一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法.pdf

本发明一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法属于生物技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种SCN5A突变体、含有该突变体的质粒、包含该质粒的细胞、突变蛋白及检测该突变的方法。本发明公开了一种SCN5A突变，位于外显子20、心脏钠通道蛋白1180位A变为了V，该突变是扩张性心脏病的致病原因。本发明为扩张型心肌病的早期诊断及新的治疗方案提供了一种新方法。

1.  一种心脏钠通道基因SCN5A的新的突变体，其特征在于，如序列表Seq ID No.59的外显子20(Exon20)的128位的g突变为a。

2.  一种含有根据权利要求1所述的突变基因的载体。

3.  一种包含根据权利要求2所述的载体的人胚肾293细胞(HEK293细胞)。

4.  一种心脏钠通道蛋白突变体，其特征在于，心脏钠通道蛋白SCN5A的1180位的氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。

5.  一种检测根据权利要求1所述的心脏钠通道SCN5A基因突变的方法，包括抽取外周静脉血并提取白细胞DNA，其特征在于还包括如下步骤：(1)用序列表Seq.ID NO.37和38作引物、PCR扩增模板DNA；(2)纯化PCR产物；和(3)按照本领域普通技术人员公知的技术进行测序，测序结果和Seq ID NO.59比对，确认本发明的突变。

一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体属于一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法。
背景技术
扩张型心肌病是最常见的心肌病之一，以心室腔扩大、心肌收缩功能下降而左心室壁厚度正常为主要特征，是心力衰竭的第三位原因，是心脏移植的第一位原因。可由冠心病、心肌炎及系统性疾病引起，但也可为原发性。原发性扩张型心肌病的发病率约40/10万人，其发病的细胞及分子机制尚不明确。约有30％的病例表现为家族性，提示遗传因素在其发病中的重要地位。
对于扩张型心肌病，目前尚缺乏有效的早期诊断和治疗方法。未行心脏移植的患者中约有50％在诊断扩张型心肌病后5年内死亡，虽然血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂等药物及植入型心律转复除颤器等治疗手段的出现可能会延长该病患者的生存期，但迄今扩张型心肌病仍是一种死亡率较高的疾病。
心脏钠通道基因(SCN5A)位于染色体3p21，其野生型基因组序列已经发表，包括28个外显子，编码2016个氨基酸的心肌钠通道蛋白，与心肌细胞动作电位的快速去极化有关，既往发现SCN5A突变可致多种心律失常，如长QT综合征，Brugada综合征及心脏传导障碍等。
发明内容
本发明的构思是这样的：首次公开一个中国人群中导致扩张型心肌病的心脏钠通道基因(SCN5A)的新突变体，以便开发出对扩张型心肌病的早期诊断方法和新的治疗方法。
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种心脏钠通道基因SCN5A的新的突变体。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脏钠通道基因SCN5A新突变体的方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种新的心脏钠通道SCN5的新的突变蛋白。
因而，本发明的技术方案是这样的：
本发明提供了一种心脏钠通道基因SCN5A的新的突变体，其特征在于，如序列表Seq IDNo.59的外显子20(Exon20)的128位的g突变为a。基于上述新突变体，相应地其互补序列则由c突变成了t。
本发明还提供了一种含有有上述突变体基因的载体。
本发明还提供了一种包含上述突变基因的人胚肾293细胞(HEK293细胞)。
本发明还提供了一种心脏钠通道蛋白突变体，其特征在于，心脏钠通道蛋白SCN5A的1180位的氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。
发明人经过大量的研究不仅发明了上述心脏钠通道SCN5A基因的新突变体，而且通过对该突变进行功能分析，揭示了突变型钠通道SCN5AA1180V改变了正常心肌细胞内钠通道电流的变化，从而引起心脏的结构改变，最终导致扩张型心肌病。
本发明还提供了一种检测心脏钠通道SCN5A基因突变的方法，包括抽取外周静脉血并提取白细胞DNA，其特征在于，(1)用序列表Seq.ID NO.37和38作引物、PCR扩增模板DNA；(2)纯化PCR产物；和(3)按照本领域普通技术人员公知的技术进行测序，测序结果和SeqID NO.59比对，确认本发明的突变。
发明人通过大量的实验证明，SCN5A基因A1180V突变是导致扩张型心肌病的致病基因突变位点，因此，可制备相关的基因芯片或基因探测子等试剂盒，来早期诊断扩张型心肌病，并选择作用于钠通道的药物来治疗这种类型的扩张型心肌病，有望延长该病患者的生存期和改善生活质量。
本发明为扩张型心肌病的早期诊断及新的治疗方案提供了一种新方法。
附图说明
图1系SCN5A测序结果示1个新的杂合突变(C→T)，其位于Exon20，碱基的变异造成了编码氨基酸的改变，在1180位置丙氨酸由缬氨酸代替(A1180V)。II-1，家系患病成员之一；WT，正常人。
图2系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的电流-电压(I-V)关系比较。
图3系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的激活期达峰时间比较。
图4野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的激活期和失活期的Boltzmann分布曲线。半激活期的电压及斜率：WT-35.5±1.4mV和5.6±0.4(n＝13)；A1180V-34.1±1.8mV和5.8±0.3(n＝15)。半失活期的电压及斜率：WT-78.7±1.3mV和-5.3±0.2(n＝26)；A1180V-83.1±1.6mV和-5.4±0.3(n＝31)。*，WT和A1180V的半失活期的电压差别有统计学意义。
图5系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的延迟时间常数-电压曲线。
图6野生型(WT)和突变型(A1180V)通道在去极化脉冲250ms的迟发电流比较。突变型通道没有完全失活，而是存在轻度增加的迟发电流；*，p＜0.05。
图7野生型(WT)和突变型(A1180V)通道失活后的恢复期比较。图A，突变型通道恢复更慢，在-120，-100和-80mV的电压下均如此；图B，恢复期时间常数和幅度；*，p＜0.05。
图8野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的速率依赖性变化比较。图A，连续30次去极化脉冲刺激后的钠电流变化，只标出了第1次和第30次的电流，重复刺激的脉冲速率为4Hz；图B，每次脉冲刺激后钠电流峰值的描记点；图C，重复刺激的脉冲速率和钠电流峰值变化的关系曲线，钠电流峰值的变化用第30次钠电流峰值和第1次钠电流峰值之比表示(I_30th/I_1st)；*，p＜0.05。
具体实施方式
以下结合具体实施方式进一步说明本发明，所有的实验条件及操作除有特殊说明外，按照本领域普通技术人员所公知的技术或者按照厂家提供的说明书进行。
实施例1扩张型心肌病家系中SCN5A基因的一个新突变A1180V
一、实验材料
1.抗凝剂10％EDTA.2K的配置：10g EDTA.2K加入100ml双蒸水中。
2.红细胞裂解液配方：2M Tris-HCl(PH 7.8)2.5ml，1M MgCl₂ 2.5ml，3M NaCl 1.6ml，加双蒸水至500ml。
3.白细胞裂解液配方：2M Tris-HCl(PH 8.0)0.25ml，0.4M EDTA(PH 8.0)1.25ml，10％SDS1.0ml，3M NaCl 0.85ml，加双蒸水至50ml。
4.2M Tris-HCl(PH 7.8)：称48.4g Tris溶解在200ml双蒸水中，浓盐酸调PH至7.8.
5.1M MgCl₂：41g MgCl₂加入200ml水中。
6.3M NaCl：35g NaCl加入200ml水中。
7.TE：10mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)配制。
8.Taq酶由上海生物工程技术服务公司提供。
9.PCR产物纯化试剂盒(上海生工)；DNA测序试剂盒(ABI公司)。
10.PCR仪：美国PTC-100型扩增仪。
11.测序仪：美国ABI377型测序仪。
二、实验过程
1患病家系临床资料与静脉血的收集：
中国山东一个伴进行性心脏传导障碍的扩张型心肌病家系，共调查该家系成员32人，其中与先证者有直系亲缘关系的成员24人。对家系成员仔细询问病史、体格检查、记录同步12导联心电图。对健在的家系成员均抽取外周静脉血5mL，加入0.3ml 10％EDTA.2K抗凝处理，反复摇匀后储存在4℃冰箱。
2血白细胞DNA的提取：
2.1将抗凝处理后的静脉血用离心机离心，转速1000转/分，离心5分钟，取上清放入1.5mlEP管，-70℃冻存。
2.2剩余血细胞先用红细胞裂解液裂解，离心机离心，转速4000转/分，离心5分钟，见白细胞沉淀，弃上清。
2.3再用20ml红细胞裂解液裂解残余红细胞，离心机离心，转速4000转/分，离心5分钟，见纯净的白细胞沉淀。
2.4弃上清，把沉淀的白细胞轻摇分散，逐滴加入5ml白细胞裂解液，60ml蛋白酶K(10mg/ml)，致终浓度200ng/ml，37℃振荡过夜。
2.5加等体积苯酚，轻摇10分钟，离心机离心，转速2500转/分，离心10分钟，吸上层水相，重复一次。
2.6加等体积氯仿-异丙醇混合液(20ml)，轻摇10分钟，离心机离心，转速2500转/分，离心10分钟，吸上层水相。
2.7加2.5倍体积的无水乙醇摇匀，得白色絮状DNA沉淀。用玻璃棒捞起DNA沉淀，用70％乙醇洗涤一次，真空干燥。
2.8DNA溶解于400-600mlTE中，-70℃冰箱保存。
3引物设计
运用Primer5.0软件设计覆盖候选基因编码区(包括外显子与内含子交界处)的引物。引物均由上海生物工程公司合成。PCR扩增片断长度均控制在300bp以内，对于较大的外显子，则将其分割为相互重叠的几个部分，分段进行设计。SCN5A引物序列如下表。



4PCR扩增
在PCR反应管中加入以下成分，总体系为20ul：
模版DNA(约30ng)   1ul
引物(2.5pM)       1ul
dNTPs(2.0mM)      0.5ul
MgCl₂(25mM)       1.5ul
10×PCR Buffer    2ul
ddH₂O             13.8ul
Taq酶             0.2ul
热循环条件为：
95℃       3min
×35cycles：
95℃       30s
50-55℃    30s
72℃       30s
72℃       10min
取产物2ul经1.5％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙啶)，紫外灯下观察扩增片段。
5PCR测序
5.1PCR产物的纯化采用上海生物工程公司的PCR产物纯化试剂盒进行。
5.2测序反应：
反应体系为5ul：
PCR产物          1ul
BigDye           1ul
Primer(2.5pM)    1ul
ddH2O            2ul
反应条件：
98℃        2min
×25cycles：
96℃        20s
60℃        4min
6SCN5A基因突变位点的检测
从家系中随机选取心脏传导障碍患者、正常人各2人进行SCN5A基因扫描，将测序结果在Traceviewer软件上进行图形辨读，通过峰型来判断同一位点上患者和正常人的基因型。发现突变位点后对其所有家系成员的该位点进行测序分析，同时筛查200例无血缘关系的正常人作为对照。
三、实验结果：
通过对该家系进行SCN5A全部编码区及周边区域的基因测序，发明人发现了1个新的杂合改变(C→T)，如图1，其位于Exon20。图中的碱基序列和Seq ID NO.59的100～1402位序列反向互补，突变发生在第128位：杂合突变(C→T)相应于序列表中该位点由g突变为a。碱基的变异造成了编码氨基酸的改变，在1180位置丙氨酸由缬氨酸代替(A1180V)。家系中有3人在进行性心脏传导障碍后发生心脏扩大及心功能不全，3人均存在SCN5A A1180V突变，而家系中年长未发病者和200例正常对照人群无此突变。
四、结论：
SCN5A基因A1180V突变是这个家系发生扩张型心肌病的病因，这是首次在中国人群发现的与扩张型心肌病有关的致病基因突变位点。
实施例2一个新发现的SCN5A突变A1180V的功能分析
一、实验材料
构建SCN5A正常序列质粒和A1180V突变序列质粒，人胚肾293细胞(HEK293细胞)可由商业购买。荧光显微镜、膜片钳、Axopatch-200B的放大器、pCLAMP v6.03采集软件等。
二、实验过程
1.SCN5A正常序列质粒扩增及突变序列质粒重组：利用构建的人类SCN5A正常序列质粒，根据实施例1筛选的致病基因突变序列，重组质粒，并经转化、扩增，分别得到SCN5A正常序列质粒及含有该突变序列的重组质粒。
2.野生型及突变型钠通道的蛋白表达和电生理检测：分别将野生型和A1180V突变型并携带绿色发光蛋白基因的质粒转入稳定表达SCN5A的HEK293细胞，转染后48-64个小时开始实验。用Western Blotting方法检测膜蛋白的表达；在荧光显微镜下选取绿色发光细胞行全细胞钳制，进行电生理检测，记录钠电流，描记电流-电压关系曲线、稳态失活曲线、失活后恢复曲线。如果没有特别说明，所有的膜片钳记录都是在室温22℃，保持电位-120mV的背景下进行的。细胞外液的主要成分(mM)：NaCl 140，KCl 4，CaCl₂ 1.8，MgCl₂ 0.75，Hepes5(pH 7.2)；细胞内液的主要成分(mM)：CsF 120，CsCl 20，EGTA 5 and Hepes 5(pH 7.4)。用Axopatch-200B的放大器和pCLAMP v6.03采集软件记录钠电流；根据Boltzmann函数A/(1+exp(-k(V-V_1/2)))计算激活期和失活期的电压；根据函数Af exp(-t/τf)+Asexp(-t/τs)+C计算失活期和失活后恢复期的时间曲线。
3.数据统计：t检验比较两组数据，多组数据用单因素方差分析后再用Student-Newman-Keuls post hoc检验，p＜0.05被认为有统计学意义。
三、实验结果
电生理检测表明，突变型和野生型通道具有相同的电流-电压关系曲线(图2)，从电压依赖和时间曲线来看，突变型通道没有明显改变激活期的电生理特点(图3)。但是，突变型通道改变了稳态失活期的电流-电压关系，与野生型相比，有一个-4.5mV的位移(图4)，不过对电流延迟的时间曲线来说影响很小(图5)；此外，突变型通道在去极化脉冲250ms末没有完全失活，而是存在轻度增加的迟发电流(图6)；失活后的恢复期也有差异，突变型通道恢复更慢，在-120，-100和-80mV的电压下均如此(图7)，而且更慢的恢复期会导致突变型通道在受到重复去极化脉冲的刺激下出现钠电流的中度减少，减少的电流取决于重复刺激的速率，速率越大电流减少越多(图8)。
四、结论
A1180V突变型钠通道与野生型钠通道相比有表型变化，改变了钠通道的失活和恢复期，A1180V突变本身通过干扰钠内流影响细胞内钠稳态从而引起心脏的结构改变，最终导致扩张型心肌病。
实施例3检测心脏钠通道SCN5A突变体A1180V
1抽取外周静脉血；
2血白细胞DNA的提取：
2.1将抗凝处理后的静脉血用离心机离心，转速1000转/分，离心5分钟，取上清放入1.5mlEP管，-70℃冻存。
2.2剩余血细胞先用红细胞裂解液裂解，离心机离心，转速4000转/分，离心5分钟，见白细胞沉淀，弃上清。
2.3再用20ml红细胞裂解液裂解残余红细胞，离心机离心，转速4000转/分，离心5分钟，见纯净的白细胞沉淀。
2.4弃上清，把沉淀的白细胞轻摇分散，逐滴加入5ml白细胞裂解液，60ml蛋白酶K(10mg/ml)，致终浓度200ng/ml，37℃振荡过夜。
2.5加等体积苯酚，轻摇10分钟，离心机离心，转速2500转/分，离心10分钟，吸上层水相，重复一次。
2.6加等体积氯仿-异丙醇混合液(20ml)，轻摇10分钟，离心机离心，转速2500转/分，离心10分钟，吸上层水相。
2.7加2.5倍体积的无水乙醇摇匀，得白色絮状DNA沉淀。用玻璃棒捞起DNA沉淀，用70％乙醇洗涤一次，真空干燥。
2.8DNA溶解于400-600mlTE中，-70℃冰箱保存。
3引物设计
运用Primer5.0软件设计覆盖候选基因编码区(包括外显子与内含子交界处)的引物。PCR扩增片断长度均控制在300bp以内。引物序列如下表。

4PCR扩增
在PCR反应管中加入以下成分，总体系为20ul：
模版DNA(约30ng)   1ul
引物(2.5pM)       1ul
dNTPs(2.0mM)      0.5ul
MgCl₂(25mM)       1.5ul
10×PCR Buffer    2ul
ddH₂O             13.8ul
Taq酶             0.2ul
热循环条件为：
95℃       3min
×35cycles：
95℃       30s
50-55℃    30s
72℃       30s
72℃       10min
取产物2ul经1.5％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙啶)，紫外灯下观察扩增片段。
5PCR测序
5.1PCR产物的纯化采用上海生物工程公司的PCR产物纯化试剂盒进行。
5.2测序反应：
反应体系为5ul：
PCR产物          1ul
BigDye           1ul
Primer(2.5pM)    1ul
ddH2O            2ul
反应条件：
98℃        2min
×25cycles：
96℃        20s
60℃        4min
6SCN5A基因突变位点的检测
将测序结果在Traceviewer软件上进行图形辨读，通过峰型来判断发明突变体的突变，有如图1中II-1那样的位点突变。
序列表
<110>复旦大学附属中山医院
<120>一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法
<130>memo
<160>60
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<210>29
<211>20
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<213>Artificial
<220>
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<211>20
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<213>Artificial
<220>
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<213>Artificial
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<211>20
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<211>20
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<220>
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<400>44
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<211>20
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<220>
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<400>45
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<211>20
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<220>
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<211>20
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<220>
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<210>48
<211>20
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<213>Artificial
<220>
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<400>48
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<210>49
<211>20
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<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>49
aggctgggac ctctcttcat                                                 20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>50
tgtggtgcag aatagggaca                                                 20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>51
cttctccgtc cagctgactt                                                 20
<210>52
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<213>Artificial
<220>
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<400>52
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<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<400>53
catggtgaaa aaggctgctt                                                20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>54
agaagttcat ggcagccaac                                                20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>55
tgggctcgta ggagatcttg                                                20
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>56
cctactgcga ccccactct                                                 19
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>57
gagagccatt gctgttgg                                                  18
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>58
agtgatgctg gctggaagac                                               20
<210>59
<211>155
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>59
cagcgctcca ctgctgagta ggatcatgaa gatgatgaat gtctcgaacc agctgtgctc   60
cacgatgtgg tagcaggtct tgcgcaaccg ccaccagacc ttccctgggg cctgtgtggt  120
gtccaccgca cagcagggac agcgccggac acagc                             155
<210>60
<211>2016
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>60
Met Ala Asn Phe Leu Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Phe Arg Arg Phe
1               5                   10                  15
Thr Arg Glu Ser Leu Ala Ala Ile Glu Lys Arg Met Ala Glu Lys Gln
            20                  25                  30
Ala Arg Gly Ser Thr Thr Leu Gln Glu Ser Arg Glu Gly Leu Pro Glu
        35                  40                  45
Glu Glu Ala Pro Arg Pro Gln Leu Asp Leu Gln Ala Ser Lys Lys Leu
    50                  55                  60
Pro Asp Leu Tyr Gly Asn Pro Pro Gln Glu Leu Ile Gly Glu Pro Leu
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Asp Pro Phe Tyr Ser Thr Gln Lys Thr Phe Ile Val Leu
                85                  90                  95
Asn Lys Gly Lys Thr Ile Phe Arg Phe Ser Ala Thr Asn Ala Leu Tyr
            100                 105                 110
Val Leu Ser Pro Phe His Pro Ile Arg Arg Ala Ala Val Lys Ile Leu
        115                 120                 125
Val His Ser Leu Phe Asn Met Leu Ile Met Cys Thr Ile Leu Thr Asn
    130                 135                 140
Cys Val Phe Met Ala Gln His Asp Pro Pro Pro Trp Thr Lys Tyr Val
145                 150                 155                 160
Glu Tyr Thr Phe Thr Ala Ile Tyr Thr Phe Glu Ser Leu Val Lys Ile
                165                 170                 175
Leu Ala Arg Gly Phe Cys Leu His Ala Phe Thr Phe Leu Arg Asp Pro
            180                 185                 190
Trp Asn Trp Leu Asp Phe Ser Val Ile Ile Met Ala Tyr Thr Thr Glu
        195                 200                 205
Phe Val Asp Leu Gly Asn Val Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Leu
    210                 215                 220
Arg Ala Leu Lys Thr Ile Ser Val Ile Ser Gly Leu Lys Thr Ile Val
225                 230                 235                 240
Gly Ala Leu Ile Gln Ser Val Lys Lys Leu Ala Asp Val Met Val Leu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Cys Leu Ser Val Phe Ala Leu Ile Gly Leu Gln Leu Phe
            260                 265                 270
Met Gly Asn Leu Arg His Lys Cys Val Arg Asn Phe Thr Ala Leu Asn
        275                 280                 285
Gly Thr Asn Gly Ser Val Glu Ala Asp Gly Leu Val Trp Glu Ser Leu
    290                 295                 300
Asp Leu Tyr Leu Ser Asp Pro Glu Asn Tyr Leu Leu Lys Asn Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ser Asp Val Leu Leu Cys Gly Asn Ser Ser Asp Ala Gly Thr Cys Pro
                325                 330                 335
Glu Gly Tyr Arg Cys Leu Lys Ala Gly Glu Asn Pro Asp His Gly Tyr
            340                 345                 350
Thr Ser Phe Asp Ser Phe Ala Trp Ala Phe Leu Ala Leu Phe Arg Leu
        355                 360                 365
Met Thr Gln Asp Cys Trp Glu Arg Leu Tyr Gln Gln Thr Leu Arg Ser
    370                 375                 380
Ala Gly Lys Ile Tyr Met Ile Phe Phe Met Leu Val Ile Phe Leu Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Tyr Leu Val Asn Leu Ile Leu Ala Val Val Ala Met Ala Tyr
                405                 410                 415
Glu Glu Gln Asn Gln Ala Thr Ile Ala Glu Thr Glu Glu Lys Glu Lys
            420                 425                 430
Arg Phe Gln Glu Ala Met Glu Met Leu Lys Lys Glu His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
Thr Ile Arg Gly Val Asp Thr Val Ser Arg Ser Ser Leu Glu Met Ser
    450                 455                 460
Pro Leu Ala Pro Val Asn Ser His Glu Arg Arg Ser Lys Arg Arg Lys
465                 470                 475                 480
Arg Met Ser Ser Gly Thr Glu Glu Cys Gly Glu Asp Arg Leu Pro Lys
                485                 490                 495
Ser Asp Ser Glu Asp Gly Pro Arg Ala Met Asn His Leu Ser Leu Thr
            500                 505                 510
Arg Gly Leu Ser Arg Thr Ser Met Lys Pro Arg Ser Ser Arg Gly Ser
        515                 520                 525
Ile Phe Thr Phe Arg Arg Arg Asp Leu Gly Ser Glu Ala Asp Phe Ala
    530                 535                 540
Asp Asp Glu Asn Ser Thr Ala Gly Glu Ser Glu Ser His His Thr Ser
545                 550                 555                 560
Leu Leu Val Pro Trp Pro Leu Arg Arg Thr Ser Ala Gln Gly Gln Pro
                565                 570                 575
Ser Pro Gly Thr Ser Ala Pro Gly His Ala Leu His Gly Lys Lys Asn
            580                 585                 590
Ser Thr Val Asp Cys Asn Gly Val Val Ser Leu Leu Gly Ala Gly Asp
        595                 600                 605
Pro Glu Ala Thr Ser Pro Gly Ser His Leu Leu Arg Pro Val Met Leu
    610                 615                 620
Glu His Pro Pro Asp Thr Thr Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Gly Pro
625                 630                 635                 640
Gln Met Leu Thr Ser Gln Ala Pro Cys Val Asp Gly Phe Glu Glu Pro
                645                 650                 655
Gly Ala Arg Gln Arg Ala Leu Ser Ala Val Ser Val Leu Thr Ser Ala
            660                 665                 670
Leu Glu Glu Leu Glu Glu Ser Arg His Lys Cys Pro Pro Cys Trp Asn
        675                 680                 685
Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Ile Trp Glu Cys Cys Pro Leu Trp Met
    690                 695                 700
Ser Ile Lys Gln Gly Val Lys Leu Val Val Met Asp Pro Phe Thr Asp
705                 710                 715                 720
Leu Thr Ile Thr Met Cys Ile Val Leu Asn Thr Leu Phe Met Ala Leu
                725                 730                 735
Glu His Tyr Asn Met Thr Ser Glu Phe Glu Glu Met Leu Gln Val Gly
            740                 745                 750
Asn Leu Val Phe Thr Gly Ile Phe Thr Ala Glu Met Thr Phe Lys Ile
        755                 760                 765
Ile Ala Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Phe Gln Gln Gly Trp Asn Ile Phe
    770                 775                 780
Asp Ser Ile Ile Val Ile Leu Ser Leu Met Glu Leu Gly Leu Ser Arg
785                 790                 795                 800
Met Ser Asn Leu Ser Val Leu Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe
                805                 810                 815
Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Thr Leu Ile Lys Ile Ile
            820                 825                 830
Gly Asn Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Ala Ile
        835                 840                 845
Ile Val Phe Ile Phe Ala Val Val Gly Met Gln Leu Phe Gly Lys Asn
    850                 855                 860
Tyr Ser Glu Leu Arg Asp Ser Asp Ser Gly Leu Leu Pro Arg Trp His
865                 870                 875                 880
Met Met Asp Phe Phe His Ala Phe Leu Ile Ile Phe Arg Ile Leu Cys
                885                 890                 895
Gly Glu Trp Ile Glu Thr Met Trp Asp Cys Met Glu Val Ser Gly Gln
            900                 905                 910
Ser Leu Cys Leu Leu Val Phe Leu Leu Val Met Val Ile Gly Asn Leu
        915                 920                 925
Val Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ser Phe Ser Ala
    930                 935                 940
Asp Asn Leu Thr Ala Pro Asp Glu Asp Arg Glu Met Asn Asn Leu Gln
945                 950                 955                 960
Leu Ala Leu Ala Arg Ile Gln Arg Gly Leu Arg Phe Val Lys Arg Thr
                965                 970                 975
Thr Trp Asp Phe Cys Cys Gly Leu Leu Arg Gln Arg Pro Gln Lys Pro
            980                 985                 990
Ala Ala Leu Ala Ala Gln Gly Gln Leu Pro Ser Cys Ile Ala Thr Pro
        995                 1000                1005
Tyr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Glu Lys Val Pro Pro Thr Arg
    1010                1015                1020
Lys Glu Thr Arg Phe Glu Glu Gly Glu Gln Pro Gly Gln Gly Thr
    1025                1030                1035
Pro Gly Asp Pro Glu Pro Val Cys Val Pro Ile Ala Val Ala Glu
    1040                1045                1050
Ser Asp Thr Asp Asp Gln Glu Glu Asp Glu Glu Asn Ser Leu Gly
    1055                1060                1065
Thr Glu Glu Glu Ser Ser Lys Gln Gln Glu Ser Gln Pro Val Ser
    1070                1075                1080
Gly Gly Pro Glu Ala Pro Pro Asp Ser Arg Thr Trp Ser Gln Val
    1085                1090                1095
Ser Ala Thr Ala Ser Ser Glu Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala
    1100                1105                1110
Asp Trp Arg Gln Gln Trp Lys Ala Glu Pro Gln Ala Pro Gly Cys
    1115                1120                1125
Gly Glu Thr Pro Glu Asp Ser Cys Ser Glu Gly Ser Thr Ala Asp
    1130                1135                1140
Met Thr Asn Thr Ala Glu Leu Leu Glu Gln Ile Pro Asp Leu Gly
    1145                1150                1155
Gln Asp Val Lys Asp Pro Glu Asp Cys Phe Thr Glu Gly Cys Val
    1160                1165                1170
Arg Arg Cys Pro Cys Cys Ala Val Asp Thr Thr Gln Ala Pro Gly
    1175                1180                1185
Lys Val Trp Trp Arg Leu Arg Lys Thr Cys Tyr His Ile Val Glu
    1190                1195                1200
His Ser Trp Phe Glu Thr Phe Ile Ile Phe Met Ile Leu Leu Ser
    1205                1210                1215
Ser Gly Ala Leu Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Leu Glu Glu Arg Lys
    1220                1225                1230
Thr Ile Lys Val Leu Leu Glu Tyr Ala Asp Lys Met Phe Thr Tyr
    1235                1240                1245
Val Phe Val Leu Glu Met Leu Leu Lys Trp Val Ala Tyr Gly Phe
    1250                1255                1260
Lys Lys Tyr Phe Thr Asn Ala Trp Cys Trp Leu Asp Phe Leu Ile
    1265                1270                1275
Val Asp Val Ser Leu Val Ser Leu Val Ala Asn Thr Leu Gly Phe
    1280                1285                1290
Ala Glu Met Gly Pro Ile Lys Ser Leu Arg Thr Leu Arg Ala Leu
    1295                1300                1305
Arg Pro Leu Arg Ala Leu Ser Arg Phe Glu Gly Met Arg Val Val
    1310                1315                1320
Val Asn Ala Leu Val Gly Ala Ile Pro Ser Ile Met Asn Val Leu
    1325                1330                1335
Leu Val Cys Leu Ile Phe Trp Leu Ile Phe Ser Ile Met Gly Val
    1340                1345                1350
Asn Leu Phe Ala Gly Lys Phe Gly Arg Cys Ile Asn Gln Thr Glu
    1355                1360                1365
Gly Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Thr Ile Val Asn Asn Lys Ser Gln
    1370                1375                1380
Cys Glu Ser Leu Asn Leu Thr Gly Glu Leu Tyr Trp Thr Lys Val
    1385                1390                1395
Lys Val Asn Phe Asp Asn Val Gly Ala Gly Tyr Leu Ala Leu Leu
    1400                1405                1410
Gln Val Ala Thr Phe Lys Gly Trp Met Asp Ile Met Tyr Ala Ala
    1415                1420                1425
Val Asp Ser Arg Gly Tyr Glu Glu Gln Pro Gln Trp Glu Tyr Asn
    1430                1435                1440
Leu Tyr Met Tyr Ile Tyr Phe Val Ile Phe Ile Ile Phe Gly Ser
    1445                1450                1455
Phe Phe Thr Leu Asn Leu Phe Ile Gly Val Ile Ile Asp Asn Phe
    1460                1465                1470
Asn Gln Gln Lys Lys Lys Leu Gly Gly Gln Asp Ile Phe Met Thr
    1475                1480                1485
Glu Glu Gln Lys Lys Tyr Tyr Asn Ala Met Lys Lys Leu Gly Ser
    1490                1495                1500
Lys Lys Pro Gln Lys Pro Ile Pro Arg Pro Leu Asn Lys Tyr Gln
    1505                1510                1515
Gly Phe Ile Phe Asp Ile Val Thr Lys Gln Ala Phe Asp Val Thr
    1520                1525                1530
Ile Met Phe Leu Ile Cys Leu Asn Met Val Thr Met Met Val Glu
    1535                1540                1545
Thr Asp Asp Gln Ser Pro Glu Lys Ile Asn Ile Leu Ala Lys Ile
    1550                1555                1560
Asn Leu Leu Phe Val Ala Ile Phe Thr Gly Glu Cys Ile Val Lys
    1565                1570                1575
Leu Ala Ala Leu Arg His Tyr Tyr Phe Thr Asn Ser Trp Asn Ile
    1580                1585                1590
Phe Asp Phe Val Val Val Ile Leu Ser Ile Val Gly Thr Val Leu
    1595                1600                1605
Ser Asp Ile Ile Gln Lys Tyr Phe Phe Ser Pro Thr Leu Phe Arg
    1610                1615                1620
Val Ile Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg Leu Ile Arg
    1625                1630                1635
Gly Ala Lys Gly Ile Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser
    1640                1645                1650
Leu Pro Ala Leu Phe Asn Ile Gly Leu Leu Leu Phe Leu Val Met
    1655                1660                1665
Phe Ile Tyr Ser Ile Phe Gly Met Ala Asn Phe Ala Tyr Val Lys
    1670                1675                1680
Trp Glu Ala Gly Ile Asp Asp Met Phe Asn Phe Gln Thr Phe Ala
    1685                1690                1695
Asn Ser Met Leu Cys Leu Phe Gln Ile Thr Thr Ser Ala Gly Trp
    1700                1705                1710
Asp Gly Leu Leu Ser Pro Ile Leu Asn Thr Gly Pro Pro Tyr Cys
    1715                1720                1725
Asp Pro Thr Leu Pro Asn Ser Asn Gly Ser Arg Gly Asp Cys Gly
    1730                1735                1740
Ser Pro Ala Val Gly Ile Leu Phe Phe Thr Thr Tyr Ile Ile Ile
    1745                1750                1755
Ser Phe Leu Ile Val Val Asn Met Tyr Ile Ala Ile Ile Leu Glu
    1760                1765                1770
Asn Phe Ser Val Ala Thr Glu Glu Ser Thr Glu Pro Leu Ser Glu
    1775                1780                1785
Asp Asp Phe Asp Met Phe Tyr Glu Ile Trp Glu Lys Phe Asp Pro
    1790                1795                1800
Glu Ala Thr Gln Phe Ile Glu Tyr Ser Val Leu Ser Asp Phe Ala
    1805                1810                1815
Asp Ala Leu Ser Glu Pro Leu Arg Ile Ala Lys Pro Asn Gln Ile
    1820                1825                1830
Ser Leu Ile Asn Met Asp Leu Pro Met Val Ser Gly Asp Arg Ile
    1835                1840                1845
His Cys Met Asp Ile Leu Phe Ala Phe Thr Lys Arg Val Leu Gly
    1850                1855                1860
Glu Ser Gly Glu Met Asp Ala Leu Lys Ile Gln Met Glu Glu Lys
    1865                1870                1875
Phe Met Ala Ala Asn Pro Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Pro Ile Thr
    1880                1885                1890
Thr Thr Leu Arg Arg Lys His Glu Glu Val Ser Ala Met Val Ile
    1895                1900                1905
Gln Arg Ala Phe Arg Arg His Leu Leu Gln Arg Ser Leu Lys His
    1910                1915                1920
Ala Ser Phe Leu Phe Arg Gln Gln Ala Gly Ser Gly Leu Ser Glu
    1925                1930                1935
Glu Asp Ala Pro Glu Arg Glu Gly Leu Ile Ala Tyr Val Met Ser
    1940                1945                1950
Glu Asn Phe Ser Arg Pro Leu Gly Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ile
    1955                1960                1965
Ser Ser Thr Ser Phe Pro Pro Ser Tyr Asp Ser Val Thr Arg Ala
    1970                1975                1980
Thr Ser Asp Asn Leu Gln Val Arg Gly Ser Asp Tyr Ser His Ser
    1985                1990                1995
Glu Asp Leu Ala Asp Phe Pro Pro Ser Pro Asp Arg Asp Arg Glu
    2000                2005                2010
Ser Ile Val
    2015