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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610415340.X (22)申请日 2016.06.14 (71)申请人 中国科学院南海海洋研究所 地址 510301 广东省广州市新港西路164号 (72)发明人 任春华江晓陈廷黄文 胡超群 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST- SSR标记及其特异性引物和检测方法 。
2、(57)摘要 本发明公开了一种凡纳滨对虾渗透压调节 相关功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检 测方法。 以凡纳滨对虾基因组DNA为模板， 使用本 发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因 EST-SSR标记的特异性引物对微卫星位点序列进 行PCR扩增， 然后利用测序仪对PCR扩增产物进行 分型。 本发明提供的凡纳滨对虾渗透压调节相关 功能基因EST-SSR标记的特异性引物及检测方 法， 可用于凡纳滨对虾种群遗传结构分析和分子 标记辅助育种， 特别是在凡纳滨对虾盐度抗逆优 良品种的选育中具有重要的应用价值。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图5页 CN 105969873 A 2。
3、016.09.28 CN 105969873 A 1.一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记， 其特征在于， 所述的EST- SSR 标记包括Lv-Os001、 Lv-Os005、 Lv-Os006、 Lv-Os007和Lv-Os011； 所述的Lv-Os001的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示； 所述的Lv-Os005的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示； 所述的Lv-Os006的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示； 所述的Lv-Os007的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示； 所述的Lv-Os011的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。 2.一种权利要求1所述的凡纳滨对虾。
4、渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性 引物， 其特征在于， 所述的EST-SSR标记的特异性引物包括： 微卫星位点Lv-Os001特异性引物： F： 5 -TTGCACAATATGTTTGAAGGTGT-3 ， R： 5 - AGCATGACATAGTCTCTGAAGCA-3 ； 微卫星位点Lv-Os005特异性引物： F： 5 -AAAATCCCAAGTAACTGACAAAAA-3 ， R： 5 - AGGAAAGTTAACTGCAGGTTTGG-3 ； 微卫星位点Lv-Os006特异性引物： F： 5 -CGAAAATGGGTAGTGTTTTCATC-3 ， R： 5 - GG。
5、CCGATGGACTCCTATAAGTA-3 ； 微卫星位点Lv-Os007特异性引物： F： 5 -TCTCCAGCCGTGAAGAAAGG-3 ， R： 5 - TTCACAGATGGAAGGGGAGG-3 ； 微卫星位点Lv-Os0011特异性引物： F： 5 -GTTTCCAGCAGCAGTATCAAGC-3 ， R： 5 - TGCTCGCTTGCTTTCTTGCT-3 。 3.一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的检测方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)、 提取凡纳滨对虾基因组DNA； (2)、 以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 利用权利要求2所述。
6、的凡纳滨对虾渗透压调 节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物中的每个EST-SSR标记的特异性引物分别进行 PCR扩增； (3)、 利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 所述的步骤(2)中的PCR扩增， 其反应 体系为： 10PCRbuffer2.5 L， 25mMMgCl22.0 L， 10mMdNTPs0.5 L， 5U/ LTaqDNA聚 合酶0.2 L， 10 M正向引物0.5 L， 10 M反向引物0.5 L， 25ng/ LDNA模板0.5 L， ddH2O18.3 L， 共计25 L。 5.根据权利要求3或4所述的检测方法，。
7、 其特征在于， 所述的步骤(2)中的PCR扩增， 其扩 增反应程序为： 95预变性3分钟； 95变性30秒， 按权利要求2所述的凡纳滨对虾渗透压调 节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物的退火温度退火30秒， 72延伸30秒， 35个循 环； 72延伸6分钟； 所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引 物的退火温度分别为： 微卫星位点Lv-Os001： 55， 微卫星位点Lv-Os005： 55， 微卫星位点 Lv-Os006： 55， 微卫星位点Lv-Os007： 60， 微卫星位点Lv-Os011： 60。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10596987。
8、3 A 2 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记及其特异 性引物和检测方法 技术领域： 0001 本发明属于分子标记技术领域， 具体涉及凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因 EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法。 背景技术： 0002 凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)俗称南美白对虾， 原产于南美洲， 从墨西哥 西南沿海至秘鲁西部的太平洋沿岸均有分布， 是全世界产量最大的养殖对虾。 在我国， 凡纳 滨对虾养殖区域遍布于全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区， 是我国水产养殖的支 柱性产业。 我国引进和繁育的凡纳滨对虾均是人工繁育群体， 易产生遗传衰退。 因此，。
9、 良种 选育是关系到我国凡纳滨对虾养殖成败和产业可持续发展的重大问题。 0003 在国际上， 以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术已成为当代水产育种的关 键技术。 在众多分子标记中， 简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)又称微卫星 (microsatellite)， 为共显性标记， 具有多态性丰富、 重复性好、 遗传稳定和可检测杂合子 等优点， 弥补了扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP) 和随机扩增多态性(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)等技术的不足， 是目前。
10、在 水产养殖动物种群遗传结构研究和遗传育种领域应用较广泛的分子标记技术。 0004 随着功能基因组学的发展， 表达序列标签(expressedsequencetags,ESTs)成为 开发SSR标记的重要资源。 EST-SSR作为一种新型分子标记， 除具有传统SSR标记的优点外， 因其反映的是转录区的差异， 其多态性可能与基因功能直接相关。 因此， 与传统的SSR标记 相比， EST-SSR标记在分子标记辅助选择育种领域具有更高的应用价值。 然而， 迄今为止， 凡 纳滨对虾EST-SSR标记的开发较少， 尚无与特定功能基因相关联的EST-SSR标记的开发。 发明内容： 0005 本发明的第一个。
11、目的是提供一种在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中具有重要应 用价值的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记。 0006 本发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记， 其特征在于， 所述的 EST-SSR标记包括Lv-Os001、 Lv-Os005、 Lv-Os006、 Lv-Os007和Lv-Os011； 0007 所述的Lv-Os001的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示； 0008 所述的Lv-Os005的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示； 0009 所述的Lv-Os006的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示； 0010 所述的Lv-Os007的核苷酸序列如SEQ。
12、IDNO.4所示； 0011 所述的Lv-Os011的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。 0012 本发明的第二个目的是提供上述凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标 记的特异性引物， 所述的EST-SSR标记的特异性引物包括： 微卫星位点Lv-Os001特异性引 物： F： 5 -TTGCACAATATGTTTGAAGGTGT-3 ， R： 5 -AGCATGACATAGTCTCTGAAGCA-3 ； 微卫星位点 说明书 1/5 页 3 CN 105969873 A 3 L v-O s 0 0 5特 异性 引物 ： F ： 5 - A A AATC C C A AG T A AC。
13、 TG AC AA A A A- 3 ， R ： 5 - AGGAAAGTTAACTGCAGGTTTGG-3 ； 微卫星位点Lv-Os006特异性引物 ： F ： 5 - CGAAAATGGGTAGTGTTTTCATC-3 ， R： 5 -GGCCGATGGACTCCTATAAGTA-3 ； 微卫星位点Lv-Os007 特异性引物： F： 5 -TCTCCAGCCGTGAAGAAAGG-3 ， R： 5 -TTCACAGATGGAAGGGGAGG-3 ； 微卫星位 点Lv-Os0011特异性 引物 ： F ： 5 -GTTTCCAGCAGCAGTATCAAGC-3 ， R ： 5 - TGCT。
14、CGCTTGCTTTCTTGCT-3 。 0013 本发明的第三个目的是提供一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标 记的检测方法， 包括以下步骤： 0014 (1)、 提取凡纳滨对虾基因组DNA； 0015 (2)、 以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 利用上述的凡纳滨对虾渗透压调节相关 功能基因EST-SSR标记的特异性引物中的每个EST-SSR标记的特异性引物分别进行PCR扩 增； 0016 (3)、 利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。 0017 所述的步骤(2)中的PCR扩增， 其反应体系为： 10PCRbuffer2.5 L(without Mg2+)， 25mMM。
15、gCl22.0 L， 10mMdNTPs0.5 L， 5U/ LTaqDNA聚合酶0.2 L， 10 M正向引物 0.5 L， 10 M反向引物0.5 L， 25ng/ LDNA模板0.5 L， ddH2O18.3 L， 共计25 L。 0018 所述的步骤(2)中的PCR扩增， 其扩增反应程序为： 95预变性3分钟； 95变性30 秒， 按上述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物的退火温度 退火30秒， 72延伸30秒， 35个循环； 72延伸6分钟； 所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功 能基因EST-SSR标记的特异性引物的退火温度分别为： 微卫星位点Lv-Os0。
16、01： 55， 微卫星 位点Lv-Os005： 55， 微卫星位点Lv-Os006： 55， 微卫星位点Lv-Os007： 60， 微卫星位点 Lv-Os011： 60。 0019 为实现上述发明目的， 本发明利用通过转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列， 开 发凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记， 并提供多态性引物， 建立凡纳滨对虾 功能基因EST-SSR标记开发的技术体系， 不仅将为凡纳滨对虾遗传多样性研究、 遗传图谱构 建和进化分析奠定基础， 还将为凡纳滨对虾优良品种的选育提供有价值的分子标记。 0020 本发明通过从转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列中通过BLAST比。
17、对筛选渗透 压调节相关功能基因EST序列， 并通过MISA软件进行微卫星位点查找， 获得了11个含有微卫 星位点的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因的EST序列。 采用PrimerPremier5软件， 针 对筛选出的11个EST序列的12个SSR位点设计了12对引物， 并利用这12对引物对凡纳滨对虾 的基因组DNA进行PCR扩增， 其中有9对引物稳定扩增出目的条带。 利用3730XL测序仪对PCR 扩增产物进行分型， 并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值， 最终确定 了5个具有高度多态性的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记， 微卫星位点 为： Lv-O。
18、s001、 Lv-Os005、 Lv-Os006、 Lv-Os007和Lv-Os011； 其核苷酸序列分别如SEQID NO.15所示。 0021 利用本发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物对 24个凡纳滨对虾样本进行检测， 结果表明： 5个EST-SSR标记均具有高度多态性。 说明本发明 的5个凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记可用于凡纳滨对虾种群遗传结构 分析和分子标记辅助育种， 特别是在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具有重要的应 说明书 2/5 页 4 CN 105969873 A 4 用价值。 附图说明： 0022 图1是Lv-Os0。
19、01位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图， 其中S1-24 代表24个样品； 0023 图2是Lv-Os005位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图， 其中S1-24 代表24个样品； 0024 图3是Lv-Os006位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图， 其中S1-24 代表24个样品； 0025 图4是Lv-Os007位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图， 其中S1-24 代表24个样品； 0026 图5是Lv-Os011位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图， 其中S1-24 代表24个样品。 具体实施。
20、方式： 0027 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0028 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法或者按照试剂盒说明书 进行。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 转录组测序 由华大基因有限公司完成， 其他测序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。 0029 实施例1 0030 1、 凡纳滨对虾转录组测序及序列比对 0031 1.1转录组测序 0032 分别取凡纳滨对虾肌肉、 肝胰腺、 鳃和肠组织， 用RNAisoPlus(TaKaRa,Japan)提 取总RNA， 并用DNaseI(TaKaRa)处理。 采。
21、用NanoDropTM2000分光光度计(ThermoScientific Waltham,MA,USA)测定RNA浓度， 并用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies, CA,USA)评价RNA的质量。 将从4种不同组织样品中提取的RNA等量混合后， 经mRNA富集、 mRNA 片段化、 cDNA合成、 末端修复、 加 “A” 尾和测序接头连接等工序建立cDNA文库。 采用IIIumina HiSeq2000高通量测序平台对cDNA文库进行测序， 采用seqClean和Lucy软件去掉接头序列 及低质量序列， 获得高质量的序列数据， 并用Trini。
22、ty法进行序列组装。 0033 1.2EST序列比对 0034 通过NCBI(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对EST序列进行比对， 确 定每个EST序列隶属的基因名称。 0035 2、 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST的筛选及微卫星位点查找 0036 根据文献报道的渗透压调节相关功能基因信息， 从转录组文库中筛选出渗透压调 节相关功能基因的EST序列。 采用MISA软件(http:/pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)， 按 照两核苷酸重复n5， 三核苷酸重复n4和四核苷酸重复n3的标准对筛选出的渗透压调 节相关功能。
23、基因的EST序列进行微卫星位点查找， 获得11个含有微卫星位点的渗透压调节 相关功能基因EST序列。 0037 3、 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物的设计 说明书 3/5 页 5 CN 105969873 A 5 0038 采用PrimerPremier5软件， 针对筛选出的11个凡纳滨对虾渗透压调节相关功能 基因EST序列的12个SSR位点进行SSR引物设计。 引物设计的要求为： 引物长度18-24bp， GC含 量为40-60， Tm值为50-62， 上下游引物的Tm值之差不大于5， 并尽量避免引物二聚体、 发 夹结构及错配等； 扩增产物长度为100-550bp。 。
24、共设计和合成12对EST-SSR引物， 引物序列见 表1。 0039 表1.凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物特性表 0040 0041 0042 4、 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物的筛选及结果分析 0043 4.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取 0044 选取来自于广东深圳、 珠海、 湛江、 徐闻和茂名等地24个养殖场的凡纳滨对虾24 尾， 分别取肌肉组织， 采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司， 北 京)提取凡纳滨对虾基因组DNA， 操作步骤严格按照说明书进行。 基因组DNA定量采用 NanoDropTM2000分光光度计。
25、完成， 质量采用琼脂糖电泳来检测。 0045 4.2引物的初步筛选 0046 从上述提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机抽取一份做模板， 分别采用表1中的12 对引物对该基因组DNA模板进行PCR梯度扩增， 其反应体系为： 10PCRbuffer(without Mg2+)2.5 L， 25mMMgCl22.0 L， 10mMdNTPs0.5 L， 5U/ LTaqDNA聚合酶0.2 L， 10 M正向 说明书 4/5 页 6 CN 105969873 A 6 引物0.5 L、 10 M反向引物0.5 L， 25ng/ LDNA模板0.5 L， ddH2O18.3 L， 共计25 L。 反应程 。
26、序为： 95预变性3分钟； 95变性30秒， 退火(退火温度从48到62)30秒， 72延伸30 秒， 共35个循环； 72再延伸6分钟。 PCR扩增产物经2琼脂糖电泳检测， 显示有9对引物在 特定退火温度下能稳定扩增出单一条带。 分别对扩增产物进行测序， 结果显示该9对引物均 可扩增出目的条带， 微卫星位点分别为： Lv-Os001(如SEQIDNO.1所示)、 Lv-Os002、 Lv- Os004、 Lv-Os005(如SEQIDNO.2所示)、 Lv-Os006(如SEQIDNO.3所示)、 Lv-Os007(如SEQ IDNO.4所示)、 Lv-Os009、 Lv-Os011(如SE。
27、QIDNO.5所示)和Lv-Os012。 0047 4.3多态性引物的筛选及结果分析 0048 对上述初步筛选出的9对引物的上游引物的5 端分别用FAM、 HEX或TAMRA进行荧光 标记， 以上述提取的24个凡纳滨对虾基因组DNA为模板进行PCR扩增。 反应体系与上述步骤 4.2引物的初步筛选中的反应体系相同， 反应程序除退火温度外均与上述步骤4.2引物的初 步筛选中的反应程序一致， 各引物对应的退火温度详见表1。 PCR扩增产物先用2琼脂糖电 泳进行检测， 后采用3730XL测序仪进行分型， 并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段 的具体数值， 确定了5个具有多态性的凡纳滨对。
28、虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记 (见图1-5)， 微卫星位点分别为： Lv-Os001、 Lv-Os005、 Lv-Os006、 Lv-Os007和Lv-Os011， 其核 苷酸序列分别如SEQIDNO.1、 2、 3、 4和5所示。 0049 使用Popgene32软件计算期望杂合度和观察杂合度， 使用PICCalc0.6软件计算 多态性信息含量(polymorphicinformationcontent,PIC)。 结果表明： 上述5个多态性凡 纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的等位基因数分别为9、 5、 5、 5和8个； 观测 杂合度分别为0.1667、 0.。
29、6667、 0.6250、 0.4167和0.9167； 期望杂合度分别为0.8901、 0.7571、 0.7828、 0.7172和0.7713； PIC值分别为0.8578、 0.6977、 0.7285、 0.6610和0.7190 (表2)， 均大于0.5， 说明这5个EST-SSR标记均具有高度多态性， 可用于凡纳滨对虾种群遗传 结构分析和分子标记辅助育种。 由于凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因大多数与凡纳滨 对虾盐度抗逆相关， 因此， 这5个EST-SSR标记在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具 有重要的应用价值。 0050 表2.凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR。
30、标记特性表 0051 说明书 5/5 页 7 CN 105969873 A 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 105969873 A 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 105969873 A 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 105969873 A 10 图1 说明书附图 1/5 页 11 CN 105969873 A 11 图2 说明书附图 2/5 页 12 CN 105969873 A 12 图3 说明书附图 3/5 页 13 CN 105969873 A 13 图4 说明书附图 4/5 页 14 CN 105969873 A 14 图5 说明书附图 5/5 页 15 CN 105969873 A 15 。