技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于扩增I型单纯性疱疹病毒的 LAMP引物组及试剂盒与应用。
背景技术
单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）属于疱疹病毒科α病毒亚科， 自然界的唯一宿主为人，分为I型和II型。其中，I型单纯疱疹病毒（HSV-I） 常引起单纯疱疹病毒性角膜炎(herpessimplexkeratitis,HSK)、HSV-I病毒性结 膜炎、HSV-I病毒性视网膜炎等疾病。其中，HSK是发病率第一位的病毒性角 膜炎，常会引起角膜溃疡，角膜穿孔，而致盲。正常成人HSV血清阳性率为 90%，即大部分人的三叉神经节内都有HSV潜伏，当人体免疫力下降时，潜伏 的HSV将引起复发性的HSV角膜炎。
目前，常用的HSV-I检测方法有：病毒培养法、ELISA法、PCR法、荧光 定量PCR法等。病毒培养法要求具备严格的实验室环境和设施，具有国家认可 的专业化病毒培养实验室才能开展，成本高；并且这种方法周期长，通常一 次培养需要1-3天，耗时费力，易贻误诊断治疗的最佳时机。ELISA法虽然操 作简单，较为便捷，但敏感性和特异性差，容易出现假阳性。PCR法或荧光定 量PCR法具有较好的敏感性、特异性，是目前所有HSV-I检测方法中最为精确 的方法，但这两种方法都需要昂贵的专业仪器设备和试剂，操作步骤复杂， 实验费时、费力，对人员技术要求高，不能方便的在临床开展。
可见，目前常用的几种HSV-I检测方法已经不能满足日常门诊的快速诊断 或基层医疗机构使用。而由于这些方法的局限，目前眼科临床的现状是大部 分患者没有经过准确的病原微生物检测，只凭医生的经验进行诊断治疗，导 致抗生素使用较混乱、增加了医疗成本和医疗风险。因此，急需开发一种敏 感性高、特异性强，操作简便快捷、检测准确，成本较低的检测单纯疱疹I型 病毒的方法。
环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是 2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。该方法主要是利 用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。 与常规基因检测手段（如PCR等）相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成， 仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人员也可准 确完成，适合基层医疗机构的应用。并且，LAMP还可以大大缩短操作时间， 减少了样品污染机会，适合应用于HSV-I病毒的快速诊断。
但是，由于LAMP的灵敏度和特异性极度依赖于引物的特性，然而良好的 LAMP引物不易获得，因此，目前还未见基于LAMP技术对HSV-I病毒样品直 接检测的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于扩增I型单纯性 疱疹病毒的LAMP引物组及试剂盒与应用，本发明提供的引物灵敏度和特异性 皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对HSV-I病毒快速准确的检测。
本发明提供了一种用于扩增HSV-I病毒的LAMP引物组，包括如SEQID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。
本发明提供的LAMP引物组针对HSV-I病毒的特异保守区域（靶基因）， 由6条引物组成，包括序列如SEQIDNO:1～2所示的内引物（FIP/BIP）、序 列如SEQIDNO:3～4所示的外引物（F3/B3）和序列如SEQIDNO:5～6所示 的环引物（LPF/LPB）。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的 Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因 的F3c区域互补。LPF/LPB分别为上下游环引物，与扩增过程中形成的茎环 结构结合的区域在F2和F1之间。这样的设计可以保证引物具有更高的特异 性，从而避免在检测过程中出现假阳性。
本发明提供的引物组可用于判断待测样品是否受到HSV-1病毒的污染。
本发明提供的引物组在制备检测眼部样品、皮肤、口腔黏膜、分泌物、 排泄物或餐具中HSV-I病毒的试剂中的应用。
作为优选，眼部样品为眼睑组织、角膜组织、泪液、房水或玻璃体。
本发明还提供了一种用于检测HSV-I病毒的试剂盒，包括本发明提供的 用于扩增HSV-I病毒的LAMP引物组。
作为优选，本发明提供的用于检测HSV-I病毒的试剂盒还包括：LAMP 反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。
优选的，LAMP反应液中包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。
更优选的，LAMP反应缓冲液中包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTP、Tris-HCl、 超纯水。
优选的，LAMP密封液为甘油。
优选的，LAMP显色液中包括SYBRgreenI或钙黄绿素。
本发明还提供了一种非诊断目的的HSV-I病毒检测方法，包括以下步骤：
步骤1：取待测样品与灭菌生理盐水混合，获得样品混悬液；取如权利要 求1的引物组与水混合，制得引物组工作液；
步骤2：取样品混悬液、引物组工作液与LAMP反应液、超纯水、LAMP 密封液混合，制得扩增反应液；
步骤3：取扩增反应液，65℃反应30min，显色，根据显色结果判断样品 是否含有HSV-1病毒。
作为优选，显色采用LAMP显色液，其中包含SYBRgreenI或钙黄绿素， 显色结果呈现绿色则待测样品中含有HSV-I病毒，不呈现绿色则待测样品中 不含有HSV-1病毒。
不呈现绿色的情况包括：显色结果为橙色、其它颜色或无色。
作为优选，待测样品为眼部组织、皮肤、分泌物、排泄物或餐具。
作为优选，扩增反应液中，引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、 超纯水和LAMP密封液的体积比为1:13.5:2:（7.5～8.5）:20。
作为优选，引物组工作液中，
如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为25～50μmol/L；
如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为25～50μmol/L；
如SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为15～30μmol/L；
如SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为15～30μmol/L；
如SEQIDNO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5～10μmol/L；
如SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5～10μmol/L。
优选的，引物组工作液中，
如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQIDNO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
作为优选，LAMP显色液与扩增反应液的体积比为1：45。
本发明提供了一种用于扩增HSV-I病毒的LAMP引物组，包括如SEQID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。本发明还提供了用于检测HSV-I病毒的 试剂盒，以及检测HSV-I病毒的方法。本发明基于LAMP技术，针对HSV-I 病毒的特异保守区域设计6条引物。因此，本发明提供的引物组敏感性高、 特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的单 纯性疱疹病毒。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，因此， 在LAMP扩增中，无需提取样品的DNA而直接进行扩增，进一步缩短了检 测的时间，且简化了操作。经试验证明，本发明提供的引物进行HSV-I病毒 检测，准确性可达100%。且利用临床常见病毒作为对照检测的过程中，无假 阳性现象产生。并且，本发明提供的引物在HSV-I病毒的检测中，灵敏度可 达101copies/μL，与目前灵敏性最高的实时荧光定量PCR技术的敏感性相当。 而由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可 完成对HSV-I病毒的快速准确检测，因此，适用于门诊和基层医生对HSV-I 病毒性角膜炎、HSV-I病毒性结膜炎、HSV-I病毒性视网膜炎等疾病的快速诊 断。
附图说明
图1示待测样品1～3和阴性对照1～3的扩增产物电泳结果，其中，泳道 1～3示阴性对照1～3的扩增产物电泳结果，泳道4～6示待测样品1～3的电泳 结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于扩增I型单纯性疱疹病毒的LAMP引物组及试剂 盒与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特 别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见 的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所 述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所用试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中：LAMP反应液、LAMP密封液、LAMP显色液购自广州迪澳生物 科技有限公司。
荧光PCR法HSV-1核酸检测试剂盒购自泰普生物科学有限公司。
其它溶剂和试剂皆为普通市售品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明提供的LAMP引物组的准确性
利用本发明提供的LAMP引物组检测HSV-I病毒，实验设待测样品组合 阴性对照。LAMP引物组包含如SEQIDNO:1～6所示序列的引物。实验分组 如表1所示：
表1实验分组与所用样品
待测样品1 病变角膜处组织 阴性对照1 正常角膜组织 待测样品2 病变玻璃体腔液 阴性对照2 正常玻璃体腔液 待测样品3 HSV感染者唾液 阴性对照3 正常人唾液
各组实验设10次重复。
LAMP实验操作具体为：
1、临床样本的处理：用棉拭子取病变处角膜组织和正常角膜组织，分别 加入500μL灭菌生理盐水后充分震荡，尽可能将细胞洗脱，充分混匀后，取 上部混悬液直接可用于LAMP反应。即为样品混悬液。
2、工作液的配制：
引物组工作液中包括：
如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQIDNO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
选择购自广州迪澳生物科技有限公司的LAMP反应液、LAMP密封液、 LAMP显色液，分别配制待测样品和阴性对照的配制LAMP扩增体系：
在小PCR管内分别加入下列组分：
将1μL显色剂滴在PCR管盖中间，盖紧管盖。
3、将装有待测样品和阴性对照LAMP扩增体系的PCR管放入65℃的水 浴锅内，反应30分钟
4、颠倒PCR管数次，使反应液与显色液充分混匀，观察反应液颜色，若 呈现绿色则为阳性，呈现橙色或其他颜色则为阴性。
实验结果表明，待测样品1～3的PCR管中皆呈现绿色，而阴性对照1～3 的PCR管中皆呈现橙色。说明本发明提供的引物能够准确的分辨组织中是否 含有HSV-I病毒。为了进一步验证本实施例的实验结果，在各PCR管中分别 取5μL扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳，90V电压下电泳45min。待测样品1～3 和阴性对照1～3的扩增产物电泳结果如图1所示。如图，呈现绿色的待测样 品1～3的扩增产物电泳后可见梯状扩增条带，符合预期。可见，本实施例通 过6组实验，各组10次重复。60次实验结果完全符合预期，电泳结果也证明 显色结果与扩增结果完全一致。充分证明本发明提供的引物在对HSV-I病毒 检测的过程中，准确性可达100%。
实施例2：本发明提供的LAMP引物组的敏感性
取浓度为104copies/μL的HSV-I病毒DNA，10倍梯度稀释样品使其滴度 分别为104copies/μL，103copies/μL，102copies/μL，101copies/μL，100copies/μL， 利用上述稀释后的样品检测本发明提供的LAMP引物组的敏感性。
实验以购自泰普生物科学有限公司的荧光PCR法HSV-1核酸检测试剂盒 为对照。各浓度病毒的检测设3次重复。
LAMP的实验操作参照本发明实施例1。
LAMP扩增体系为：
在小PCR管内分别加入下列组分：
荧光PCR法检测HSV-I操作参照试剂盒中提供的说明书，Ct值≤36且 具有较好的对数增长曲线判定为检出，Ct值＞36或扩增曲线不佳判定为未检 出。
实验结果如表2所示：
表2敏感性检测结果
结果表明，本发明提供的LAMP引物组在对HSV-I病毒的检测中，可准 确检出的最小浓度为101copies/μL，该结果与目前公认最为敏感的荧光定量检 测法所得结果一致。
实施例3：本发明提供的LAMP引物组的特异性
分别利用临床常见的含有其他病毒样品：腺病毒、带状疱疹病毒、巨细胞 病毒、HSV-2，金黄色葡萄球菌、真菌中的镰刀菌和棘阿米巴原虫作为阴性对 照，以生理盐水为空白对照，以HSV-I为实验对象，对本发明提供的引物进 行了特异性检测。LAMP实验方法参照本发明实施例1。各组设3次重复。检 测结果如表3所示：
表3LAMP引物组的特异性检测结果
重复1 重复2 重复3 腺病毒 橙色 橙色 橙色 带状疱疹病毒 橙色 橙色 橙色 巨细胞病毒 橙色 橙色 橙色 HSV-2 橙色 橙色 橙色 金黄色葡萄球菌 橙色 橙色 橙色 镰刀菌 橙色 橙色 橙色 棘阿米巴原虫 橙色 橙色 橙色 生理盐水 橙色 橙色 橙色 HSV-I 绿 绿 绿
结果显示，本发明提供的引物组只能特异扩增HSV-1，对其他病原微生物 未产生扩增，也未产生颜色反应。可见本发明提供的LAMP引物具有良好的 特异性，在检测过程中不会出现假阳性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。