离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基.pdf

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基。本发明的步骤如下：A.取除虫菊的种子，经灭菌和无菌离体培养得到无菌苗，选4个不同单株的无菌苗在MS基本培养基中继代培养；B.无菌苗继代培养了30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L IBA和2.0mg/L AgNO3的专用培养基上，先暗培养再光照培养，大约30天左右获得再生芽；C.将再生芽转移至MS基本培养基中作继代培养得到完整植株。本发明取材不受季节限制，方法简便，再生周期短，除虫菊的植株再生频率为92％-96％。

1、  离体培养除虫菊再生植株的方法，其步骤包括：
A、以除虫菊种子为离体培养的材料，先用70％酒精对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗2-3遍，再用0.1％升汞继续对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗3-4遍后，将灭过菌的除虫菊的种子置于无菌滤纸上使之萌发培育成无菌苗；选取4个来自不同种子培育的除虫菊无菌苗接种于MS基本培养基为成分的继代培养基上进行继代培养；
B、在无菌条件下，以A步骤的除虫菊无菌苗为材料，继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉划两刀后，近轴面朝上接种于MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.2mg/L+AgNO₃ 2.0mg/L的专用培养基上，先暗培养7天后再转入光照条件下培养15-30d，得到再生芽；
C、将步骤B的再生芽切下接种于MS基本培养基中继代培养，直至得到完整的再生植株；
上述A、B、C各步骤所述的培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d，光强为1200lux的条件下培养。

2、  一种离体培养除虫菊再生植株的专用培养基，按mg/L计的组分及配比如下：
MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.2mg/L+AgNO₃ 2.0mg/L，附加琼脂0.7％，蔗糖3％，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8。

3、  权利要求2所述的专用培养基在离体培养除虫菊再生植株上的应用。

离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基。
背景技术
除虫菊为菊科多年生宿根草本植物。全株呈灰白淡绿色，叶羽状全裂，花茎多数，顶生头状花序，夏秋时节开花。花白色，全花有特异芳香，可用于布置花坛、花境，也可作切花。除虫菊还是一种古老的天然杀虫植物，由其花中分离萃取的具有杀虫活性的六种化合物(BSI命名为：除虫菊酯I、除虫菊酯II，瓜菊酯I、瓜菊酯II、茉莉菊酯I、茉莉菊酯II)统称为除虫菊酯。天然除虫菊酯见光慢慢分解成水和CO₂，因此，用其配制的农药或卫生杀虫剂等使用后无残留、对人畜无副作用，是迄今发现的不污染环境、对哺乳动物及植物无毒无害、对昆虫和蚊蝇等迅速击倒、不易产生抗药性的国际公认的最安全的无公害天然杀虫剂。
除虫菊作为目前世界上唯一集约化栽培的杀虫植物，已成为厄瓜多尔、肯尼亚等国的支柱产业；澳大利亚也在大力发展除虫菊产业。近年来，随着人类对自身健康及生存环境的不断关注，天然除虫菊酯产品虽然成本较高，但却供不应求。目前，天然除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，但其含量并不高，且由于近几年世界范围内除虫菊花市场供应短缺，造成其市场价格上扬，难以满足市场需求。因此，通过不同途径培育除虫菊酯含量高的除虫菊新品种，一直是该领域的研究热点。
以提高除虫菊酯含量为主要目标的除虫菊育种途径主要有传统育种方式和转基因途径。在过去的30年间，利用常规育种方法，例如三倍体或多倍体的诱导、杂种优势、杂交和无性系选择等，除虫菊酯的干重含量已有所提高，但含量仍然很低。传统的育种方法虽然取得了不少的成果，但存在着很大的局限性。而利用植物基因工程技术将目的基因定向导入植物细胞或组织中，培育成植株，则可获得人们预期的新品种，为花卉的定向育种提供技术支持。
在植物遗传转化中，高频再生系统是必不可少的，它是决定遗传转化成败的关键。所谓高频再生系统必须具有四个条件：1)外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力，而且最好是外植体能够直接分化出芽；2)芽的分化率达90％以上；3)易于离体培养，具有高度可重复性；4)体细胞无性系变异小。
国内对离体条件下除虫菊的研究多集中在其快速繁殖上。曾有报道除虫菊最适快繁培养基为MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤(或称为6-苄基腺嘌呤，简称6-BA)0.3mg/L+萘乙酸(NAA)0.2mg/L，其生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+吲哚乙酸(简称IAA，下同)0.2mg/L+ABT生根粉(中国林业科学院研制的植物生长调节剂，北京艾比蒂研发中心销售，参见：http://www.china-abt.cn/stencil/152/list_cn.asp？Client_ID＝720&Edition_ID＝1&mid＝4118)0.1mg/L；快繁培养基为MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+萘乙酸0.2-0.3mg/L，生根培养基为：MS基本培养基+萘乙酸0.3mg/L。也有一些研究了除虫菊愈伤组织的诱导，如诱导愈伤组织最佳培养基是MS基本培养基+激动素(6-糠氨基嘌呤，简称KT，下同)0.4mg/L+2，4-D 1.0mg/L；或是MS基本培养基+KT 1.6mg/L+2，4-D 2.0mg/L。
相比之下，国内外在除虫菊再生方面研究相对较少。国外有资料报道了几个除虫菊基因型诱导芽的培养基，典型的如LS基本培养基+赤霉素(GA₃)3.0mg/L+6-BA 1.0mg/L，或MS基本培养基+KT4.0mg/L+6-BA0.3mg/L+IAA0.01mg/L，但其再生频率较低，仅20-30％，且出芽时间长，需60-80d；或者有用花头、花瓣为外植体。但因材料有限、消毒复杂且取材时间受季节限制，不利于将该再生体系用于遗传转化的研究。因此建立适宜的除虫菊高频再生体系是其遗传转化成功的关键步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离体培养除虫菊的植株再生方法及其专用培养基，本发明简单易行，操作方便，外植体取材方便，再生植株的再生速度较快，再生频率高，可加快除虫菊的分子育种研究和开发。
本发明的技术方案如下：
一种离体培养除虫菊再生植株的方法，其步骤包括：
A、以除虫菊种子为离体培养的材料，先用70％酒精对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗2-3遍，再用0.1％升汞继续对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗3-4遍后，将灭过菌的除虫菊种子置于无菌滤纸上使之萌发培育成无菌苗；选取4个来自不同种子培育的除虫菊无菌苗接种于以MS基本培养基为成分的继代培养基上进行继代培养(每25-30天将培养无菌苗转移到新鲜的MS基本培养基上)；
B、在无菌条件下，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L的专用培养基上，先暗培养7天后再转入光照条件下培养15-30d，得到除虫菊再生芽；
C、将步骤B获得的除虫菊再生芽切下接种于只添加MS基本培养基的继代培养基上进行继代培养，直至得到完整的再生植株；
上述A、B、C各步骤所述的培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。
其中步骤C所述的继代培养基成分为MS基本培养基成分。
申请人发明了与上述培养方法配套的离体培养除虫菊再生植株的专用培养基，按mg/L计的组分及配比如下：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L，附加琼脂0.7％，蔗糖3％，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8。
与现有离体培养方法相比，本发明具有以下优点和效果：
本发明诱导除虫菊植株再生率30d分别达到92-96％。本发明的方法和培养基简便易行，再生速度快，再生周期短，再生率高，外植体取材不受季节限制，一般约15-30d即可获得再生芽。
附图说明
图1：除虫菊在不同培养基上不同培养阶段直接再生情况。图中：A-E：除虫菊叶片、叶柄在添加不同物质培养基上直接诱导不定芽的情况；A：MS基本培养基+玉米素(简称：ZT))+α-萘乙酸(简称：NAA)；B：MS基本培养基+ZT+IBA；C：MS基本培养基+噻重氮苯基脲(简称：TDZ)+IBA；D：MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L；E：MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L；图2：再生苗在继代培养基(即MS基本培养基)上的继代生长情况。
具体实施方案
实施例1
A、以除虫菊的种子(除虫菊的种子云南省红河森菊生物有限责任公司提供，下同)为材料，先用70％酒精对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗2-3遍，再用0.1％升汞继续对除虫菊种子进行消毒，无菌水冲洗3-4遍后，将灭过菌的除虫菊的种子置于无菌滤纸上使之萌发培育成无菌苗；选取4个来自不同种子培育的除虫菊无菌苗接种于MS基本培养基(MS基本培养基，1962年配方，参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版，下同)为成分的继代培养基上进行继代培养；
B：在超净工作台上或无菌接种箱中，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基，附加ZT，(浓度分别设为0.0；2.0；4.0和8.0mg/L)+NAA(浓度分别设为0.0；0.2；0.4和0.8mg/L)；MS基本培养基，附加ZT(浓度分别设为0.0；2.0；4.0；8.0mg/L)+IBA(浓度分别设为0.0；0.2；0.4；0.8mg/L)，完全随机设计的专用培养基上，先在黑暗条件下培养7d后转入光照下条件下培养。
C：培养约15d后，可见到外植体在32个设计的培养基上均开始褐化，到30d时所培养的外植体全部褐化死亡，不能诱导除虫菊形成不定芽(见图1A，图1B)。
在上述A、B、C各步骤中的所有培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。
实施例2：
按照实施例1步骤A的方法得到除虫菊无菌苗，将该无菌苗每隔25-30天将其转移至继代培养基中继代培养(即用新鲜的继代培养基将所述的无菌苗定期转移到盛有继代培养基的试管或培养瓶。下同)。
B：在超净工作台上或无菌接种箱中，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基，附加噻重氮苯基脲(简称TDZ，试验浓度分别设为0.0；1.0；2.0mg/L)+3-吲哚丁酸(IBA)(浓度分别设为0.0；0.1；0.2mg/L)完全随机设计的专用培养基上，黑暗条件下培养7d后转入光照下培养。
C：培养约15d后，外植体在各培养基上均开始褐化，30d后全部褐化死亡，无不定芽的诱导(见图1C)。
上述A、B、C各步骤的所有培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。
实施例3：
A、按照实施例1步骤A的方法得到除虫菊无菌苗，将该材料在MS基本培养基中继代培养。
B、在超净工作台上或无菌接种箱中，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+AgNO₃(试验浓度分别设为0.0；1.0；2.0；4.0；8.0mg/L)的专用培养基上，黑暗条件下培养7d后转入光照下培养。
C：培养约15d后，在各培养基上开始有芽形成，当AgNO₃为2.0mg/L时再生率显著高于其它浓度，其中叶片再生率达80％，叶柄为20％。
D：将再生芽切取下来置在MS基本培养基中继代培养，直到获得完整的除虫菊再生植株(见图2)。
上述A、B、C、D各步骤的所有培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。
实施例4：
A、按照实施例1步骤A的方法得到除虫菊无菌苗，将无菌苗在继代培养基中继代培养(继代培养的程序和培养基参照前面的实施例)。
B、在超净工作台上或无菌接种箱中，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L的专用培养基上，先在黑暗条件下培养7d后再转入光照下培养。
C：培养约15d后，在MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L的再生培养基上开始有再生芽的形成，30d后各单株的不定芽诱导率(或称之为再生率)分别为91％、30％、0％、12％。
D：将步骤C的再生芽切取下来，置于MS基本培养基(不添加激素)中继代培养，直至获得完整的除虫菊再生植株(见图2)。
上述A、B、C、D各步骤的所有培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。
实施例5：
A、按照实施例1步骤A的方法得到除虫菊无菌苗，将该无菌苗在继代培养基上进行继代培养(培养程序及继代培养基参见前面的实施例)。
B、在超净工作台上或无菌接种箱中，以A步骤的4个单株的除虫菊无菌苗为材料继代培养30d后，切取顶端幼嫩的叶片作为外植体，将其中脉用解剖刀划两刀后近轴面朝上接种于MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L；或MS基本培养基+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.15mg/L+AgNO₃2.0mg/L；MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+AgNO₃2.0mg/L；MS基本培养基+6-BA 2.5mg/L+IBA 0.25mg/L+AgNO₃2.0mg/L 4种专用培养基上，先在黑暗条件下培养7d后转入光照下培养。
C、培养约15d后，在上述4种培养基上均开始有不定芽形成，30d后不定芽的诱导率分别为18％、92％、96％、94％(见图1D，图1E)。
D、将步骤C的再生芽切取下来，在MS基本培养基(不添加激素)中继代培养，直到获得完整的除虫菊再生植株(见图2)。
上述A、B、C、D各步骤的所有培养基均添加0.7％琼脂和3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8后于121℃高压蒸汽灭菌20min，将所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为16h/d、光照强度(简称光强，下同)为1200lux的条件下培养。