2A前后加入Linker序列tccactgcc利于 表达蛋白正确折叠。为方便重组载体的组装，在MD2基因的上游引物中增 加了SpeI内切酶序列，在MD2基因的下游引物中增加了Xho I内切酶序列； 在CD14基因的上游引物中增加了Xho I内切酶序列，在CD14基因的下游 引物中增加了Mlu I内切酶序列；在TLR4基因的上游引物中增加了Mlu I 内切酶序列，在TLR4基因的下游引物中增加了Age I内切酶序列。
在本发明的一个优选实施方式中，设计扩增MD2基因CDS序列的引物， 上游引物为：ccgtga atc atg ttt cca ttt gtg ctt ttt tcc， 下游引物为：gtttgg gcc agg att ctc ctc gac gtc acc gca tgttag cag act tcc tct gcc ctc tcc act gcc agc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta gta att g；设计扩增CD14基因CDS序列的引物，上游引物为： cca ctc gag ctg act atg gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg，下游引物为： gtt acg cgt tgg gcc agg att ctc ctc gac gtc acc gca tgt tag cag acttcc tct gcc ctc tcc act gcc agc gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcg aag；设计扩增TLR4基因CDS序列的引物，上游引物为：gcc agg atg atg gcg cgt gcc cgc ctg gct gcg gct ctg atc cc，下游引物 为：ctt aat acc ggt tca agc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg cgg gttg。
本发明构建的细胞模型为研究牛TLR4基因的功能，阐明牛TLR4基因 的作用机制提供技术支持，是一个有价值的牛TLR4基因功能的研究工具。
附图说明
图1牛源MD2、CD14、TLR4在HEK293中同时、独立表达的Western-Blot 检测(图例说明：1-2分别为两株转染pLEX-MD2-CD14-TLR4的HEK293细 胞，3为蛋白质标准分子量，4为转染pLEX-MCS空载体的HEK293细胞。所 用一抗为鼠抗HA标签蛋白抗体，二抗则为抗鼠的荧光标记抗体。)
图2LPS刺激过表达BPI和未过表达BPI的mHEK293细胞前后TNFα 基因的相对表达水平的变化
图3LPS刺激过表达BPI和未过表达BPI的mHEK293细胞前后IL-8 基因的相对表达水平的变化
图4LPS刺激过表达TLR4不同基因型的HEK293细胞前后TNFα基因的 相对表达水平的变化
图5LPS刺激过表达TLR4不同基因型的HEK293细胞前后IL-8基因 的相对表达水平的变化
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例仅 仅是举例性说明，并非用以限定本发明的保护范围。
(1)引物设计
根据GenBank中牛MD2基因的mRNA序列(DQ319076)，设计扩增MD2基 因CDS序列的引物，上游引物为：ccgtga atc atg ttt cca ttt gtg ctt ttt tcc，下游引物为：gtttgg gcc agg att ctc ctc gacgtc acc gca tgt tag cag act tcc tct gcc ctc tcc act gcc agc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta gta att g。根据GenBank中牛CD14基因的mRNA 序列(AF141313.1)，设计扩增CD14基因CDS序列的引物，上游引物为：cca ctc gag ctg act atg gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg，下游引物为：gtt acg cgt tgg gcc agg att ctc ctc gac gtc acc gca tgt tag cag act tcc tctgcc ctc tcc act gcc agc gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcg aag。 根据GenBank中牛TLR4基因的mRNA序列(DQ839567.1)，设计扩增TLR4基 因CDS序列的引物，上游引物为：gcc agg atg atg gcg cgt gcc cgc ctg gct gcg gct ctg atc cc，下游引物为：ctt aat acc ggt tca agc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg cgg gttg。
为了重组蛋白的wes tern blotting检测，在每个重组蛋白基因编码序 列的3’末端，增加了HA基因序列，HA标签的编码序列为 AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA。同时，为了保证三个基因能单独表达，在 CD14和MD2的下游引物中增加了两种蛋白表达后能自行裂解成两个相互独 立的蛋白，自行行使其功能的2A序列，在2A前后加入Linker序列 tccactgcc，以确保表达的重组蛋白构象正确折叠。其中2A序列为gag ggc aga gga agt ctg cta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca。 此外，为了保证三个基因能首尾相连的组装到pLEX-MCS载体中，在MD2基 因的上游引物中增加了Spe I内切酶序列，在MD2基因的下游引物中增加了 Xho I内切酶序列；在CD14基因的上游引物中增加了Xho I内切酶序列， 在CD14基因的下游引物中增加了Mlu I内切酶序列；在TLR4基因的上游 引物中增加了Mlu I内切酶序列，在TLR4基因的下游引物中增加了Age I 内切酶序列，斜体的序列为内切酶识别序列。
(2)实验样品采集与总RNA提取
采集奶牛的新鲜血液组织2ml，经过红细胞裂解液处理后，按照杭州博 日RNA提取试剂盒说明书进行提取。
(3)RT-PCR
对牛血液组织RNA进行反转录，反转录方法参照说明书；以反转录的 cDNA为模板，利用基因的特异性上下游引物进行PCR反应，其反应体系为： 2uL cDNA模板，2uL 10×PCR buffer，2uL dNTP(各2.5mM)，上下游引物 (10mM)各1uL，1uL DMSO，1UTaq酶(宝生物，Pfu)，用ddH2O调整至20uL。 TLR4基因PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃(-2℃ /2循环)退火40s以及72℃延伸180s共16个循环；然后95℃变性30s， 51℃退火40s以及72℃延伸180s共19个循环；最后72℃延伸5min。CD14 基因PCR反应条件中延伸时间为60s，MD2基因中延伸时间为90s，其它的 条件同TLR4基因PCR反应条件。反应结束，取反应液5uL进行琼脂糖凝胶 电泳检测，确认其产物。
(4)克隆和测序
将牛MD2的扩增产物及pLEX-MCS载体分别根据各自引物上的内切酶设 计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后的PCR产物和pLEX-MCS载体，利 用T4 DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX-MCS载体，转化E.coli DH5 α；利用AMP+进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆 质粒正确的质粒命名为pLEX-MD2。将牛CD14的扩增产物及pLEX-MD2载体 分别根据CD14引物上的内切酶设计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后 的PCR产物和pLEX-MD2载体，利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物 和pLEX-MD2载体，转化E.coli DH5α；利用AMP+进行平板筛选，并以PCR 法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆质粒正确的质粒命名为pLEX-MD2-CD14。 最后将牛TLR4的扩增产物及pLEX-MD2-CD14载体分别根据TLR4引物上的 内切酶设计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后的PCR产物和 pLEX-MD2-CD14载体，利用T4 DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX- MD2-CD14载体，转化E.coli DH5α；利用AMP+进行平板筛选，并以PCR法 和限制性酶切法鉴定，阳性克隆质粒正确的质粒命名为 pLEX-MD2-CD14-TLR4。
(5)在293T细胞中包装重组慢病毒步骤：
第1日：293T细胞培养和铺板
293T细胞培养条件，37℃，5％的CO2，培养基采用DMEM+10％的胎牛血清， 每10cm面积中铺2-2.5×106个293T细胞，保证第2天细胞在完全培养液 中汇合度达到70-80％；
第2日：Lipectamine 2000脂质体转染
在聚丙烯管里准备脂质体和DNA复合物；
加入1.5ml预热的Opti-MEM培养基后，按下列比例加入目的载体及病 毒包装载体。轻轻混匀。室温放置；
转染载体(pLEX-MD2-CD14-TLR4) 12ug
包装质粒(pSPAX2) 9ug
包膜质粒(pMD2G) 3.5ug
在使用Lipectamine 2000之前先轻轻混匀脂质体。而后，在另一个管 中加入1.5ml室温的Opti-MEM培养基，再加入50ul Lipectamine 2000， 轻轻混匀后室温放置，室温放置5min后；将上述稀释好的DNA与脂质体混 合，混合物置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待 转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞；将细胞培养板放回37℃ 培养箱中孵育，2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加 入10ml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37℃培养箱中培养。
第4日收集病毒
收集含病毒的细胞培养上清液。将细胞上清用0.45um过滤器过滤，收 集过滤液；将包含病毒颗粒的过滤液分装至1.5ml的eppendorf中，置于 液氮或者-70℃保存备用；
(6)利用慢病毒感染HEK293细胞，制作细胞模型。
先对HEK293细胞培养和铺板，293细胞培养条件，37℃，5％的CO2，培 养基采用DMEM+10％的胎牛血清，每个6孔板中铺3×105的HEK293细胞。
当细胞汇合度达到70％时，将0.5mL重组慢病毒和0.5mLDMEM培养基混 合液，加入聚凝胺(Polybrene)10μg后加入6孔板，在感染 pLEX-MD2-CD14-TLR4重组病毒时，为保证试验结果的可重复性，都设置平 行样品。同时设置感染pLEX-MCS病毒的样品作为感染对照，设置不感染病 毒的样品作为阴性对照。
16h后换新鲜培养液，继续培养48h，加入1μg/mL的puromycin筛 选细胞，每2d更换新鲜培养基。未感染重组慢病毒的对照组细胞在6d后 全部死亡。继续用添加puromycin的培养基培养至转染pLEX-MD2-CD14-TLR4 基因的HEK293细胞，通过Western blotting鉴定后获得稳定表达 pLEX-MD2-CD14-TLR4的HEK293细胞系(见图1)，命名为mHEK293。
(7)验证制作细胞模型mHEK293细胞的免疫功能。
在6孔板中培养相同数目的mHEK293细胞，分别在培养基中添加终浓 度为100ng/ml的LPS，不同时间点收细胞后，提取细胞的RNA。
设计TNFα、IL-8细胞因子的引物，通过Real-Time PCR检测LPS刺 激前后不同时间点的相对表达量，结果显示细胞因子在LPS刺激后表达水 平迅速增加(参见图2和图3中未表达BPI的BPI-实验组))，说明构建的 细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。
BPI基因能够抑制LPS介导的免疫反应，本研究通过实施例步骤2、步 骤3和步骤4的方法，扩增牛BPI基因，把BPI基因克隆到pLEX-MCS载体 中，构建pLEX-BPI的重组载体，通过实施例步骤5制作pLEX-BPI的慢病 毒重组颗粒，然后把重组慢病毒颗粒pLEX-BPI感染mHKE293细胞模型。在 6孔板中培养相同数目感染pLEX-BPI慢病毒的mHEK293细胞，分别在培养 基中添加终浓度为100ng/ml的LPS，不同时间点收细胞后，提取细胞的RNA。
利用设计的IL-8、TNFα细胞因子引物，通过Real-Time PCR检测LPS 刺激前后不同时间点的相对表达量，结果显示在LPS刺激后感染pLEX-BPI 慢病毒的mHEK 293细胞的细胞因子表达水平和对照相比没有显著变化(参 见图2和图3中过表达BPI的BPI/BPI714+实验组)。也就是说，构建的 mHEK293细胞模型感染pLEX-BPI慢病毒后，BPI抑制了LPS介导的免疫反 应。
本实验通过上述实验证明了构建的mHEK293细胞模型能够用于研究牛 TLR4基因功能。
(8)在细胞模型上对不同基因型TLR4功能差异的评估
TLR4基因序列E+2021位点发生突变，根据遗传学分析发现该位点不同 基因型个体间奶牛乳房炎的发病率存在显著差异，本实施例对TLR4E+2021 不同基因型的功能在改造的HEK293细胞模型进行评估。
根据实施步骤1设计的引物，分别扩增MD2、CD14和TLR4不同基因型 的序列，然后进行步骤2-6的细胞模型构建，分别对包含不同基因型的细 胞进行不同浓度的LPS侵染，然后收细胞，提取细胞的总RNA，对RNA进行 反转录。利用实施步骤7中细胞因子的设计引物，采用Real-Time PCR检 测两种TLR4两种基因型细胞在受到LPS刺激后，以上细胞因子表达量的差 异。发现不同浓度LPS刺激不同基因型的细胞模型后，IL-8的相对表达量 差异不显著，而TNFα的相对表达量差异显著(参见图4和图5)，说明 TLR4E+2021位点突变确实对TLR4基因的功能造成影响。
当理解的是，上述具体实施方式仅仅是举例性说明，对本领域普通技 术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换 都应属于本发明所附权利要求的保护范围。