技术领域
本发明属于无颌类脊椎动物免疫技术领域。更具体地，涉及一种新型VLR特异性抗体血清及其制备方法和应用。
背景技术
抗血清即含有抗体的血清制剂，亦称免疫血清。抗血清之所以能和有关抗原起免疫结合反应，是因为在抗血清中含有相关的抗体蛋白质。20世纪60年代初人们将具有抗体活性的动物蛋白定义为免疫球蛋白（immunoglobulin）。目前人们对于抗体药物的开发多限制于IgG分子，供免疫用的动物主要是哺乳动物，抗血清、抗体的制备方法也主要针对于此，目前还未见有无颌类脊椎动物免疫过程的研究和报道。
七鳃鳗（Lampetrajaponicum），作为最古老的无颌类脊椎动物，是有颌类脊椎动物的祖先。不同于以Ig类分子为基础的有颌类脊椎动物的适应性免疫系统，七鳃鳗体内存在一种新型的适应性免疫受体——可变淋巴细胞受体（variable lymphocyte receptors，VLRs），在抗体的制备及免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。VLR作为一种新型的分子，目前其应用开发的领域一片空白，国际市场上也未见有针对七鳃鳗VLR酶标二抗的相关研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中VLR相关研究和应用技术的缺陷和不足，为了最有效获得含有新型VLR抗体的特异性抗血清，建立了一种无颌类脊椎动物的最佳免疫方案，并首次提供了新型VLR特异性抗体血清及其高效的杀菌能力，及针对革兰氏阴性菌的VLR抗体血清的最佳工作条件。
本发明的目的是提供一种新型VLR特异性抗体血清及其制备方法。
本发明另一目的是提供上述新型VLR特异性抗体血清的应用，即公开所述新型VLR特异性抗体血清对革兰氏阴性菌的强大杀伤能力。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种新型VLR特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：
S1.获取免疫用人工抗原，用抗原稀释液制备0.8～2μg/μl抗原溶液；
S2.首次免疫：用为90～110μg /条的抗原剂量免疫日本七鳃鳗；
S3.加强免疫：首次免疫9～11天后，按照40～60μg /条的抗原剂量，每隔9～11天腹腔注射进行加强免疫，共加强免疫2～3次；
S4.制备抗血清：末次免疫后4～6天，剪尾鳍采血，新鲜血液0～8℃静置30～60min，5000～8000rpm 4℃离心8～15min，收集得到血清；得到的血清需要于-20℃保存；
其中，步骤S1所述人工抗原为革兰氏阴性菌或脂多糖LPS。当抗原为革兰氏阴性菌时，使用的抗原均不包含佐剂，使用前60℃灭活30min。
优选地，步骤S1中是用抗原稀释液制备1μg/μl抗原溶液。
更优选地，所述抗原稀释液为0.9% NaCl溶液（质量体积比）。
优选地，步骤S2所述免疫的方式为腹腔注射。
优选地，步骤S2所述抗原剂量为100μg /条。
优选地，步骤S3所述抗原剂量为50μg /条。
优选地，步骤S3所述首次免疫10天后进行加强免疫。
优选地，步骤S3所述腹腔注射的间隔时间为每隔10天进行腹腔注射。
优选地，步骤S3所述加强免疫共2次。
优选地，步骤S4所述末次免疫后5天，剪尾鳍采血。
优选地，步骤S4所述静置的条件为4℃静置30～60min。
更优选地，步骤S4所述静置的条件为4℃静置40～50min。
优选地，步骤S4所述离心的条件为7000rpm 4℃离心10min。
即本发明的最佳方案是：用革兰氏阴性菌表面特异性抗原（LPS）免疫七鳃鳗，免疫周期为10天，免疫次数为3次，首次免疫注射抗原剂量为100μg/条，两次加强免疫注射抗原剂量为50μg/条，末次免疫5天后剪尾鳍采血，4℃静置30~60min ，7000rpm 4℃离心10min，收集得到血清。
由上述制备方法制备得到的新型VLR特异性抗体血清，也在本发明的保护范围之内。
上述新型VLR特异性抗体血清在抗革兰氏阴性菌方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。优选地，所述革兰氏阴性菌为制备VLR特异性抗体血清所用免疫抗原的来源菌种。
上述应用的方法及条件（即新型VLR特异性抗体血清的工作条件）为：将血清在0～8℃以10～30%的终浓度和菌体旋转孵育10～30min。
优选地，上述应用的方法及条件（即新型VLR特异性抗体血清的最佳工作条件）为：是将血清在4℃以20%的终浓度和菌体旋转孵育20min。
所述旋转孵育后，可通过计算菌落单位检测抗体血清的杀菌能力。
特异性VLR抗体血清杀伤抗原的检测方法：用制得的特异性VLR抗体血清杀伤抗原菌，以最终抗原菌的菌落形成单位（CFU）计算杀伤率；kill rate（%）=（总抗原-存活抗原）/总抗原×100%。特异性VLR抗体血清对其抗原的杀伤率作为衡量抗血清效价的主要参考指标。
本发明公开新型VLR特异性抗体血清在杀伤革兰氏阴性菌方面的应用；并与正常革兰氏阴性菌作为免疫抗原制备的VLR特异性抗体血清比较，比较各自对革兰氏阴性菌的杀伤力；同时与传统免疫BABL/C小鼠制得的革兰氏阴性菌特异性抗血清比较，比较各自对抗原的杀伤力。结果显示，本发明利用LPS作为抗原制备的新型VLR特异性抗体血清比传统的特异性抗血清相比有更强大的抗原杀伤能力；而且比使用革兰氏阴性菌作为免疫抗原所制备抗血清的抗原杀伤能力更强。
VLR作为一种新型的适应性免疫受体分子，相比较于Ig类分子，VLR具备更多的优势：（1）同样浓度下VLR对特异性抗原的亲和力比抗体Ig G高1000倍；（2）VLR比抗体分子更加稳定，可室温放置一个月，56℃放置36小时仍保持活性；（3）VLR在极端条件下仍能保持其结构及与抗原的亲和力；（4）七鳃鳗与其他哺乳动物亲缘关系较远， VLR能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生Ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。
鉴于此，本发明以七鳃鳗为研究对象，本着细菌抗原应用普遍的原则，针对一定量的七鳃鳗进行免疫，制备七鳃鳗针对革兰氏阴性菌的特异性抗血清，探索七鳃鳗免疫过程中机体的反应变化，确定了制备七鳃鳗高效特异性VLR抗体血清的最佳免疫方法，为今后分析七鳃鳗VLR的抗病保护作用，制备抗体做铺垫，同时为今后研发新型的基因工程抗体提供了新的方向。同时，本发明通过检测七鳃鳗特异性抗血清的杀菌能力，作为测定七鳃鳗特异性抗血清效价的标准。与哺乳动物特异性抗血清相比，由于VLR本身具有高度的抗原识别及结合能力，制备的七鳃鳗特异性抗血清具有更强大的抗原杀伤能力。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新型VLR特异性抗体血清的制备方法，利用LPS作为抗原，并探索出了最佳的免疫方案，所获得的新型VLR特异性抗体血清比传统的Ig特异性抗血清相比有更强大的抗原杀伤能力；而且，进一步地，本发明的新型VLR特异性抗体血清比使用革兰氏阴性菌作为免疫抗原所制备抗血清的抗原杀伤能力更强。
本发明的新型VLR抗体血清的制备方法简单高效；检测革兰氏阴性菌特异性VLR抗体血清的方法可靠。
附图说明
图1为七鳃鳗免疫流程示意图。
图2为各组随免疫次数增加血清活性的检测结果。
图3 为LPS及革兰氏阴性菌（大肠杆菌）分别作为免疫抗原制得VLR特异性抗体血清杀伤能力比较。
图4为新型VLR特异性抗体血清与传统革兰氏阴性菌（大肠杆菌）特异性Ig抗血清杀菌能力比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 新型特异性VLR抗体血清的制备
新型特异性VLR抗体血清的制备流程示意图如附图1所示。
1、制备免疫用LPS抗原溶液：LPS购自sigma（ L2880），用0.9%的NaCl配置成浓度为1μg/μl的抗原溶液备用。
2、动物免疫
（1）实验动物选用日本七鳃鳗；
（2）取状态良好七鳃鳗，分为实验组、对照组，每组随机分配10条鱼；
（3）首次免疫剂量为100μg /条，腹腔45°注射抗原；以后每隔10天腹腔注射进行加强免疫2次，2次加强免疫的剂量为50μg /条；
（4）对照组为注射相同体积量0.9% NaCl，每10天一个免疫周期，共计免疫4次。
3、日本七鳃鳗特异性抗血清的制备
最后一次免疫5天后，在七鳃鳗泄殖腔下方剪尾采血，将收集的血液放置4℃静置30~60min，7000rpm离心10min，用移液枪轻轻吸取上层血清，血清即用或存放于-20℃备用。
4、新型特异性VLR抗体血清的活性检测，包括如下步骤：
（1）制备特异性VLR抗体血清；
（2）准备杀伤用革兰氏阴性菌抗原；
（3）利用特异性抗血清杀伤抗原的特性，确定特异性VLR抗体血清最佳工作条件：血清终浓度20%， 4℃旋转孵育20 min；
（4）以最终抗原菌的菌落形成单位（CFU）作为计数指标，计算杀伤率，杀伤率（%）=（总抗原-存活抗原）/总抗原×100%；
将空白对照组的CFU记为总抗原数，依据各实验组CFU数计算各组血清相应的杀菌率；特异性VLR抗体血清对其抗原的杀伤率作为衡量抗血清效价的主要参考指标。
实施例2 免疫次数优化
1、日本七鳃鳗免疫方案如表1所示。
表1 日本七鳃鳗免疫方案
2、每次免疫5天后，制备七鳃鳗血清，测试血清活性，操作如下：
将七鳃鳗抗血清与定量大肠杆菌混合，血清终浓度20%，4℃旋转孵育20 min， 0.9%NaCl清洗三次，重悬菌体，并均匀涂布到无抗性的LB培养板，倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
统计血清处理大肠杆菌菌落数，与等量未处理大肠杆菌涂板菌落数，计算血清杀菌率。
2、最佳免疫次数确定
如图2可知，实验组免疫第二、三次后，血清杀菌力迅速提高；四次免疫后，与三次免疫相比，上升幅度不大，因此免疫次数为3次，即可获得较佳免疫效果，即获得最有效免疫抗血清。
实施例3菌体抗原和LPS抗原免疫所得抗体的比较
比较针对大肠杆菌的东北七鳃鳗抗血清与BABL/C鼠抗血清的杀菌能力：
1、分别利用革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和LPS作为抗原制备抗血清。
2、比较两种抗血清对抗原的杀伤率
1）将抗血清与定量大肠细菌混合，血清终浓度20%，4℃旋转孵育20 min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
2）空白对照组处理方法：取等量大肠杆菌与等体积0.9% NaCl 4℃旋转孵育20min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37°C 培养箱中，培养12~14h。
3）阴性对照组处理方法：将0.9% NaCl免疫的抗血清与定量大肠细菌混合，血清终浓度20%，4℃旋转孵育20min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
4、将菌落形成单位（CFU）作为计数指标，将空白对照组的CFU记为100%，依据各实验组CFU数计算各组血清相应的杀菌率。
5、结果如附图3所示，以LPS为抗原免疫所得抗体血清有更高的杀伤力。
实施例4 革兰氏阴性菌（大肠杆菌）特异性VLR抗血清与传统革兰氏阴性菌（大肠杆菌）特异性Ig抗血清杀菌能力比较
1、制备革兰氏阴性菌（大肠杆菌）特异性VLR抗血清
参照上文所述最佳免疫程序制备。
2、制备革兰氏阴性菌（大肠杆菌）特异性BABL/C鼠抗血清
按照标准BABL/C鼠免疫方案制备。
3、比较两种动物针对大肠杆菌的特异性抗血清对抗原的杀伤率
1）将免疫七鳃鳗VLR抗血清与定量大肠细菌混合，血清终浓度20%，4℃旋转孵育20min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
2）将免疫BABL/C鼠抗血清与定量大肠细菌混合，血清终浓度20%，37℃旋转孵育20min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
3）空白对照组处理方法：取等量大肠杆菌与等体积0.9% NaCl 4℃旋转孵育20min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
4）阴性对照组处理方法：将0.9% NaCl免疫的抗血清与定量大肠细菌混合，血清终浓度20%，4℃（七鳃鳗阴性血清）/37℃（BABL/C鼠阴性血清）旋转孵育20 min，将上述混合物均匀涂布到无抗性的LB固体培养平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养12~14h。
4、将菌落形成单位(CFU) 作为计数指标，将空白对照组的CFU记为100%，依据各实验组CFU数计算各组血清相应的杀菌率。
5、结果如附图4所示，与传统方法制备的抗体相比，本发明制备的特异性VLR抗血清对抗原具有更强大的杀伤能力。
实施例5 免疫间隔时间对抗血清的影响
1、按照上文所述最佳的新型VLR特异性抗体血清的制备方法，唯一不同之处在于：每次免疫间隔时间不同，制备得到多个抗体血清，对所得抗体血清的杀菌能力进行比较。
2、结果如表2所示，每次免疫间隔时间为10天时，制备所得VLR特异性抗体血清的杀菌能力最强。
表2 不同免疫间隔时间所制备得到抗血清对大肠杆菌的杀伤能力
实施例6 末次免疫后时间的长短对抗血清的影响
1、按照上文所述最佳的新型VLR特异性抗体血清的制备方法，唯一不同之处在于：于末次免疫后不同的时间进行剪尾采血，制备得到多个抗体血清，对所得抗体血清的杀菌能力进行比较。
2、结果如表3所示，末次免疫后5天进行剪尾采血，制备所得VLR特异性抗体血清的杀菌能力最强。
表3 末次免疫后不同时间剪尾采血所得抗体血清的对大肠杆菌的杀伤能力
实施例7 免疫剂量对抗血清的影响
1、按照上文所述最佳的新型VLR特异性抗体血清的制备方法，唯一不同之处在于：每次免疫的抗原剂量不同，制备得到多个抗体血清，对所得抗体血清的杀菌能力进行比较。
2、结果如表4所示，末次免疫后5天进行剪尾采血，制备所得VLR特异性抗体血清的杀菌能力最强。
表4 不同抗原免疫剂量所制备得到抗血清对大肠杆菌的杀伤能力